Гемоцианин блюдечка замочной скважины
Гемоцианин блюдечка замочной скважины (KLH) представляет собой крупный многосубъединичный кислородпереносящий металлопротеин , который обнаружен в гемолимфе гигантского блюдечка , Megathura crenulata вида блюдечка замочной скважины, обитающего у берегов Калифорнии , от залива Монтерей до острова Исла. Асунсьон у берегов Нижней Калифорнии . [ 2 ]
Свойства белка
[ редактировать ]Существует два гена гемоцианина улитки , названные KLH1 и KLH2, которые имеют примерно 60% идентичности на уровне белка. Оба кодируют большие гликозилированные белки, состоящие примерно из 3400 аминокислот и молекулярной массой около 390 000 дальтон , без учета гликозилирования. Белок олигомеризуется с образованием дидекамерного комплекса бочкообразной формы, состоящего из 20 мономеров. Каждый домен субъединицы KLH содержит два меди атома , которые вместе связывают одну молекулу кислорода (O 2 ). Когда кислород связывается с гемоцианином, молекула приобретает характерный прозрачный , опалесцирующий синий цвет из-за присутствия Cu. 2+ состояние меди. В отсутствие кислорода связанная медь находится в виде Cu 1+ а гемоцианин бесцветен. Белок KLH обладает высокой иммуногенностью, но не вызывает неблагоприятного иммунного ответа у человека. Поэтому он высоко ценится как белок-носитель вакцин. Из-за своего размера и гликозилирования белок KLH не может быть воспроизведен синтетически; он доступен только в виде очищенного биологического продукта из блюдечка Megathura crenulata .
Очистка
[ редактировать ]KLH очищается от гемолимфы Megathura crenulata с помощью ряда стадий, которые обычно включают осаждение сульфатом аммония и диализ, а также могут включать хроматографическую очистку для достижения максимальной чистоты. Очистка KLH может также включать удаление эндотоксина , но этот этап часто не нужен, поскольку эндотоксин при инъекции служит адъювантом для производства антител.
Если белок денатурируется или ионы меди теряются в процессе очистки, опалесцирующий синий цвет исчезает, а раствор приобретает тусклый сероватый цвет. Денатурация KLH также приводит к склонности белка к агрегации и осаждению из раствора.
Использование в биотехнологии
[ редактировать ]Гемоцианин улитки замочной скважины (KLH) широко используется в качестве белка-носителя при производстве антител для исследовательских, биотехнологических и терапевтических целей. Гаптены — это вещества с низкой молекулярной массой, такие как пептиды , небольшие белки и молекулы лекарств, которые, как правило, не являются иммуногенными и требуют помощи белка-носителя для стимуляции ответа иммунной системы в виде продукции антител. [ 3 ] KLH является наиболее широко используемым белком-носителем для этой цели. KLH является эффективным белком-носителем по нескольким причинам. Его большой размер и многочисленные эпитопы вызывают существенный иммунный ответ, а обилие остатков лизина для связывания гаптенов обеспечивает высокое соотношение гаптен: белок-носитель, увеличивая вероятность образования гаптен-специфичных антител. Кроме того, поскольку KLH получен из блюдечка, брюхоногого моллюска, он филогенетически далек от белков млекопитающих, что снижает количество ложноположительных результатов в иммунологических методах исследования на модельных организмах млекопитающих.
KLH также может быть сложной молекулой для работы из-за ее склонности к агрегации и осаждению. Агрегаты остаются иммуногенными, но ограничивают способность конъюгировать гаптены, и с ними трудно манипулировать в лаборатории. Высококачественный препарат KLH прозрачного опалесцирующего синего цвета является лучшим индикатором растворимости KLH.
Гаптеновая связь
[ редактировать ]Гаптены можно соединить с KLH несколькими способами. Простое одностадийное сочетание можно осуществить с использованием карбодиимидного сшивающего агента EDC для ковалентного присоединения карбоксилов к первичным аминам. Этот метод является самым простым в исполнении, и «случайная» ориентация позволяет генерировать антитела против всех возможных эпитопов, но обычно он приводит к некоторой степени полимеризации, что снижает растворимость, что затрудняет обращение с конъюгатом.
KLH можно активировать с помощью сшивающего агента Sulfo-SMCC , который преобразует остатки лизина в сульфгидриль-реактивные малеимидные группы. Затем сульфгидрилсодержащий гаптен может быть подвергнут реакции с KLH для завершения иммуногена, не вызывая полимеризации. Специфичность этой реакции идеальна для ситуаций, когда цистеин расположен вдали от желаемого эпитопа (например, в пептидах, где концевой цистеин может быть добавлен к любому концу пептида). KLH, активированный малеимидом, где первая часть этой двухэтапной процедуры была завершена, коммерчески доступен.
Другие белки-носители
[ редактировать ]- Concholepas concholepas Гемоцианин (продается как Blue Carrier) [ нужна ссылка ]
- Бычий сывороточный альбумин (БСА) [ нужна ссылка ]
- Катионизированный БСА (cBSA) [ нужна ссылка ]
- Овальбумин [ нужна ссылка ]
- CRM197
Использование в терапии рака
[ редактировать ]KLH тестируется в различных противораковых вакцинах , включая неходжкинскую лимфому , меланому кожи , рак молочной железы и мочевого пузыря. [ 4 ] [ 5 ] Эти вакцины содержат специфические опухолеассоциированные антигены, конъюгированные с KLH, для стимуляции противоопухолевых иммунных ответов, которые могут разрушать опухолевые клетки.
Быстро растущий интерес к терапевтическим вакцинам (т.е. активной иммунотерапии) против рака и документально подтвержденная эффективность KLH как превосходного белка-носителя для противораковых вакцин создают значительный биофармацевтический рынок для составов KLH. [ 6 ]
Анализы для мониторинга гуморального иммунного ответа против KLH в сыворотке человека были разработаны для облегчения оптимального использования биомедицинских применений KLH. [ 7 ]
Экологические соображения
[ редактировать ]Из-за полезного использования KLH гигантское блюдце-замочная скважина , из которого получен KLH, стало предметом растущей обеспокоенности среди биологов-рыболовов в штате Калифорния из-за возможности чрезмерного вылова этого вида в коммерческих целях. Гигантские блюдечки-замочные скважины изначально не являются многочисленным видом. [ 8 ] а некоторые дайверы сообщили о сокращении их популяции. [ 2 ] В отчете Института морских наук Калифорнийского университета в Санта-Барбаре за 2006 год ученые заявляют, что они «очень обеспокоены возникающим промыслом» гигантских блюдец-замочной скважины, и предполагают, что существует потенциал «уничтожить их популяцию». [ 9 ] Чтобы обеспечить безопасный долгосрочный источник KLH для многих федерально спонсируемых программ биомедицинских исследований с использованием KLH, федеральные агентства, включая Национальные институты здравоохранения. [ 10 ] и Национальный научный фонд [ 11 ] также спонсировали исследования по налаживанию устойчивого производства в марикультуре гигантского блюдечка-замочной скважины.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Гацояннис, К.; Маркл, младший (2009). «Гемоцианин улитки замочной скважины: структура CryoEM 9 Å и молекулярная модель дидекамера KLH1 раскрывают интерфейсы и сложную топологию 160 функциональных единиц». Журнал молекулярной биологии . 385 (3): 963–983. дои : 10.1016/j.jmb.2008.10.080 . ПМИД 19013468 .
- ^ Jump up to: а б «Нырни всухую с доктором Биллом, 084: Гигантское блюдечко из замочной скважины» .
- ^ Латиф С.С., Гупта С., Джаятилака Л.П., Кришнанчеттиар С., Хуанг Дж.С., Ли Б.С. (2007). «Улучшенный протокол связывания синтетических пептидов с белками-носителями для производства антител с использованием ДМФ для солюбилизации пептидов» . Джей Биомол Тех . 18 (3): 173–6. ПМК 2062551 . ПМИД 17595313 .
- ^ «Вакцины против рака» . Архивировано из оригинала 25 октября 2008 г. Проверено 19 мая 2008 г.
- ^ «База знаний о гемоцианине улитки улитки» .
- ^ Харрис-младший, Маркл Дж. (1999). «Гемоцианин блюдечка замочной скважины (KLH): биомедицинский обзор». Микрон . 30 (6): 597–623. дои : 10.1016/s0968-4328(99)00036-0 . ПМИД 10544506 .
- ^ Аартцен Э.Х., де Врис, И.Дж., Герц Дж.Х.; и др. (ноябрь 2012 г.). «Гуморальные анти-KLH-ответы у онкологических больных, получающих иммунотерапию на основе дендритных клеток, определяются различными параметрами вакцинации» . Рак Иммунол Иммунотер . 61 (11): 2003–11. дои : 10.1007/s00262-012-1263-z . ПМЦ 3493659 . ПМИД 22527252 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Парнелл, П. Эд; Дейтон, Пол К.; Леннерт-Коди, Клериди (5 апреля 2004 г.). «Экологический заповедник Сан-Диего-Ла-Хойя: значение для проектирования морских заповедников и управления ими» .
- ^ «Группа по исследовательской деятельности Национального морского заповедника Нормандских островов и Комитет по морским наукам Нормандских островов, проект протокола заседания» (PDF) .
- ^ «История успеха SBIR и STTR для Stellar Biotechnologies, Inc» .
- ^ «Национальный научный фонд, информация о лауреатах» .