Поликлональные антитела

Поликлональные антитела (pAbs) — это антитела , которые секретируются различными линиями В-клеток в организме (тогда как моноклональные антитела происходят из одной клеточной линии). Они представляют собой набор молекул иммуноглобулина , которые реагируют на определенный антиген , каждая из которых идентифицирует свой эпитоп .

Производство

Общая процедура получения поликлональных антител следующая:

антигена Препарат
адъювантов Выбор и приготовление
Выбор животных
Процесс инъекции
Экстракция сыворотки крови

Конъюгат антиген/адъювант вводят выбранному животному для инициации усиленного иммунного ответа. Ожидается, что после серии инъекций в течение определенного периода времени у животного выработаются антитела против конъюгата. Затем у животного извлекают кровь и затем очищают для получения интересующего антитела.

Инокуляцию проводят подходящему млекопитающему , такому как мышь, кролик или коза. Зачастую предпочтение отдается более крупным млекопитающим, поскольку количество сыворотки , которую можно собрать, больше. антиген Млекопитающему вводят . Это побуждает В- лимфоциты вырабатывать IgG иммуноглобулины , специфичные к антигену. Этот поликлональный IgG млекопитающих выделяют из сыворотки .

Напротив, моноклональные антитела происходят из одной клеточной линии.

Существует множество методологий производства поликлональных антител у лабораторных животных. Институциональные руководящие принципы, регулирующие использование животных, и процедуры, относящиеся к этим методологиям, обычно ориентированы на гуманные соображения и подходящее поведение при использовании адъювантов (агентов, которые изменяют действие других агентов, при этом оказывая незначительное или вообще не оказывающее никакого прямого эффекта, когда они назначаются сами по себе). Это включает в себя выбор адъюванта, пути и места введения, объемы инъекций на одно место и количество мест на животное. Институциональная политика обычно включает допустимые объемы крови на сбор и меры безопасности, включая соответствующие ограничения и седацию или анестезию животных для предотвращения травм животных или персонала.

Основной целью производства антител у лабораторных животных является получение с высоким титром и высокой аффинностью антисыворотки для использования в экспериментах или диагностических тестах. Адъюванты используются для улучшения или усиления иммунного ответа на антигены. Большинство адъювантов предусматривают место инъекции, депо антигена, которое обеспечивает медленное высвобождение антигена в дренирующие лимфатические узлы.

Многие адъюванты также содержат или действуют непосредственно как:

поверхностно-активные вещества, которые способствуют концентрации молекул белковых антигенов на большой площади поверхности, и
иммуностимулирующие молекулы или свойства. Адъюванты обычно используются с растворимыми белковыми антигенами для увеличения титров антител и индукции длительного ответа с сопутствующей памятью.

Такие антигены сами по себе обычно являются плохими иммуногенами. Большинство сложных белковых антигенов индуцируют множественные клоны В-клеток во время иммунного ответа, поэтому ответ является поликлональным. Иммунные ответы на небелковые антигены обычно слабые или усиливаются адъювантами, а системная память отсутствует.

В настоящее время антитела также производятся путем выделения В-лимфоцитов человека для производства специфических смесей рекомбинантных моноклональных антител. Биотехнологическая компания Symphogen разрабатывает антитела этого типа для терапевтического применения. Это первая исследовательская компания, которая достигла второй фазы испытаний смесей моноклональных антител, имитирующих разнообразие препаратов поликлональных антител. Это производство предотвращает передачу вирусов и прионов, и это простой процесс.

Выбор животных

Животные, часто используемые для производства поликлональных антител, включают кур, коз, морских свинок, хомяков, лошадей, мышей, крыс и овец. Однако кролик является наиболее часто используемым лабораторным животным для этой цели. Выбор животных должен основываться на:

необходимое количество антител,
отношения между донором антигена и реципиентом-продуцентом антител (как правило, чем более отдаленное филогенетическое родство, тем больше вероятность ответа антител с высоким титром) и
необходимые характеристики [например, класс, подкласс (изотип), природа связывания комплемента] антител, которые необходимо получить. Иммунизация и флеботомия связаны со стрессом, и, по крайней мере, при использовании кроликов и грызунов предпочтительны животные, свободные от специфических патогенов (SPF). Использование таких животных может значительно снизить заболеваемость и смертность от патогенных организмов, особенно Pasteurella multocida у кроликов.

Козы или лошади обычно используются, когда требуются большие количества антисыворотки. Многие исследователи отдают предпочтение курам из-за их филогенетической удаленности от млекопитающих. Куры переносят большое количество IgY (IgG) в яичный желток, а сбор антител из яиц устраняет необходимость в процедуре инвазивного кровотечения. Недельные яйца могут содержать в 10 раз больше антител, чем объем кроличьей крови, полученной при одном еженедельном кровотечении. Однако использование определенных куриных антител в иммуноанализах имеет некоторые недостатки. Куриный IgY не фиксирует компонент C1 комплемента млекопитающих и не действует как преципитирующее антитело при использовании стандартных растворов.

Хотя мышей чаще всего используют для производства моноклональных антител, их небольшой размер обычно не позволяет использовать их для получения достаточных количеств поликлональных сывороточных антител. Однако поликлональные антитела у мышей можно собрать из асцитной жидкости, используя любую из множества методик, вызывающих асцит.

При использовании кроликов для первичной иммунизации следует использовать молодых взрослых животных (2,5–3,0 кг или 5,5–6,5 фунтов) из-за сильного ответа антител. Пик иммунной функции приходится на период полового созревания , а первичная реакция на новые антигены снижается с возрастом. Обычно предпочтение отдается кроликам-самкам, поскольку они более послушны и, как сообщается, имеют более сильный иммунный ответ, чем самцы. При использовании беспородных животных следует использовать не менее двух животных на каждый антиген. Этот принцип снижает потенциальную полную неудачу, возникающую в результате нечувствительности к антигенам отдельных животных.

Препарат антигена

Размер, степень агрегации и относительная нативность белковых антигенов могут существенно влиять на качество и количество вырабатываемых антител. Небольшие полипептиды (<10 ку ) и небелковые антигены обычно необходимо конъюгировать или сшивать с более крупными иммуногенными белками-носителями для повышения иммуногенности и обеспечения эпитопов Т-клеток . Как правило, чем больше иммуногенный белок, тем лучше. Более крупные белки, даже в меньших количествах, обычно приводят к лучшему взаимодействию антигенпрезентирующих клеток, обрабатывающих антиген, для удовлетворительного иммунного ответа. Инъекции растворимых неагрегированных белков с большей вероятностью вызывают толерантность, чем удовлетворительный ответ антител.

Гемоцианин улитки улитки (KLH) и бычий сывороточный альбумин являются двумя широко используемыми белками-носителями. Поли-L-лизин также успешно используется в качестве основы для пептидов. Хотя использование поли-L-лизина снижает или устраняет выработку антител к чужеродным белкам, это может привести к сбою в выработке антител, индуцированной пептидами. В последнее время липосомы также успешно используются для доставки небольших пептидов, и этот метод является альтернативой доставке с помощью масляных эмульсионных адъювантов.

Количество антигена

Выбор количества антигена для иммунизации варьируется в зависимости от свойств антигена и выбранного адъюванта. В общем, для получения антител с высоким титром необходимы количества белка в адъюванте от микрограмма до миллиграмма. Дозировка антигена обычно зависит от вида, а не от массы тела. Так называемое «окно» иммуногенности у каждого вида широко, но слишком много или слишком мало антигена может вызвать толерантность, подавление или иммунное отклонение в сторону клеточного иммунитета, а не удовлетворительный гуморальный ответ. Сообщалось, что оптимальные и обычные уровни белкового антигена для иммунизации конкретных видов находятся в следующих диапазонах:

кролик – 50–1000 мкг;
мышь – 10–50 мкг;
морская свинка – 50–500 мкг; и
коза, 250–5000 мкг.

Сообщается, что оптимальные «начальные» дозы находятся на нижнем конце каждого диапазона.

Аффинность сывороточных антител увеличивается со временем (месяцы) после введения смесей антиген-адъювант и по мере поступления антигена в систему снижается. Широко используемые дозы антигена для «ревакцинации» или вторичной иммунизации обычно составляют половину от начальной дозы. Антигены не должны содержать побочных продуктов препаративной обработки и химикатов, таких как полиакриламидный гель, SDS, мочевина, эндотоксины, твердые частицы и крайние значения pH.

Пептидные антитела

Когда пептид используется для создания антитела, чрезвычайно важно правильно спроектировать антигены. Есть несколько ресурсов, которые могут помочь в проектировании, а также компаний, предлагающих эту услугу. набор общедоступных инструментов Expasy собрала на своей странице ProtScale , для навигации по которым требуется определенная степень знаний пользователя. В качестве более простого инструмента оценки пептидов доступен инструмент Antigen Profiler , который позволит вам оценивать отдельные пептидные последовательности на основе базы данных картирования родственных эпитопов предыдущих иммуногенов, использованных для создания антител. Наконец, как правило, пептиды должны соответствовать некоторым основным критериям.

При изучении пептидов для синтеза и иммунизации рекомендуется избегать использования определенных остатков и последовательностей из-за потенциальных проблем синтеза. Сюда входят некоторые из наиболее общих характеристик:

Чрезвычайно длинные повторы одной и той же аминокислоты (например, RRRR)
Дублеты серина (S), треонина (Т), аланина (А) и валина (V).
Окончание или начало последовательности пролином (P)
Глутамин (Q) или аспарагин (N) на n-конце
Пептиды с избыточной массой гидрофобных остатков (например, V, A, L, I и т. д.).

Реактивность

Исследователи должны также учитывать статус нативности белковых антигенов при использовании в качестве иммуногенов и реакцию с продуцируемыми антителами. Антитела к нативным белкам лучше всего реагируют с нативными белками, а антитела к денатурированным белкам лучше всего реагируют с денатурированными белками. Если высвобождаемые антитела необходимо использовать на мембранных блоттингах (белки, подвергнутые денатурирующим условиям), тогда следует создавать антитела против денатурированных белков. С другой стороны, если антитела должны использоваться для реакции с нативным белком или блокирования активного центра белка, то антитела следует создавать против нативного белка. Адъюванты часто могут изменить натуральность белка. масло в воде Как правило, абсорбированные белковые антигены в предварительно полученном адъюванте в виде эмульсии сохраняют большую нативную белковую структуру, чем антигены в эмульсиях вода в масле.

Асептика

Антигены всегда следует готовить с использованием методов, гарантирующих отсутствие микробного загрязнения. Большинство препаратов белковых антигенов можно стерилизовать, пропуская через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Септические абсцессы часто возникают в местах прививки животных при использовании контаминированных препаратов. Это может привести к неудачной иммунизации против целевого антигена.

Адъюванты

Существует множество коммерчески доступных иммунологических адъювантов . Выбор конкретных адъювантов или типов варьируется в зависимости от того, будут ли они использоваться для исследований и производства антител или для разработки вакцин. Адъюванты для использования в вакцинах должны производить только защитные антитела и хорошую системную память, тогда как адъюванты для производства антисыворотки должны быстро индуцировать антитела с высоким титром и высокой авидностью. Ни один адъювант не является идеальным для всех целей, и все они имеют преимущества и недостатки. Использование адъювантов обычно сопровождается нежелательными побочными эффектами различной степени тяжести и продолжительности. Исследования новых адъювантов сосредоточены на веществах, обладающих минимальной токсичностью и сохраняющих при этом максимальную иммуностимуляцию. Исследователи должны всегда помнить о потенциальной боли и дистрессах, связанных с применением адъювантов у лабораторных животных.

Наиболее часто используемыми адъювантами для продукции антител являются адъюванты Фрейнда, Квасцы, Адъювантная система Риби и Титермакс.

Фармацевтическое использование

Иммунный Fab дигоксина представляет собой антигенсвязывающий фрагмент поликлональных антител, образующихся к производному дигиталиса в виде гаптена, связанного с белком, и используется для устранения опасной для жизни дигоксина или дигитоксина . токсичности ^[1]^[2]^[3]

Иммуноглобулин Rho(D) изготавливается из объединенной человеческой плазмы, предоставленной резус-отрицательными донорами с антителами к антигену D. Он используется для обеспечения пассивного иммунного связывания антигена, предотвращения активного иммунного ответа матери, который потенциально может привести к гемолитической болезни новорожденного . ^[4]^[5]

Розролимупаб против RhD представляет собой рекомбинантное человеческое поликлональное антитело , состоящее из 25 уникальных антител IgG1 и используемое для лечения иммунной тромбоцитопенической пурпуры и профилактики изоиммунизации у резус-отрицательных беременных женщин.

REGN-COV2 ( Regeneron Pharmaceuticals ) – потенциальное лечение людей с COVID-19 и предотвращение SARS-CoV-2 заражения коронавирусом .

Преимущества

Использование поликлональных антител (PAbs) по сравнению с моноклональными антителами имеет свои преимущества. Технические навыки, необходимые для производства поликлональных антител, не так сложны. Они недороги в изготовлении и могут быть созданы довольно быстро, на их производство уходит до нескольких месяцев. PAb гетерогенны, что позволяет им связываться с широким спектром антигенных эпитопов. Поскольку PAb производятся из большого количества клонов B-клеток, они с большей вероятностью успешно связываются со специфическим антигеном. PAb остаются стабильными в различных средах, например, при изменении pH или концентрации соли, что позволяет им быть более применимыми в определенных процедурах. Кроме того, в зависимости от необходимого количества PAb можно производить в больших количествах в зависимости от размера используемого животного. ^[6]^[7]^[8]

См. также

Ссылки

^ «Дигибинд (иммунный фактор дигоксина): побочные эффекты, применение, дозировка, взаимодействие, предупреждения» . RxList . Архивировано из оригинала 2 июля 2024 г. Проверено 2 июля 2024 г.
^ «ДИГИБИНД®ДИГОКСИН ИММУННЫЙ ФАБ (ОВИННЫЙ)» . dailymed.nlm.nih.gov . Архивировано из оригинала 28 октября 2021 г. Проверено 2 июля 2024 г.
^ «ДИГИФАБ ДИГОКСИН ИММУННЫЙ ФАБ (ОВИННЫЙ)» . Архивировано из оригинала 20 июля 2023 года . Проверено 12 июля 2024 г.
^ Гемолитическая болезнь новорожденных - группы крови и антигены эритроцитов. Архивировано 5 января 2020 г. в Wayback Machine , книжная полка NCBI.
^ Женская донорская кровь дает спасительный RhoGAM. Архивировано 27 июня 2009 г. в Wayback Machine . USAToday.com
^ «Важнейшие шаги в производстве поликлональных и моноклональных антител: оценка и рекомендации» . Журнал ИЛАР . 46 . Архивировано из оригинала 27 ноября 2013 г.
^ Суков, Марк А.; Стивенс, Карла А.; Уилсон, Рональд П. (2012). Лабораторный кролик, морская свинка, хомяк и другие грызуны . Академическая пресса. ISBN 978-0123809209 . Архивировано из оригинала 12 июля 2024 г. Проверено 9 мая 2022 г.
^ «Моноклональные и поликлональные антитела: отличительные характеристики, применение и информационные ресурсы» . Журнал ИЛАР . 46 . Архивировано из оригинала 17 марта 2014 г.

Внешние ссылки

[1] «Дигибинд (иммунный фактор дигоксина): побочные эффекты, применение, дозировка, взаимодействие, предупреждения» . RxList . Архивировано из оригинала 2 июля 2024 г. Проверено 2 июля 2024 г.

[2] «ДИГИБИНД®ДИГОКСИН ИММУННЫЙ ФАБ (ОВИННЫЙ)» . dailymed.nlm.nih.gov . Архивировано из оригинала 28 октября 2021 г. Проверено 2 июля 2024 г.

[3] «ДИГИФАБ ДИГОКСИН ИММУННЫЙ ФАБ (ОВИННЫЙ)» . Архивировано из оригинала 20 июля 2023 года . Проверено 12 июля 2024 г.

[4] Гемолитическая болезнь новорожденных - группы крови и антигены эритроцитов. Архивировано 5 января 2020 г. в Wayback Machine , книжная полка NCBI.

[5] Женская донорская кровь дает спасительный RhoGAM. Архивировано 27 июня 2009 г. в Wayback Machine . USAToday.com

[6] «Важнейшие шаги в производстве поликлональных и моноклональных антител: оценка и рекомендации» . Журнал ИЛАР . 46 . Архивировано из оригинала 27 ноября 2013 г.

[7] Суков, Марк А.; Стивенс, Карла А.; Уилсон, Рональд П. (2012). Лабораторный кролик, морская свинка, хомяк и другие грызуны . Академическая пресса. ISBN 978-0123809209 . Архивировано из оригинала 12 июля 2024 г. Проверено 9 мая 2022 г.

[8] «Моноклональные и поликлональные антитела: отличительные характеристики, применение и информационные ресурсы» . Журнал ИЛАР . 46 . Архивировано из оригинала 17 марта 2014 г.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]