Биотинилирование
 | Эта статья нуждается в дополнительных цитатах для проверки . ( декабрь 2009 г. ) |
В биохимии биотинилирование . — это процесс ковалентного присоединения биотина к белку, нуклеиновой кислоте или другой молекуле Биотинилирование происходит быстро, специфично и вряд ли нарушит естественную функцию молекулы из-за небольшого размера биотина (ММ = 244,31 г/моль). Биотин связывается со стрептавидином и авидином с чрезвычайно высоким сродством, быстрой скоростью и высокой специфичностью, и эти взаимодействия используются во многих областях биотехнологии для выделения представляющих интерес биотинилированных молекул. Связывание биотина со стрептавидином и авидином устойчиво к экстремальным температурам, pH и протеолизу, что делает захват биотинилированных молекул возможным в самых разных средах. Кроме того, несколько молекул биотина могут быть конъюгированы с интересующим белком, что позволяет связывать несколько белковых молекул стрептавидина , авидина или нейтравидина и повышает чувствительность обнаружения интересующего белка. Существует большое количество реагентов для биотинилирования, в которых используется широкий спектр возможных методов мечения. Из-за сильного сродства между биотином и стрептавидином очистка биотинилированных белков стала широко используемым подходом для идентификации белок-белковых взаимодействий и посттрансляционных событий, таких как убиквитилирование [ 1 ] в молекулярной биологии.
Методы маркировки
[ редактировать ]Белки могут быть биотинилированы химически или ферментативно. При химическом биотинилировании используются различные химические методы конъюгации для получения неспецифического биотинилирования аминов, карбоксилатов, сульфгидрилов и углеводов (например, NHS-сочетание дает биотинилирование любых первичных аминов в белке). Ферментативное биотинилирование приводит к биотинилированию определенного лизина в определенной последовательности бактериальной биотинлигазой. [ 2 ] Большинство химических реагентов биотинилирования состоят из реакционноспособной группы, присоединенной через линкер к боковой цепи валериановой кислоты биотина. Поскольку биотинсвязывающий карман в авидине/стрептавидине скрыт под поверхностью белка, желательны реагенты биотинилирования, обладающие более длинным линкером, поскольку они позволяют молекуле биотина, как только она прикрепится к своей мишени, быть более доступной для связывания авидина/стрептавидина. /Белок нейтравидин. Этот линкер также может обеспечивать растворимость реагентов биотинилирования; линкеры, включающие поли(этилен)гликоль (ПЭГ), могут сделать водонерастворимые реагенты растворимыми или повысить растворимость реагентов биотинилирования, которые в некоторой степени уже растворимы.
Ферментативное биотинилирование
[ редактировать ]В отличие от химических методов биотинилирования, ферментативное биотинилирование позволяет связывать биотин ровно с одним остатком, присутствующим в белке. Эта реакция биотинилирования также может дойти до завершения, что означает, что продукт образуется с высокой однородностью и может быть связан со стрептавидином в определенной ориентации, например, для мультимеров MHC . Ферментативное биотинилирование чаще всего осуществляется E. coli биотин-холофермент-синтетазой , также известной как биотинлигаза (BirA, P06709 ). [ 3 ] [ 4 ]
Наиболее распространенным способом воздействия на интересующий белок является слияние белка на его N-конце, С-конце или во внутренней петле с пептидом из 15 аминокислот ( GLNDIFEAQKIEWHE ), называемый AviTag или акцепторный пептид (AP). [ 5 ] После мечения белок затем инкубируется с BirA, позволяя биотинилированию происходить в присутствии биотина и АТФ. [ 5 ] Ферментативное биотинилирование можно проводить in vitro, но BirA также специфически реагирует со своим пептидом-мишенью внутри клеток млекопитающих и бактерий, а также на клеточной поверхности, в то время как другие клеточные белки не модифицируются. [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] Ферментативное биотинилирование также может происходить in vivo, обычно посредством совместной экспрессии белка, меченного Avitag, и BirA. [ 9 ]
Природным субстратом BirA является белок-карбоксил-носитель биотина (BCCP). Прежде чем были обнаружены более мелкие метки, необходимо было слить белок со всей BCCP, чтобы на него можно было нацелиться. [ 10 ] Белок, слитый с помощью BCCP, может распознаваться молекулами биотина in vivo и прикрепляться к нему. [ 11 ] До AviTag использовалось еще несколько небольших тегов, но AviTag на данный момент является наиболее эффективным. [ 4 ]
Биотинилирование первичного амина
[ редактировать ]Наиболее распространенными мишенями для модификации белковых молекул являются первичные аминогруппы, которые представлены в виде эпсилон-аминов боковой цепи лизина и N-концевых α-аминов. Амин-реактивные реагенты для биотинилирования можно разделить на две группы в зависимости от растворимости в воде .
Сложные эфиры N-гидроксисукцинимида (NHS) плохо растворяются в водных растворах . Для реакций в водном растворе их необходимо сначала растворить в органическом растворителе , а затем разбавить водной реакционной смесью. Наиболее часто используемыми для этой цели органическими растворителями являются диметилсульфоксид (ДМСО) и диметилформамид (ДМФ), которые в низких концентрациях совместимы с большинством белков. [ 12 ] Из-за гидрофобности NHS-эфиров реагенты для биотинилирования NHS также могут диффундировать через клеточную мембрану , а это означает, что они биотинилируют как внутренние, так и внешние компоненты клетки .
Эфиры сульфо-NHS более растворимы в воде, и их следует растворять в воде непосредственно перед использованием, поскольку они легко гидролизуются. Водорастворимость сульфо-NHS-эфиров обусловлена их сульфонатной группой в N-гидроксисукцинимидном кольце и исключает необходимость растворения реагента в органическом растворителе. Сульфо-NHS-эфиры биотина также могут использоваться в качестве реагентов для биотинилирования клеточной поверхности, поскольку они не проникают через клеточную мембрану .
Химические реакции сложных эфиров NHS- и сульфо-NHS по существу идентичны, поскольку они оба самопроизвольно реагируют с аминами с образованием амидной связи. Поскольку мишенью сложного эфира является депротонированный первичный амин, реакция протекает в основных условиях (рН выше 7). Гидролиз эфира NHS является основной конкурирующей реакцией, и скорость гидролиза увеличивается с увеличением pH . NHS- и сульфо-NHS-эфиры имеют период полураспада несколько часов при pH 7 и всего несколько минут при pH 9.
Существует некоторая гибкость в условиях конъюгирования NHS-эфиров с первичными аминами. Температура инкубации может варьироваться от 4 до 37 °C, значения pH в реакционной зоне — от 7 до 9, а время инкубации — от нескольких минут до 12 часов. Буферов, содержащих амины (такие как Трис или глицин ), следует избегать, поскольку они конкурируют с реакцией.
Сульфгидрильное биотинилирование
[ редактировать ]Альтернативой биотинилированию первичного амина является мечение сульфгидрильных групп биотином. Поскольку свободные сульфгидрильные группы менее распространены в большинстве белков по сравнению с первичными аминами, сульфгидрильное биотинилирование полезно, когда первичные амины расположены в регуляторном домене(ах) целевого белка или когда требуется пониженный уровень биотинилирования. Сульфгидриль-реакционноспособные группы, такие как малеимиды , галогенацетилы и пиридилдисульфиды, требуют для конъюгации свободных сульфгидрильных групп; дисульфидные связи необходимо сначала восстановить, чтобы освободить сульфгидрильные группы для биотинилирования. Если свободных сульфгидрильных групп нет, лизины можно модифицировать с помощью различных тиолирующих реагентов ( реагент Траута , SAT(PEG4), SATA и SATP), что приводит к добавлению свободного сульфгидрила. Биотинилирование сульфгидрила проводят при несколько более низком pH (6,5-7,5), чем мечение эфирами NHS.
Помимо целых белков, биотинилированные пептиды могут быть синтезированы путем введения остатка цистеина (Cys) во время синтеза на конце аминокислотной цепи для получения сайт-специфического и ориентированного биотинилирования. Нуклеотиды также могут быть биотинилированы путем включения тиолированных нуклеотидов .
Карбоксильное биотинилирование
[ редактировать ]Карбоксильные группы находятся на С-концевых концах белков, а также на боковых цепях аминокислот глутамата и аспартата. Реагенты биотинилирования, нацеленные на карбоксильные группы, сами по себе не имеют карбоксильно-реактивного фрагмента, а вместо этого полагаются на карбодиимидный сшивающий агент, такой как EDC, для связывания первичного амина реагентов биотинилирования с карбоксильной группой целевого белка.
Биотинилирование по карбоксильным группам происходит при pH 4,5–5,5. Чтобы предотвратить перекрестную реакцию сшивающего агента с компонентами буфера, буферы не должны содержать первичные амины (например, трис , глицин ) или карбоксилы (например, ацетат , цитрат ); Буфер MES — идеальный выбор.
Биотинилирование гликопротеинов
[ редактировать ]Гликопротеины можно биотинилировать путем модификации углеводных остатков до альдегидов , которые затем реагируют с реагентами биотинилирования на основе гидразина или алкоксиамина. Периодат натрия окисляет сиаловые кислоты гликопротеинов до альдегидов с образованием этих стабильных связей при pH 4–6.
Поликлональные антитела сильно гликозилированы, и поскольку гликозилирование не влияет на активность антител, биотинилирование гликозиловых групп является идеальной стратегией для получения биотинилированных антител.
Биотинилирование олигонуклеотидов
[ редактировать ]Олигонуклеотиды легко биотинилируются в ходе синтеза олигонуклеотидов фосфорамидитным методом с использованием коммерческого биотинфосфорамидита. [ 13 ] После стандартного снятия защиты полученные конъюгаты можно очистить с помощью обращенно-фазовой или анионообменной ВЭЖХ.
Неспецифическое биотинилирование
[ редактировать ]Фотоактивируемые реагенты для биотинилирования идеальны, когда первичные амины, сульфгидрилы, карбоксилы и углеводы недоступны для мечения. Эти реагенты основаны на арилазидах, которые активируются ультрафиолетовым светом (УФ; >350 нм), которые затем реагируют по связям CH и NH. Поскольку эти типы связей возникают независимо от типа аминокислоты, этот тип биотинилирования называется «неспецифическим».
Фотоактивируемые реагенты биотинилирования также можно использовать для активации биотинилирования в определенное время эксперимента или в определенных условиях реакции, просто подвергая реакцию воздействию УФ-света в определенное время или при определенных условиях.
Цель
[ редактировать ]Очистка
[ редактировать ]Биотиновую метку можно использовать в аффинной хроматографии вместе с колонкой, связанной с авидином (или стрептавидином , или нейтравидином ), который является естественным лигандом биотина. Однако для разрушения взаимодействия авидин/стрептавидин-биотин необходимы жесткие условия (например, 6 М GuHCl при pH 1,5), что, скорее всего, приведет к денатурации белка, несущего биотиновую метку. Если необходимо выделение меченого белка, лучше пометить его иминобиотином . Этот аналог биотина обеспечивает прочное связывание авидина/стрептавидина при щелочном pH, но сродство снижается при понижении pH. Следовательно, функциональный белок, меченный иминобиотином, может быть высвобожден из колонки с авидином/стрептавидином путем снижения pH (примерно до pH 4). [ 14 ] [ 15 ]
Обнаружение
[ редактировать ]Эту метку также можно использовать для обнаружения белка с помощью антител против биотина или стратегий обнаружения, меченных авидином/стрептавидином, таких как ферментные репортеры (например, пероксидаза хрена , щелочная фосфатаза ) или флуоресцентные зонды . Это может быть полезно при локализации с помощью флуоресцентной или электронной микроскопии. [ 16 ] Анализы ELISA , анализы ELISPOT , вестерн-блоттинг и другие иммуноаналитические методы. Обнаружение с помощью моновалентного стрептавидина позволяет избежать кластеризации или агрегации биотинилированной мишени. [ 17 ]
Другое использование
[ редактировать ]Нековалентная связь, образующаяся между биотином и авидином или стрептавидином, имеет аффинность связывания, которая выше, чем у большинства связей антигена и антитела, и приближается к силе ковалентной связи . Такое очень прочное связывание делает мечение белков биотином полезным инструментом для таких применений, как аффинная хроматография с использованием иммобилизованного авидина или стрептавидина для отделения биотинилированного белка от смеси других белков и биохимических веществ. Биотинилированный белок, такой как биотинилированный бычий сывороточный альбумин (БСА), используется в твердофазных анализах в качестве покрытия на поверхности лунок в многолуночных планшетах для анализа. Биотинилирование эритроцитов использовалось как средство определения общего объема крови без использования радиоактивных меток, таких как хром 51, что позволяло определять объем у младенцев с низкой массой тела при рождении и беременных женщин, которые иначе не могли бы подвергнуться воздействию необходимых доз радиоактивности. Кроме того, биотинилирование молекул MHC с целью создания мультимеров MHC стало полезным инструментом для идентификации и выделения антигенспецифических Популяции Т-клеток . Совсем недавно биотинилирование белков in vivo было разработано для изучения межбелковых взаимодействий и близости в живых клетках. [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]
Определение степени биотинилирования
[ редактировать ]Условия реакции биотинилирования выбираются так, чтобы молекула-мишень (например, антитело) была помечена достаточным количеством молекул биотина для очистки или обнаружения молекулы, но не настолько, чтобы биотин мешал функции молекулы.
ДЛИНА анализ
[ редактировать ]Анализ HABA (2-(4-гидроксиазобензол)бензойной кислоты) можно использовать для определения степени биотинилирования. Краситель HABA связан с авидином или стрептавидином и дает характерную оптическую плотность. При введении биотинилированных белков или других молекул биотин вытесняет краситель, что приводит к изменению оптической плотности при 500 нм. Это изменение прямо пропорционально уровню биотина в образце. Недостатком анализа HABA является то, что для него используются большие объемы образца.
Стрептавидин гель-шифт
[ редактировать ]Степень биотинилирования также можно измерить с помощью сдвига стрептавидина в геле, поскольку стрептавидин остается связанным с биотином во время электрофореза в агарозном геле или электрофореза в полиакриламидном геле . Доля биотинилированной мишени может быть измерена по изменению интенсивности полосы мишени с избытком стрептавидина или без него, что можно быстро и количественно увидеть для биотинилированных белков с помощью Кумасси бриллиантовым синим . окрашивания [ 21 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Лектез, Бенуа; Миготти, Ребекка; Ли, Такой молодой; Рамирес, Хуанма; Бераза, Найара; Мэнсфилд, Билл; Сазерленд, Джеймс Д.; Мартинес-Шантар, Мария Л.; Диттмар, Гуннар (6 июня 2014 г.). «Профилирование убиквитина в печени с использованием трансгенной мыши с биотинилированным убиквитином». Журнал исследований протеома . 13 (6): 3016–3026. дои : 10.1021/pr5001913 . ISSN 1535-3893 . ПМИД 24730562 .
- ^ Барат, Бхасвати; Ву, Анна М. (2007). «Метаболическое биотинилирование рекомбинантных антител биотинлигазой, сохраняемой в эндоплазматическом ретикулуме» . Биомолекулярная инженерия . 24 (3): 283–91. doi : 10.1016/j.bioeng.2007.02.003 . ПМЦ 2682619 . ПМИД 17379573 .
- ^ Самолс, Д.; Торнтон, CG; Муртиф, В.Л.; Кумар, ГК; Хаазе, ФК; Вуд, ХГ (15 мая 1988 г.). «Эволюционная консервативность биотиновых ферментов» . Журнал биологической химии . 263 (14): 6461–6464. дои : 10.1016/S0021-9258(18)68661-2 . ISSN 0021-9258 . ПМИД 2896195 .
- ^ Перейти обратно: а б Фэрхед, М; Ховарт, М. (2015). «Сайт-специфическое биотинилирование очищенных белков с использованием BirA». Маркировка белков, специфичная для сайта . Методы молекулярной биологии. Том. 1266. стр. 171–84. дои : 10.1007/978-1-4939-2272-7_12 . ISBN 978-1-4939-2271-0 . ПМЦ 4304673 . ПМИД 25560075 .
- ^ Перейти обратно: а б Беккет, Дороти; Ковалева, Елена; Шац, Питер Дж. (1999). «Минимальный пептидный субстрат в биотинилировании биотин-голофермент-синтетазы, катализируемом» . Белковая наука . 8 (4): 921–9. дои : 10.1110/ps.8.4.921 . ПМК 2144313 . ПМИД 10211839 .
- ^ Де Бур, Э.; Родригес, П; Бонте, Э; Крийгсвельд, Дж; Кацантони, Э; Черт возьми, А; Гросвельд, Ф; Стробулис, Дж (2003). «Эффективное биотинилирование и одноэтапная очистка меченых факторов транскрипции в клетках млекопитающих и трансгенных мышах» . Труды Национальной академии наук . 100 (13): 7480–5. Бибкод : 2003PNAS..100.7480D . дои : 10.1073/pnas.1332608100 . ПМК 164612 . ПМИД 12802011 .
- ^ Вьенс, Антуан; Мехольд, Ундина; Лерманн, Хайке; Харель-Беллан, Анник; Огрызко, Василий (2004). «Использование биотинилирования белков in vivo для иммунопреципитации хроматина». Аналитическая биохимия . 325 (1): 68–76. дои : 10.1016/j.ab.2003.10.015 . ПМИД 14715286 .
- ^ Ховарт, Марк; Такао, Кейзо; Хаяси, Ясунори; Тинг, Алиса Ю. (2005). «Нацеливание квантовых точек на поверхностные белки в живых клетках с помощью биотинлигазы» . Труды Национальной академии наук . 102 (21): 7583–8. Бибкод : 2005PNAS..102.7583H . дои : 10.1073/pnas.0503125102 . JSTOR 3375578 . ПМК 1129026 . ПМИД 15897449 .
- ^ Калл, МГ; Шац, Пи Джей (1 января 2000 г.). «Биотинилирование белков in vivo и in vitro с использованием небольших пептидных меток». Применение химерных генов и гибридных белков. Часть A: Экспрессия генов и очистка белков . Методы энзимологии. Том. 326. стр. 430–440. дои : 10.1016/s0076-6879(00)26068-0 . ISBN 9780121822279 . ISSN 0076-6879 . ПМИД 11036656 .
- ^ Аргаранья, CE; Кунц, И.Д.; Биркен, С; Аксель, Р; Кантор, ЧР (1986). «Молекулярное клонирование и нуклеотидная последовательность гена стрептавидина» . Нуклеиновые кислоты Рез . 14 (4): 1871–82. дои : 10.1093/нар/14.4.1871 . ПМЦ 339579 . ПМИД 3951999 .
- ^ «Биотинирование белков in vivo» .
- ^ Браун, Питер (17 июля 2024 г.). «5-шаговое руководство по химическому биотинилированию / конъюгации биотина» . Решения LifeSynth . Проверено 24 июля 2024 г.
- ^ Пон, Ричард Т. (1991). «Длинноцепочечный биотинфосфорамидитный реагент для автоматического синтеза 5'-биотинилированных олигонуклеотидов». Буквы тетраэдра . 32 (14): 1715–8. дои : 10.1016/S0040-4039(00)74311-5 .
- ^ Хофманн, Клаус; Вуд, Сара В.; Бринтон, Чарльз К.; Монтибеллер, Джудит А.; Финн, Фрэнсис М. (1980). «Аффинные колонки с иминобиотином и их применение для поиска стрептавидина» . Труды Национальной академии наук . 77 (8): 4666–8. Бибкод : 1980PNAS...77.4666H . дои : 10.1073/pnas.77.8.4666 . JSTOR 9166 . ПМК 349906 . ПМИД 6933515 .
- ^ Сугавара, Кадзухару; Камия, Наото; Хирабаяши, Джордж; Курамиц, Хидеки (2005). «Вольтамперометрический анализ гомогенного связывания биотина без стадии разделения с использованием иминобиотина, меченного электроактивным соединением». Аналитические науки . 21 (8): 897–900. дои : 10.2116/analsci.21.897 . ПМИД 16122157 .
- ^ Вьенс, А.; Харпер, Ф.; Пишар, Э.; Комиссо, М.; Пьеррон, Г.; Огрызко, В. (2008). «Использование биотинилирования белков in vivo для иммуноэлектронной микроскопической локализации специфической изоформы белка» . Журнал гистохимии и цитохимии . 56 (10): 911–9. дои : 10.1369/jhc.2008.951624 . ПМК 2544619 . ПМИД 18574249 .
- ^ Ховарт, Марк; Чиннапен, Дэниел Дж. Ф.; Герроу, Кимберли; Доррестейн, Питер С; Гранди, Мелани Р.; Келлехер, Нил Л; Эль-Хусейни, Алаа; Тинг, Алиса Ю (2006). «Моновалентный стрептавидин с одним фемтомолярным сайтом связывания биотина» . Природные методы . 3 (4): 267–73. дои : 10.1038/nmeth861 . ПМК 2576293 . ПМИД 16554831 .
- ^ Фернандес-Суарес, Марта; Чен, Т. Скотт; Тинг, Алиса Ю. (2008). «Обнаружение межбелкового взаимодействия in vitro и в клетках методом бесконтактного биотинилирования» . Журнал Американского химического общества . 130 (29): 9251–3. дои : 10.1021/ja801445p . ПМК 2635094 . ПМИД 18582056 .
- ^ Кулясов, Арман; Шоаиб, Мухаммед; Пичугин, Андрей; Каннуш, Патрисия; Раманкулов, Ерлан; Липински, Марк; Огрызко, Василий (2011). «PUB-MS: метод масс-спектрометрии для мониторинга близости белков к белкам in vivo». Журнал исследований протеома . 10 (10): 4416–27. arXiv : 1108.5657 . дои : 10.1021/pr200189p . ПМИД 21842862 . S2CID 16887424 .
- ^ Шоаиб, М.; Кулясов А. ; Робин, К.; Винчура, К.; Тарлыков П. ; Деспа, Э.; Каннуш, П.; Раманкулов, Э.; Липински, М.; Огрызко, В. (2012). «PUB-NChIP — подход «биотинилирования in vivo» для изучения хроматина вблизи интересующего белка» . Геномные исследования . 23 (2): 331–40. дои : 10.1101/гр.134874.111 . ПМК 3561874 . ПМИД 23038767 .
- ^ Джайн, Дж.; Веджиани, Дж.; Ховарт, М. (2013). «Нагрузка холестерина и взаимодействие ультрастабильных белков определяют уровень опухолевого маркера, необходимый для оптимальной изоляции раковых клеток» . Исследования рака . 73 (7): 2310–21. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-12-2956 . ПМЦ 3618857 . ПМИД 23378340 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Хермансон, GT. Методы биоконъюгата. Академическая пресса ISBN 0-12-342336-8
- Обзор биотинилирования . Включает дополнительную информацию и данные о реакционноспособных группах, биотине и линкерных областях.
- Гао, Вэньцин; Ву, Зенгру; Бол, Кейси Э.; Ян, Цзюнь; Миллер, Дуэйн Д.; Далтон, Джеймс Т. (2005). «Характеристика метаболизма in vitro селективного модулятора андрогеновых рецепторов с использованием препаратов ферментов печени человека, крысы и собаки» . Метаболизм и распределение лекарств . 34 (2): 243–53. дои : 10.1124/dmd.105.007112 . ПМК 2039882 . ПМИД 16272404 .