Маркировка близости
Ферментативно-катализируемая маркировка по принципу близости ( PL ), также известная как маркировка на основе близости , представляет собой лабораторный метод , который маркирует биомолекулы , обычно белки или РНК , проксимальные к интересующему белку. [1] Путем создания слияния генов в живой клетке между интересующим белком и сконструированным меченым ферментом биомолекулы, пространственно расположенные ближе к интересующему белку, затем могут быть выборочно помечены биотином для извлечения и анализа. Маркировка по принципу близости использовалась, по межбелковому взаимодействию . среди прочего, для идентификации компонентов новых клеточных структур и для определения партнеров [2]
История
[ редактировать ]До разработки метода близкого мечения определение близости белков в клетках основывалось на изучении межбелковых взаимодействий с помощью таких методов, как масс-спектрометрия с аффинной очисткой и анализы лигирования по близости . [3]
DamID — это метод, разработанный в 2000 году Стивеном Хеникоффом для идентификации частей генома, проксимальных к интересующему белку хроматина. DamID основан на слиянии ДНК-метилтрансферазы с белком хроматина для неестественного метилирования ДНК, которую затем можно секвенировать для выявления сайтов метилирования генома рядом с белком. [4] Исследователи руководствовались стратегией слитых белков DamID для создания метода сайт-специфической маркировки белковых мишеней, кульминацией чего стало создание BioID на основе маркировки биотиновых белков в 2012 году. [1] Элис Тинг и лаборатория Тинг в Стэнфордском университете разработали несколько белков, которые демонстрируют улучшение эффективности и скорости бесконтактного мечения на основе биотина. [5] [6] [7] [8]
Принципы
[ редактировать ]Маркировка по принципу близости основана на меченом ферменте, который может беспорядочно биотинилировать близлежащие биомолекулы. Мечение биотина может быть достигнуто несколькими различными методами, в зависимости от вида мечущего фермента.
- BioID, также известный как BirA*, представляет собой мутантную E. coli биотинлигазу , которая катализирует активацию биотина АТФ. Активированный биотин недолговечен и поэтому может диффундировать только в область, проксимальную к BioID. Маркировка достигается, когда активированный биотин реагирует с близлежащими аминами , такими как амины боковой цепи лизина, обнаруженные в белках. [1] TurboID — это биотинлигаза, созданная посредством на поверхности дрожжей направленной эволюции . TurboID обеспечивает время маркировки ~10 минут вместо ~18 часов, требуемых BioID. [5]
- APEX представляет собой производное аскорбатпероксидазы, основанное на перекиси водорода и катализирующее окисление биотин-тирамида, также известного как биотин-фенол, до короткоживущего и реакционноспособного свободного радикала биотин-фенола . Маркировка достигается, когда это промежуточное соединение реагирует с различными функциональными группами близлежащих биомолекул. APEX также можно использовать для местного осаждения диаминобензидина, предшественника красителя для электронной микроскопии . APEX2 является производным APEX, созданным в результате направленной эволюции на поверхности дрожжей. APEX2 демонстрирует улучшенную эффективность мечения и уровень клеточной экспрессии. [8]
Чтобы пометить белки, находящиеся рядом с интересующим белком, типичный эксперимент по бесконтактному мечению начинается с клеточной экспрессии слияния APEX2 с интересующим белком, который локализуется в нативной среде интересующего белка. Затем клетки инкубируют с биотин-фенолом, затем ненадолго с перекисью водорода, инициируя генерацию и маркировку свободных радикалов биотин-фенол. Чтобы свести к минимуму повреждение клеток, реакцию затем гасят с помощью антиоксидантного буфера. Клетки лизируются, и меченые белки удаляются с помощью стрептавидиновых шариков. Белки расщепляются трипсином , и, наконец, полученные пептидные фрагменты анализируются с использованием методов протеомики дробовика, таких как LC-MS/MS или SPS-MS. 3 . [8]
Если вместо этого слитый белок генетически недоступен (например, в образцах тканей человека), но известно антитело к интересующему белку, бесконтактное мечение все равно можно включить путем слияния мечущего фермента с антителом, а затем инкубации слияния с образцом. . [9] [10]
Приложения
[ редактировать ]Методы бесконтактной маркировки использовались для изучения протеомов биологических структур, которые иначе трудно изолировать чисто и полностью, таких как реснички , [11] митохондрии , [6] постсинаптические щели , [2] р-тела , стресс-гранулы , [12] и липидные капли . [13]
Слияние APEX2 с рецепторами, связанными с G-белком (GPCR), позволяет отслеживать передачу сигналов GPCR с временным разрешением 20 секунд. [14] а также идентификация неизвестных белков, связанных с GPCR. [15]
Маркировка близости также использовалась для транскриптомики и интерактомики . В 2019 году Алиса Тинг и лаборатория Тинга использовали APEX для идентификации РНК, локализованной в определенных клеточных компартментах. [16] [17] В 2019 году BioID был привязан к транскрипту мРНК бета-актина для изучения динамики его локализации. [18] Маркировка близости также использовалась для поиска партнеров по взаимодействию гетеродимерных протеинфосфатаз miRISC (микроРНК-индуцированного молчания) , белка Ago2 и рибонуклеопротеинов . [3]
Последние события
[ редактировать ]Маркировка на основе TurboID использовалась для идентификации регуляторов рецептора, участвующего во врожденном иммунном ответе , NOD-подобного рецептора . [19] Бесконтактная маркировка на основе BioID использовалась для определения молекулярного состава рака молочной железы клеток инвадоподий , которые важны для метастазирования. [20] Исследования проксимитивной маркировки на основе биотина демонстрируют повышенную маркировку белками внутренне неупорядоченных областей , что позволяет предположить, что бесконтактная маркировка на основе биотина может использоваться для изучения роли IDR. [21] маркировки . Также была разработана небольшая молекула, нацеленная на ядро фотосенсибилизатора, для фотоактивируемой бесконтактной [22]
Фотокаталитическая маркировка близости
[ редактировать ]Новый рубеж в области бесконтактной маркировки использует возможности фотокатализа для достижения высокого пространственного и временного разрешения проксимального белкового микроокружения. [23] Эта фотокаталитическая технология использует фотонную энергию фотокатализаторов на основе иридия для активации диазириновых зондов, которые могут метить проксимальные белки в пределах узкого радиуса около четырех нанометров. [24] Эта технология была разработана Исследовательским научным центром компании Merck в сотрудничестве с исследователями Принстонского университета . [24]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с Ру, Кайл Дж.; Ким, Дэ Ин; Райда, Манфред; Берк, Брайан (19 марта 2012 г.). «Беспорядочный слитый белок биотинлигазы идентифицирует проксимальные и взаимодействующие белки в клетках млекопитающих» . Журнал клеточной биологии . 196 (6): 801–810. дои : 10.1083/jcb.201112098 . ISSN 0021-9525 . ПМК 3308701 . ПМИД 22412018 .
- ^ Jump up to: а б Хан, Шуо; Ли, Цзефу; Тинг, Алиса Ю (01 июня 2018 г.). «Близость маркировки: протеомное картирование с пространственным разрешением для нейробиологии» . Современное мнение в нейробиологии . Нейротехнологии. 50 : 17–23. дои : 10.1016/j.conb.2017.10.015 . ISSN 0959-4388 . ПМК 6726430 . ПМИД 29125959 .
- ^ Jump up to: а б Тринкл-Малкахи, Лаура (31 января 2019 г.). «Последние достижения в методах маркировки на основе близости для картирования интерактома» . F1000Исследования . 8 : 135. дои : 10.12688/f1000research.16903.1 . ISSN 2046-1402 . ПМК 6357996 . ПМИД 30774936 .
- ^ Стинсель, Бас ван; Хеникофф, Стивен (апрель 2000 г.). «Идентификация in vivo ДНК-мишеней белков хроматина с использованием привязанной метилтрансферазы Dam» . Природная биотехнология . 18 (4): 424–428. дои : 10.1038/74487 . ISSN 1546-1696 . ПМИД 10748524 . S2CID 30350384 .
- ^ Jump up to: а б Бранон, Тесс К.; Босх, Джастин А.; Санчес, Ариана Д.; Удеши, Намрата Д.; Свинькина, Таня; Карр, Стивен А.; Фельдман, Джессика Л.; Перримон, Норберт; Тинг, Алиса Ю. (01 октября 2018 г.). «Эффективная бесконтактная маркировка в живых клетках и организмах с помощью TurboID» . Природная биотехнология . 36 (9): 880–887. дои : 10.1038/nbt.4201 . ISSN 1546-1696 . ПМК 6126969 . ПМИД 30125270 .
- ^ Jump up to: а б Ри, Хён Ву; Цзоу, Пэн; Удеши, Намрата Д.; Мартелл, Джеффри Д.; Моота, Вамси К.; Карр, Стивен А.; Тинг, Алиса Ю. (15 марта 2013 г.). «Протеомное картирование митохондрий в живых клетках посредством пространственно ограниченного ферментативного мечения» . Наука . 339 (6125): 1328–1331. Бибкод : 2013Sci...339.1328R . дои : 10.1126/science.1230593 . ISSN 0036-8075 . ПМЦ 3916822 . ПМИД 23371551 .
- ^ Лам, Стефани С.; Мартелл, Джеффри Д.; Камер, Кимберли Дж.; Диринк, Томас Дж.; Эллисман, Марк Х.; Моота, Вамси К.; Тинг, Алиса Ю. (январь 2015 г.). «Направленная эволюция APEX2 для электронной микроскопии и бесконтактной маркировки» . Природные методы . 12 (1): 51–54. дои : 10.1038/nmeth.3179 . hdl : 1721.1/110613 . ISSN 1548-7105 . ПМК 4296904 . ПМИД 25419960 .
- ^ Jump up to: а б с Калочай, Мариан (2019). «Близкое маркирование, катализируемое пероксидазой APEX, и мультиплексная количественная протеомика». В Сунбуле, Мурат; Яшке, Андрес (ред.). Маркировка близости . Методы молекулярной биологии. Том. 2008. Спрингер. стр. 41–55. дои : 10.1007/978-1-4939-9537-0_4 . ISBN 978-1-4939-9537-0 . ПМИД 31124087 . S2CID 163166385 .
{{cite book}}:|work=игнорируется ( помогите ) - ^ Рис, Джоанна С.; Ли, Сюэ-Вэнь; Перретт, Сара; Лилли, Кэтрин С.; Джексон, Энтони П. (1 ноября 2015 г.). «Соседи белков и протеомика близости» . Молекулярная и клеточная протеомика . 14 (11): 2848–2856. дои : 10.1074/mcp.R115.052902 . ISSN 1535-9476 . ПМК 4638030 . ПМИД 26355100 .
- ^ Бар, Дэниел З.; Аткатш, Кэтлин; Таварес, Уррака; Эрдос, Майкл Р.; Грюнбаум, Йозеф; Коллинз, Фрэнсис С. (февраль 2018 г.). «Биотинилирование путем распознавания антител - метод бесконтактной маркировки» . Природные методы . 15 (2): 127–133. дои : 10.1038/nmeth.4533 . ISSN 1548-7091 . ПМК 5790613 . ПМИД 29256494 .
- ^ Мик, Дэвид У.; Родригес, Рэйчел Б.; Лейб, Райан Д.; Адамс, Кристофер М.; Чиен, Эллис С.; Гиги, Стивен П.; Начури, Максенс В. (23 ноября 2015 г.). «Протеомика первичных ресничек путем маркировки по близости» . Развивающая клетка . 35 (4): 497–512. дои : 10.1016/j.devcel.2015.10.015 . ISSN 1878-1551 . ПМЦ 4662609 . ПМИД 26585297 .
- ^ Юн, Джи-Ён; Данэм, Уэйд Х.; Хон, Со Чжон; Найт, Джеймс Д.Р.; Башкуров Михаил; Чен, Джинни И.; Багчи, Халил; Ратод, Бхавиша; Маклауд, Грэм; Энг, Саймон ВМ; Анже, Стефан (февраль 2018 г.). «Картирование близости высокой плотности выявляет субклеточную организацию мРНК-ассоциированных гранул и тел» . Молекулярная клетка . 69 (3): 517–532.e11. doi : 10.1016/j.molcel.2017.12.020 . ISSN 1097-2765 . ПМИД 29395067 .
- ^ Берсукер, Кирилл; Петерсон, Кларк WH; Кому, Милтону; Саль, Штеффен Дж.; Савихина, Виктория; Гроссман, Элизабет А.; Номура, Дэниел К.; Ольцманн, Джеймс А. (08 января 2018 г.). «Стратегия бесконтактной маркировки дает представление о составе и динамике протеомов липидных капель» . Развивающая клетка . 44 (1): 97–112.e7. дои : 10.1016/j.devcel.2017.11.020 . ISSN 1534-5807 . ПМЦ 5764092 . ПМИД 29275994 .
- ^ Пэк, Джэхо; Калочай, Мариан; Стаус, Дин П.; Винглер, Лаура; Пасколутти, Роберта; Пауло, Жоао А.; Гиги, Стивен П.; Крузе, Эндрю К. (6 апреля 2017 г.). «Многомерное отслеживание передачи сигналов GPCR посредством катализируемой пероксидазой маркировки близости» . Клетка . 169 (2): 338–349.e11. дои : 10.1016/j.cell.2017.03.028 . ISSN 1097-4172 . ПМК 5514552 . ПМИД 28388415 .
- ^ Лобинье, Брейден Т.; Хюттенхайн, Рут; Эйхель, Келси; Миллер, Кеннет Б.; Тинг, Элис Ю.; фон Застроу, Марк; Кроган, Неван Дж. (6 апреля 2017 г.). «Подход к пространственно-временному разрешению сетей взаимодействия белков в живых клетках» . Клетка . 169 (2): 350–360.e12. дои : 10.1016/j.cell.2017.03.022 . ISSN 1097-4172 . ПМК 5616215 . ПМИД 28388416 .
- ^ Шилдс, Эмили Дж.; Петраковичи, Ана Ф.; Бонасио, Роберто (15 апреля 2019 г.). «LncНевероятно универсальный: биохимические и биологические функции длинных некодирующих РНК» . Биохимический журнал . 476 (7): 1083–1104. дои : 10.1042/BCJ20180440 . ISSN 0264-6021 . ПМЦ 6745715 . ПМИД 30971458 .
- ^ Фазал, Фуркан М.; Хан, Шуо; Паркер, Кевин Р.; Каевсапсак, Порнчай; Сюй, Цзинь; Беттигер, Алистер Н.; Чанг, Ховард Ю.; Тинг, Алиса Ю. (11 июля 2019 г.). «Атлас субклеточной локализации РНК, выявленной с помощью APEX-Seq» . Клетка . 178 (2): 473–490.e26. дои : 10.1016/j.cell.2019.05.027 . ISSN 0092-8674 . ПМЦ 6786773 . ПМИД 31230715 .
- ^ Мукерджи, Джойта; Хермеш, Орит; Елискович, Кэролайн; Готово, Николас; Франц-Вахтель, Мирта; Мачек, Борис; Янсен, Ральф-Петер (25 июня 2019 г.). «Картирование интерактома мРНК β-актина путем биотинилирования по близости» . Труды Национальной академии наук . 116 (26): 12863–12872. Бибкод : 2019PNAS..11612863M дои : 10.1073/pnas.1820737116 . ISSN 0027-8424 . ПМК 6600913 . ПМИД 31189591 .
- ^ Чжан, Юнлян; Сун, Гаоюань; Лал, Нирадж К.; Нагалакшми, Уграппа; Ли, Юаньюань; Чжэн, Вэньцзе; Хуан, Пинь-цзюй; Бранон, Тесс К.; Тинг, Элис Ю.; Уолли, Джастин В.; Динеш-Кумар, Савитрамма П. (19 июля 2019 г.). «Близкая маркировка на основе TurboID показывает, что UBR7 является регулятором иммунитета, опосредованного иммунными рецепторами N NLR» . Природные коммуникации . 10 (1): 3252. Бибкод : 2019NatCo..10.3252Z . дои : 10.1038/s41467-019-11202-z . ISSN 2041-1723 . ПМК 6642208 . ПМИД 31324801 .
- ^ Туо, Сильви; Мамелоне, Клэр; Саламе, Жоэль; Остаколо, Кевин; Чанес, Брис; Салаун, Даниэле; Боделе, Эмили; Одебер, Стефан; Камуан, Люк; Бадаче, Али (22 апреля 2020 г.). «Протеомный подход с маркировкой близости к исследованию молекулярного ландшафта инвадоподий в клетках рака молочной железы» . Научные отчеты . 10 (1): 6787. Бибкод : 2020NatSR..10.6787T . дои : 10.1038/s41598-020-63926-4 . ISSN 2045-2322 . ПМЦ 7176661 . ПМИД 32321993 .
- ^ Минд, Дэвид-Пол; Рамакришна, Манаса; Лилли, Кэтрин С. (22 января 2020 г.). «Биотиновая маркировка благоприятствует развернутым белкам и позволяет изучать внутренне неупорядоченные области» . Коммуникационная биология . 3 (1): 38. дои : 10.1038/s42003-020-0758-y . ISSN 2399-3642 . ПМК 6976632 . ПМИД 31969649 .
- ^ Тамура, Томонори; Такато, Микико; Сионо, Кейя; Хамачи, Итару (05.12.2019). «Разработка фотоактивируемого метода бесконтактной маркировки для идентификации ядерных белков» . Химические письма . 49 (2): 145–148. дои : 10.1246/кл.190804 . ISSN 0366-7022 .
- ^ Джери, Джейкоб; и др. 2020. «Картирование микроокружения посредством передачи энергии Декстера на иммунные клетки». Наука.
- ^ Jump up to: а б Кросс, Райан. 2020. «Ученые Merck и Принстона создают метод картирования микроокружения клеточной поверхности». Новости химии и техники.