Иммунопреципитация

Иммунопреципитация ( ИП ) — это метод осаждения белкового антигена из раствора с использованием антитела , которое специфически связывается с этим конкретным белком. Этот процесс можно использовать для выделения и концентрирования определенного белка из образца, содержащего многие тысячи различных белков. Иммунопреципитация требует, чтобы антитело было связано с твердым субстратом на определенном этапе процедуры.

Типы

Индивидуальная иммунопреципитация белков (ИП)

Включает использование антитела, специфичного для известного белка, для выделения этого конкретного белка из раствора, содержащего множество различных белков. Эти растворы часто имеют форму сырого лизата растительной или животной ткани. Другими типами образцов могут быть жидкости организма или другие образцы биологического происхождения.

Белковая комплексная иммунопреципитация (Co-IP)

Иммунопреципитация интактных белковых комплексов (т.е. антигена вместе с любыми белками или лигандами, которые с ним связаны) известна как коиммунопреципитация (Ко-IP). Co-IP работает путем выбора антитела, нацеленного на известный белок, который, как полагают, является членом более крупного комплекса белков. Воздействуя на этого известного члена антителом, можно будет извлечь весь белковый комплекс из раствора и тем самым идентифицировать неизвестные члены комплекса.

Это работает, когда белки, участвующие в комплексе, прочно связываются друг с другом, что позволяет вытащить несколько членов комплекса из раствора, зафиксировав один из членов с помощью антитела. Эту концепцию извлечения белковых комплексов из раствора иногда называют «вытягиванием вниз». Co-IP — это мощный метод, который регулярно используется молекулярными биологами для анализа белок-белковых взаимодействий .

• Конкретное антитело часто выбирает субпопуляцию своего белка-мишени, у которой имеется обнаженный эпитоп , таким образом, не в состоянии идентифицировать какие-либо белки в комплексах, которые скрывают эпитоп. Это видно по тому, что редко удается преципитировать хотя бы половину данного белка из образца с помощью одного антитела, даже если используется большой избыток антител.
• По мере проведения последовательных раундов нацеливания и иммунопреципитации количество идентифицированных белков может продолжать расти. Идентифицированные белки могут никогда не существовать в одном комплексе в данный момент времени, а вместо этого могут представлять собой сеть белков, взаимодействующих друг с другом в разное время для разных целей.
• Повторение эксперимента, воздействуя на разных членов белкового комплекса, позволяет исследователю перепроверить результат. Каждый раунд извлечения должен привести к восстановлению как исходного известного белка, так и других ранее идентифицированных членов комплекса (и даже новых дополнительных членов). Повторяя таким образом иммунопреципитацию, исследователь проверяет, что каждый идентифицированный член белкового комплекса является достоверной идентификацией. Если конкретный белок можно восстановить только путем воздействия на одного из известных членов, но не путем воздействия на других известных членов, тогда статус этого белка как члена комплекса может быть поставлен под сомнение.

Иммунопреципитация хроматина (ЧИП)

Рабочий процесс ChIP-секвенирования

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) — это метод, используемый для определения местоположения сайтов связывания ДНК в геноме для конкретного белка интересующего . Этот метод дает представление о взаимодействиях белок-ДНК, которые происходят внутри ядра живых клеток или тканей. Природа этого метода in vivo отличается от других подходов, традиционно используемых для ответа на те же вопросы.

Принцип, лежащий в основе этого анализа, заключается в том, что ДНК-связывающие белки (включая факторы транскрипции и гистоны ) в живых клетках могут быть сшиты с ДНК, с которой они связываются. Используя антитело, специфичное к предполагаемому ДНК-связывающему белку, можно иммунопреципитировать комплекс белок-ДНК из клеточных лизатов. Сшивание . часто осуществляется путем нанесения на клетки (или ткани) формальдегида , хотя иногда бывает выгодно использовать более определенный и устойчивый сшивающий агент, такой как диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат-2 HCl (DTBP) После сшивания клетки лизируются , и ДНК разбивается на фрагменты длиной 0,2–1,0 т.п.н. с помощью обработки ультразвуком . На этом этапе осуществляется иммунопреципитация, приводящая к очистке комплексов белок-ДНК. Очищенные комплексы белок-ДНК затем нагревают, чтобы обратить вспять формальдегидное сшивание комплексов белка и ДНК, что позволяет отделить ДНК от белков. Затем идентичность и количество выделенных фрагментов ДНК можно определить с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ограничением проведения ПЦР на изолированных фрагментах является то, что необходимо иметь представление о том, на какую геномную область нацелена, чтобы создать правильные праймеры для ПЦР. Иногда это ограничение можно обойти, просто клонируя выделенную геномную ДНК в плазмидный вектор , а затем используя праймеры, специфичные для области клонирования этого вектора. В качестве альтернативы, когда кто-то хочет найти, где белок связывается в масштабе всего генома, используется ChIP-секвенирование , которое недавно стало стандартной технологией, которая может локализовать сайты связывания белка высокопроизводительным и экономически эффективным способом, что позволяет также для характеристики цистром . Ранее ДНК-микрочип также использовался ( ЧИП-на-чипе или ЧИП-чип ).

Иммунопреципитация РНП (RIP и CLIP)

Оба RIP и CLIP очищают специфический РНК-связывающий белок, чтобы идентифицировать связанные РНК, тем самым изучая рибонуклеопротеины (РНП). В RIP экстрагируются совместно очищенные РНК, и их обогащение сравнивается с контролем, что первоначально было выполнено с помощью микрочипов или RT-PCR . В CLIP клетки подвергаются сшиванию УФ-излучением перед лизисом, после чего следуют дополнительные этапы очистки, помимо стандартной иммунопреципитации, включая частичную фрагментацию РНК, промывку высоким содержанием соли, разделение в SDS-PAGE и мембранный перенос, а также идентификацию сайтов прямого связывания РНК путем секвенирования кДНК .

Меченые белки

Анализ «сброса» с использованием меченых белков

Одним из основных технических препятствий при иммунопреципитации является большая сложность создания антитела, которое специфически нацелено на один известный белок. Чтобы обойти это препятствие, многие группы будут создавать метки либо на С-, либо на N-конце интересующего белка. Преимущество здесь в том, что одну и ту же метку можно использовать снова и снова для множества разных белков, и исследователь может каждый раз использовать одно и то же антитело. Преимущества использования меченых белков настолько велики, что этот метод стал обычным явлением для всех типов иммунопреципитации, включая все типы ИП, подробно описанные выше. Примерами используемых меток являются метка зеленого флуоресцентного белка (GFP), метка глутатион-S-трансферазы (GST) и метка FLAG-tag . Хотя использование тега для включения раскрывающихся списков удобно, оно вызывает некоторые опасения относительно биологической значимости, поскольку сам тег может либо скрывать нативные взаимодействия, либо вводить новые и неестественные взаимодействия.

Методы

Двумя общими методами иммунопреципитации являются метод прямого захвата и метод непрямого захвата.

Прямой

Антитела, специфичные для определенного белка (или группы белков), иммобилизуют на твердофазном субстрате, таком как суперпарамагнитные микрогранулы или на микроскопических агарозных (немагнитных) шариках. Затем к белковой смеси добавляются гранулы со связанными антителами, и белки, на которые нацелены антитела, захватываются на гранулах посредством антител; другими словами, они подвергаются иммунопреципитации.

Косвенный

Антитела, специфичные для определенного белка или группы белков, добавляются непосредственно в смесь белков. Антитела еще не были прикреплены к твердофазной подложке. Антитела могут свободно перемещаться по белковой смеси и связывать свои цели. шарики, покрытые белком A/G По прошествии времени к смеси антитела и белка добавляются . В этот момент антитела, которые теперь связаны со своими мишенями, прилипнут к шарикам.

С этого момента прямой и непрямой протоколы сходятся, поскольку теперь образцы содержат одни и те же ингредиенты. Оба метода дают одинаковый конечный результат: белок или белковые комплексы связываются с антителами, которые сами иммобилизуются на гранулах.

Выбор

Непрямой подход иногда предпочтителен, когда концентрация белка-мишени низкая или когда специфическое сродство антитела к белку слабое. Непрямой метод также используется, когда кинетика связывания антитела с белком медленная по ряду причин. В большинстве ситуаций прямой метод является предпочтительным и предпочтительным выбором по умолчанию.

Технологические достижения

Агароза

Исторически твердофазным носителем для иммунопреципитации, используемым большинством ученых, были высокопористые агарозные шарики (также известные как агарозные смолы или суспензии). Преимуществом этой технологии является очень высокая потенциальная связывающая способность, поскольку практически вся губчатая структура частиц агарозы (размером от 50 до 150 мкм) доступна для связывания антител (которые, в свою очередь, связывают целевые белки) и использование стандартного лабораторного оборудования для всех аспектов протокола IP без необходимости использования какого-либо специализированного оборудования. Преимущество чрезвычайно высокой связывающей способности должно быть тщательно сбалансировано с количеством антител, которое исследователь готов использовать для покрытия агарозных шариков. Поскольку антитела могут быть фактором, ограничивающим затраты, лучше всего произвести обратный расчет от количества белка, которое необходимо захватить (в зависимости от анализа, который будет выполнен в дальнейшем), до количества антител, которое требуется для связывания этого количества белка. белка (с небольшим избытком, добавленным для компенсации неэффективности системы), и обратно еще дальше к количеству агарозы, необходимому для связывания этого конкретного количества антитела. В тех случаях, когда насыщение антителами не требуется, эта технология не имеет себе равных по способности захватывать чрезвычайно большие количества захваченных целевых белков. Предостережение здесь заключается в том, что «преимущество высокой емкости» может стать «недостатком высокой емкости» , который проявляется, когда огромная связывающая способность гранул сефарозы /агарозы не полностью насыщена антителами. Часто случается, что количество антител, доступное исследователю для эксперимента по иммунопреципитации, недостаточно для насыщения агарозных шариков, которые будут использоваться в иммунопреципитации. В этих случаях исследователь может получить частицы агарозы, которые лишь частично покрыты антителами, а часть связывающей способности агарозных шариков, не покрытая антителами, может свободно связывать все, что прилипнет, что приводит к повышенному уровню связывания. фоновый сигнал из-за неспецифического связывания компонентов лизата с гранулами, что может затруднить интерпретацию данных. Хотя некоторые могут возразить, что по этим причинам разумно сопоставить количество агарозы (с точки зрения связывающей способности) с количеством антител, которые нужно связать для иммунопреципитации, простой способ уменьшить проблему неспецифических связывание с агарозными шариками и повышение специфичности заключается в предварительной очистке лизата, что настоятельно рекомендуется для любой иммунопреципитации.

Преклиринг

Лизаты представляют собой сложные смеси белков, липидов, углеводов и нуклеиновых кислот, и следует предположить, что некоторое количество неспецифического связывания с IP-антителом, белком A/G или гранулированной подложкой будет происходить и отрицательно влиять на обнаружение иммунопреципитированной мишени. (с). В большинстве случаев предварительная очистка лизата в начале каждого эксперимента по иммунопреципитации (см. шаг 2 в разделе «Протокол» ниже). представляет собой способ удаления потенциально реактивных компонентов из клеточного лизата перед иммунопреципитацией, чтобы предотвратить неспецифическое связывание этих компонентов с гранулами IP или антителом. Основная процедура предварительной очистки описана ниже, при которой лизат инкубируется только с гранулами, которые затем удаляются и выбрасываются перед иммунопреципитацией. Однако этот подход не учитывает неспецифическое связывание с IP-антителом, которое может быть значительным. Поэтому альтернативным методом предварительной очистки является инкубация белковой смеси с точно теми же компонентами, которые будут использоваться при иммунопреципитации, за исключением того, что вместо IP-антитела используется нецелевое, нерелевантное антитело того же подкласса антител, что и IP-антитело. само антитело. В этом подходе предпринимается попытка использовать условия и компоненты ИП, максимально приближенные к точным условиям и компонентам фактической иммунопреципитации, для удаления любого неспецифического клеточного компонента без захвата целевого белка (если, конечно, целевой белок неспецифически не связывается с каким-либо другим компонентом ИП). что следует должным образом контролировать путем анализа выброшенных шариков, использованных для предварительной очистки лизата). Затем целевой белок может быть иммунопреципитирован с уменьшенным риском неспецифического связывания, мешающего интерпретации данных.

Суперпарамагнитные шарики

Хотя подавляющее большинство иммунопреципитаций выполняется с использованием агарозных гранул, использование суперпарамагнитных гранул для иммунопреципитации является более новым подходом, который набирает популярность в качестве альтернативы агарозным гранулам для IP-приложений. В отличие от агарозы, магнитные шарики являются твердыми и могут иметь сферическую форму, в зависимости от типа шариков, а связывание антител ограничивается поверхностью каждого шарика. Хотя эти шарики не обладают преимуществом пористого центра для увеличения связывающей способности, магнитные шарики значительно меньше, чем агарозные шарики (от 1 до 4 мкм), а большее количество магнитных шариков на объем, чем агарозные шарики, в совокупности дает магнитным шарикам эффективное соотношение площади поверхности к объему для оптимального связывания антител.

Коммерчески доступные магнитные шарики можно разделить по однородности размера на монодисперсные и полидисперсные шарики. Монодисперсные шарики, также называемые микрошариками , демонстрируют точную однородность, и поэтому все шарики обладают идентичными физическими характеристиками, включая связывающую способность и уровень притяжения к магнитам. Полидисперсные шарики, хотя и схожи по размеру с монодисперсными шариками, демонстрируют широкий диапазон вариабельности размеров (от 1 до 4 мкм), что может влиять на их связывающую способность и магнитный захват. Хотя оба типа гранул коммерчески доступны для иммунопреципитации, монодисперсные суперпарамагнитные гранулы более высокого качества более идеальны для автоматических протоколов из-за их постоянного размера, формы и характеристик. Монодисперсные и полидисперсные суперпарамагнитные шарики предлагают многие компании, в том числе Invitrogen , Thermo Scientific и Millipore .

Агароза против магнитных шариков

Сторонники магнитных шариков утверждают, что шарики обладают более высокой скоростью связывания белков. над агарозными шариками для иммунопреципитации, хотя стандартная иммунопреципитация на основе агарозных шариков проводилась за 1 час. Также утверждалось, что магнитные шарики лучше подходят для иммунопреципитации чрезвычайно больших белковых комплексов из-за полного отсутствия верхнего предела размера для таких комплексов. хотя объективных доказательств, подтверждающих это утверждение, нет. Природа технологии магнитных шариков приводит к меньшим затратам на обработку проб. за счет снижения физической нагрузки на образцы магнитной сепарации по сравнению с повторным центрифугированием при использовании агарозы, что может способствовать значительному увеличению выхода лабильных (хрупких) белковых комплексов. Однако при выборе поддержки иммунопреципитации следует учитывать дополнительные факторы, такие как связывающая способность, стоимость реагента, потребность в дополнительном оборудовании и возможность автоматизации процессов IP.

Связующая способность

Сторонники как агарозных, так и магнитных шариков могут спорить, благоприятствует ли огромная разница в связывающей способности двух шариков одному конкретному типу шариков. При сравнении шариков агарозные шарики имеют значительно большую площадь поверхности и, следовательно, большую связывающую способность, чем магнитные шарики, из-за большого размера шариков и губчатой ​​структуры. Но переменный размер пор агарозы обусловливает потенциальный верхний предел размера, который может повлиять на связывание чрезвычайно больших белков или белковых комплексов с внутренними сайтами связывания, и поэтому магнитные шарики могут лучше подходить для иммунопреципитации крупных белков или белковых комплексов, чем агарозные шарики. хотя независимых сравнительных данных, подтверждающих любой случай, не хватает.

Некоторые утверждают, что значительно более высокая связывающая способность агарозных гранул может быть недостатком из-за большей способности неспецифического связывания. Другие могут выступать за использование магнитных шариков из-за большего количества антител, необходимых для насыщения общей связывающей способности агарозных шариков, что, очевидно, будет экономическим недостатком использования агарозы. Хотя эти аргументы верны вне контекста их практического использования, эти рассуждения игнорируют два ключевых аспекта принципа иммунопреципитации, которые демонстрируют, что решение использовать агарозу или магнитные шарики не определяется просто связывающей способностью.

Во-первых, неспецифическое связывание не ограничивается сайтами связывания антител на иммобилизованной подложке; любая поверхность антитела или компонента реакции иммунопреципитации может связываться с неспецифическими компонентами лизата, и поэтому неспецифическое связывание все равно будет происходить, даже если используются полностью насыщенные шарики. Вот почему важно предварительно очистить образец перед выполнением иммунопреципитации.

Во-вторых, способность захватывать целевой белок напрямую зависит от количества используемого иммобилизованного антитела, и поэтому при параллельном сравнении агарозной и иммунопреципитации на магнитных гранулах большая часть белка, которую может захватить любой из носителей, ограничена количество добавленных антител. Таким образом, решение о насыщении любого типа поддержки зависит от необходимого количества белка, как описано выше в разделе «Агароза» на этой странице.

Расходы

Цена использования любого типа подложки является ключевым определяющим фактором при использовании агарозы или магнитных шариков для иммунопреципитации. Типичный первый расчет стоимости магнитных шариков по сравнению с шариками сефарозы может сделать шарики сефарозы менее дорогими. Но магнитные шарики могут иметь конкурентоспособную цену по сравнению с агарозой для иммунопреципитации аналитического масштаба в зависимости от используемого метода ИП и объема шариков, необходимого для реакции ИП.

При использовании традиционного периодического метода иммунопреципитации, указанного ниже, при котором все компоненты добавляются в пробирку во время реакции ИП, физические характеристики обращения с агарозными шариками требуют минимального количества шариков для каждого эксперимента ИП (обычно в диапазоне от 25 до 50). мкл шариков на IP). Это связано с тем, что гранулы сефарозы необходимо концентрировать на дне пробирки путем центрифугирования, а надосадочную жидкость удалять после каждой инкубации, промывки и т. д. Это накладывает абсолютные физические ограничения на процесс, поскольку гранулы агарозы объемом менее 25–50 мкл трудно получить. если это возможно, визуально определить на дне пробирки. При использовании магнитных шариков минимальное количество шариков не требуется из-за магнитной обработки, и поэтому, в зависимости от целевого антигена и IP-антитела, можно использовать значительно меньше магнитных шариков.

И наоборот, вместо обычных микроцентрифужных пробирок можно использовать центрифужные колонки, чтобы значительно уменьшить количество агарозных шариков, необходимых для реакции. Спин-колонки содержат фильтр, который позволяет всем компонентам IP, за исключением гранул, проходить через кратковременное центрифугирование и, следовательно, обеспечивает метод, позволяющий использовать значительно меньше агарозных гранул с минимальными потерями.

Оборудование

Как упоминалось выше, для использования агарозных шариков в приложениях иммунопреципитации требуется только стандартное лабораторное оборудование, тогда как для IP-реакций на основе магнитных шариков требуются мощные магниты. Хотя оборудование для магнитного захвата может быть непомерно дорогостоящим, быстрое завершение иммунопреципитации с использованием магнитных шариков может быть финансово выгодным подходом, когда наступит срок предоставления грантов, поскольку 30-минутный протокол с магнитными шариками по сравнению с ночной инкубацией при 4 ° C с агарозными шариками может привести к созданию большего количества данных за более короткий промежуток времени.

Автоматизация

Дополнительным преимуществом использования магнитных шариков является то, что автоматические устройства для иммунопреципитации становятся все более доступными. Эти устройства не только сокращают объем работы и время выполнения IP, но также могут использоваться для приложений с высокой пропускной способностью .

Краткое содержание

Хотя явные преимущества использования магнитных шариков включают повышенную скорость реакции, более бережное обращение с образцами и возможность автоматизации, выбор использования агарозы или магнитных шариков зависит от связывающей способности поддерживающей среды и стоимости продукта. интересующий белок и используемый метод IP. Как и во всех анализах, необходимо эмпирическое тестирование, чтобы определить, какой метод является оптимальным для данного применения.

Протокол

Фон

После выбора технологии гранул с твердым субстратом антитела соединяются с гранулами, и шарики, покрытые антителами, можно добавлять к гетерогенному образцу белка (например, гомогенизированной ткани). На этом этапе антитела, иммобилизованные на гранулах, будут связываться с белками, которые они специфически распознают. Как только это произошло, часть протокола, посвященная иммунопреципитации, фактически завершена, поскольку конкретные представляющие интерес белки связываются с антителами, которые сами иммобилизованы на гранулах. Отделение иммунокомплексов от лизата представляет собой чрезвычайно важную серию шагов, поскольку белки должны оставаться связанными друг с другом (в случае ко-IP) и связанными с антителом во время этапов промывки для удаления несвязанных белки и уменьшают фон.

При работе с агарозными шариками их необходимо выдавливать из образца путем кратковременного вращения в центрифуге с силой от 600 до 3000 g (в разы превышает стандартную силу гравитации). Этот этап можно выполнить в стандартной микроцентрифужной пробирке, но для более быстрого разделения, большей консистенции и более высокого выхода процесс часто выполняют в небольших центрифужных колонках с размером пор, позволяющим проходить жидкости, но не агарозным шарикам. После центрифугирования агарозные шарики образуют очень рыхлый пушистый осадок на дне пробирки. Надосадочную жидкость, содержащую загрязнения, можно осторожно удалить, чтобы не повредить шарики. Затем к гранулам можно добавить промывочный буфер и после смешивания гранулы снова разделяют центрифугированием.

При использовании суперпарамагнитных шариков образец помещается в магнитное поле, чтобы шарики могли собираться на стенках пробирки. Эта процедура обычно завершается примерно за 30 секунд, а оставшаяся (нежелательная) жидкость удаляется пипеткой. Промывка осуществляется путем ресуспендирования шариков (с магнита) в промывочном растворе и последующего концентрирования шариков обратно на стенках трубки (путем помещения пробирки обратно на магнит). Промывку обычно повторяют несколько раз, чтобы обеспечить адекватное удаление загрязнений. Если суперпарамагнитные шарики однородны по размеру и магнит спроектирован правильно, то шарики будут равномерно концентрироваться на стенках пробирки и промывной раствор можно будет легко и полностью удалить.

После промывания осажденный белок(ы) элюируют и анализируют с помощью гель-электрофореза , масс-спектрометрии , вестерн-блоттинга или любого количества других методов идентификации компонентов комплекса. Время протокола иммунопреципитации сильно различается из-за множества факторов: время протокола увеличивается с увеличением количества необходимых промываний или с более медленной кинетикой реакции пористых агарозных шариков.

Шаги

1. Лизируйте клетки и подготовьте образец для иммунопреципитации.
2. Предварительно очистите образец, пропустив его через шарики отдельно или связав с нерелевантным антителом, чтобы впитать любые белки, которые неспецифически связываются с компонентами IP.
3. Инкубируйте раствор с антителом против интересующего белка. Антитела могут быть прикреплены к твердой основе до этого этапа (прямой метод) или после этого этапа (непрямой метод). Продолжайте инкубацию, чтобы образовались комплексы антитело-антиген.
4. Осаждайте интересующий комплекс, удаляя его из основного раствора.
5. Выпавший комплекс промыть несколько раз. Каждый раз вращайте пробирку между промывками при использовании агарозных гранул или помещайте пробирку на магнит при использовании суперпарамагнитных гранул, а затем удаляйте супернатант. После окончательной промывки удалите как можно больше надосадочной жидкости.
6. Элюируйте белки с твердой подложки, используя буфер для загрузки образцов с низким pH или SDS.
7. Анализ комплексов или антигенов, представляющих интерес. Это можно сделать разными способами:
   1. SDS-PAGE геле с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном ( электрофорез ) с последующим окрашиванием в геле.
   2. SDS-PAGE с последующим окрашиванием геля, вырезанием отдельных полос окрашенного белка и секвенированием белков в полосах с помощью с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI) масс-спектрометрии .
   3. Перенос и вестерн-блоттинг с использованием другого антитела для белков, которые взаимодействовали с антигеном, с последующим обнаружением с использованием хемилюминесцентного или флуоресцентного вторичного антитела.

Внешние ссылки

• Анализ белков с использованием иммунопреципитации на сайте ufl.edu
• Иммунопреципитация Национальной медицинской библиотеки США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
• Хроматин + иммунопреципитация Национальной медицинской библиотеки США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
• Введение в методологию иммунопреципитации

Коиммунопреципитация (Co-IP) Техническая