Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони
Оухтерлони Двойная иммунодиффузия (также известная как пассивная двойная иммунодиффузия ) — это иммунологический метод, для обнаружения, идентификации и количественного определения антител используемый и антигенов , таких как иммуноглобулины и экстрагируемые ядерные антигены . Метод назван в честь Орьяна Оухтерлони , шведского врача, который разработал тест в 1948 году для оценки выработки дифтерийных токсинов изолированными бактериями. [ 1 ]
Процедура
[ редактировать ]геле образовался ряд отверстий («лунок») Гелевую пластинку разрезают так, чтобы в агаре или агарозном . Интересующий образец экстракта (например, человеческих клеток, собранных из ткани миндалин) помещают в одну лунку, сыворотку или очищенные антитела помещают в другую лунку и планшет оставляют на 48 часов для проявления. За это время антигены в экстракте образца и антитела диффундируют из соответствующих лунок. Там, где встречаются два диффузионных фронта, если какие-либо антитела узнают какой-либо антиген, они связываются с антигенами и образуют иммунный комплекс . Иммунный комплекс осаждается в геле с образованием тонкой белой линии (линии преципитации), которая является визуальным признаком распознавания антигена. [ нужна ссылка ] [ 2 ] [ 3 ]
Способ можно проводить параллельно с несколькими лунками, заполненными различными смесями антигенов, и множеством лунок с разными антителами или смесями антител, и реактивность антиген-антитело можно увидеть, наблюдая, между какими лунками наблюдается осадок. При использовании более чем одной лунки существует множество возможных результатов, основанных на реактивности выбранного антигена и антитела. Зона линий эквивалентности может давать полную идентичность (т. е. непрерывную линию), частичную идентичность (т. е. непрерывную линию с отрогом на одном конце) или нетождественность (т. е. две линии полностью пересекаются). [ нужна ссылка ]
Чувствительность анализа можно повысить, используя такой краситель, как бриллиантовый синий Кумасси . Это делается путем многократного окрашивания и обесцвечивания анализа до тех пор, пока линии преципитации не станут максимально видимыми. [ 1 ]
Теория
[ редактировать ]Преципитация происходит с большинством антигенов, поскольку антиген является поливалентным (т.е. имеет несколько антигенных детерминант на молекулу, с которыми могут связываться антитела). Антитела имеют как минимум два антигенсвязывающих сайта (а в случае иммуноглобулина М – мультимерный комплекс, содержащий до 10 антигенсвязывающих сайтов), при этом образуются крупные агрегаты или гелеобразные решетки антигена и антитела. Экспериментально к постоянному количеству антител в растворе добавляют возрастающее количество антигена. Первоначально при низкой концентрации антигена все антитела содержатся в осадке. Это называется зоной избытка антител (т.е. феноменом прозоны). По мере добавления большего количества антигена количество осаждаемого белка увеличивается до тех пор, пока молекулы антигена/антитела не достигнут оптимального соотношения. Это известно как зона эквивалентности или точка эквивалентности. Когда количество антигена в растворе превышает количество антител, количество осадка уменьшится. Это известно как зона избытка антигена.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Хорнбек, Питер (февраль 2017 г.). «Анализ двойной иммунодиффузии для обнаружения специфических антител (Охтерлони)». Современные протоколы в иммунологии . 116 (1): 2.3.1–2.3.4. дои : 10.1002/cpim.18 . ПМИД 28150863 . S2CID 35908711 .
- ^ Мотика, Эдвард Дж. (2015). Исторический взгляд на доказательную иммунологию . Эльзевир. п. 360. ИСБН 978-0-12-398381-7 .
- ^ Пол, Уильям Э., изд. (2008). «Иммунодиффузия и метод Охтерлони» . Фундаментальная иммунология (6-е изд.). Липпинкотт Уильямс и Уилкинс. стр. 176–177. ISBN 9780781765190 . п. 176 с. 177
- Бейли, Грэм С. (1996). «135: Двойная иммунодиффузия Охтерлони». У Уокера, Джон М. (ред.). Справочник по протеиновым протоколам . Справочники по протоколам Springer. Том. VII: Иммунохимические методы. Тотова, Нью-Джерси : Humana Press . стр. 749–752. дои : 10.1007/978-1-60327-259-9_135 . ISBN 978-0-89603-338-2 .
- Оухтерлони, Орьян (1948). «Метод in vitro проверки токсинпродуцирующей способности дифтерийных бактерий». АПМИС . 25 (1–2): 186–191. дои : 10.1111/j.1699-0463.1948.tb00655.x . ПМИД 18887479 .
- Охтерлони, Орьян (1949). «Реакции антиген-антитело в гелях». АПМИС . 26 (4): 507–515. дои : 10.1111/j.1699-0463.1949.tb00751.x . ПМИД 18143039 .
- Охтерлони, О. (1958). «Диффузионные методы иммунологического анализа». Прогресс в аллергии . 5 : 1–78. ПМИД 13578996 .
- Охтерлони, О. (1962). «Диффузионные методы иммунологического анализа. II». Прогресс в аллергии . 6 : 30–154. дои : 10.1159/000313795 . ПМИД 14482809 .
- Охтерлони, О.; Нильссон, Луизиана (1986). Вейр, Дэниел Маккей (ред.). Справочник по экспериментальной иммунологии . Том. 1. Иммунохимия (4-е изд.). Оксфорд , Англия : Blackwell Scientific . стр. 32,1–32,50. ISBN 9780632014996 . Проверено 23 ноября 2012 г. в Google Книгах
- «Анализ Охтерлони» (PDF) . Медицинская иммунология 544 . Калифорнийский университет, Медицинский колледж Ирвина . Осень 2011 г. Архивировано из оригинала (PDF) 7 февраля 2012 г. Проверено 23 ноября 2012 г.
- «Двойная диффузия Охтерлони — закономерности: теория» . Значение @ Амрита . Индия: Университет Амриты Вишвы Видьяпитама . 2012. Архивировано из оригинала 13 ноября 2012 г. Проверено 24 декабря 2012 г.
- «Двойная диффузия Охтерлони — закономерности: процедура» . Значение @ Амрита] . Индия: Университет Амриты Вишвы Видьяпитама . 2012. Архивировано из оригинала 14 января 2017 г. Проверено 24 декабря 2012 г.
- «Двойная диффузия Охтерлони - Титрование: теория» . Значение @ Амрита . Индия: Университет Амриты Вишвы Видьяпитама . 2012. Архивировано из оригинала 13 ноября 2012 г. Проверено 23 ноября 2012 г.
- «Двойная диффузия Охтерлони - титрование: процедура» . Ценность @ Амрита . Индия: Университет Амриты Вишвы Видьяпитама . 2012. Архивировано из оригинала 16 марта 2017 г. Проверено 24 декабря 2012 г.
- «BSCI423: Лаборатория 5. Осадки» . Колледж компьютерных, математических и естественных наук Мэрилендского университета, Колледж-Парк . Архивировано из оригинала 05 февраля 2012 г. Проверено 23 ноября 2012 г.
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Симулятор. Архивировано 22 мая 2007 г. в Wayback Machine . Калифорнийского университета в Ирвине
- «Двойная иммунодиффузия Охтерлони» (фотография) . Проверено 15 мая 2017 г. [ постоянная мертвая ссылка ] Фотография пластинки двойной иммунодиффузии Охтерлони с неокрашенными линиями преципитина полной идентичности и неидентичности.
- «Схемы диффузии» . Принципы и применение иммунодиффузии . Архивировано из оригинала 11 декабря 2019 г. Проверено 19 мая 2017 г. Фотографии образцов иммунодиффузии Оухтерлони, показывающие окрашенные линии преципитата полной идентичности, частичной идентичности и неидентичности.
- «Анализ Оухтерлони» . Ютуб . Лаборатории Био-Рад. 16 октября 2012 г.