Иммуноэлектрофорез
Иммуноэлектрофорез — общее название ряда биохимических методов разделения и характеристики белков, основанных на электрофорезе и реакции с антителами . Все варианты иммуноэлектрофореза требуют иммуноглобулинов , также известных как антитела , реагирующих с белками, которые необходимо разделить или охарактеризовать. Эти методы были разработаны и широко использовались во второй половине 20 века. В некотором хронологическом порядке: иммуноэлектрофоретический анализ (одномерный иммуноэлектрофорез ad modum Grabar), скрещенный иммуноэлектрофорез (двумерный количественный иммуноэлектрофорез ad modum Кларка и Фримена или ad modum Laurell), ракетный иммуноэлектрофорез (одномерный количественный иммуноэлектрофорез ad modum Laurell), гибридный ракетный иммуноэлектрофорез ad modum Свендсена и Харбо, аффинный иммуноэлектрофорез ad modum Бёга-Хансена.
Методы
[ редактировать ]Иммуноэлектрофорез — общий термин, описывающий множество комбинаций принципов электрофореза и реакции антител , также известный как иммунодиффузия. [1]
Агароза в виде пластинок 1% геля толщиной около 1 мм, забуференных при высоком pH (около 8,6), традиционно предпочтительна для электрофореза и реакции с антителами. Агароза была выбрана в качестве матрицы геля, поскольку она имеет большие поры, обеспечивающие свободное прохождение и разделение белков, но обеспечивает якорь для иммунопреципитатов белков и специфических антител. Высокий pH был выбран потому, что антитела практически неподвижны при высоком pH. Для электрофореза обычно рекомендуется оборудование для электрофореза с горизонтальной охлаждающей пластиной.
Иммунопреципитаты видны во влажном агарозном геле, но окрашиваются белковыми пятнами, такими как бриллиантовый синий Кумасси в высушенном геле. В отличие от электрофореза в ДСН-геле , электрофорез в агарозе обеспечивает нативные условия, сохраняя нативную структуру и активность исследуемых белков, поэтому иммуноэлектрофорез позволяет ферментов помимо электрофоретического разделения охарактеризовать активность , связывание лигандов и т. д.
Контриммуноэлектрофорез – это сочетание иммунодиффузии с электрофорезом. По сути, электрофорез ускоряет процесс объединения реагентов.
Иммуноэлектрофоретический анализ ad modum Grabar является классическим методом иммуноэлектрофореза. Белки разделяются электрофорезом, затем антитела наносятся в ванночку рядом с разделенными белками, и после периода диффузии разделенных белков и антител друг против друга образуются иммунопреципитаты. Внедрение иммуноэлектрофоретического анализа дало большой толчок развитию химии белков, одними из первых результатов стало разделение белков в биологических жидкостях и биологических экстрактах. Среди важных наблюдений было большое количество различных белков в сыворотке, существование нескольких классов иммуноглобулинов и их электрофоретическая гетерогенность.
Перекрестный иммуноэлектрофорез также называют двумерным количественным иммуноэлектрофорезом ad modum Clarke и Freeman или ad modum Laurell. В этом методе белки сначала разделяются во время электрофореза в первом измерении, затем вместо диффузии к антителам белки подвергаются электрофорезу в гель, содержащий антитела, во втором измерении. Иммунопреципитация будет происходить во время электрофореза второго измерения ииммунопреципитаты имеют характерную колоколообразную форму, каждый осадок представляет один антиген, причем положение осадка зависит от количества белка, а также количества специфических антител в геле, поэтому можно провести относительный количественный анализ. Чувствительность и разрешающая способность перекрестного иммуноэлектрофореза выше, чем у классического иммуноэлектрофоретического анализа, и существует множество вариантов этого метода, полезных для различных целей. Перекрестный иммуноэлектрофорез использовался для исследования белков в биологических жидкостях, особенно сыворотке человека и биологических экстрактах.
Ракетный иммуноэлектрофорез представляет собой одномерный количественный иммуноэлектрофорез. Этот метод использовался для количественного определения белков сыворотки крови человека до того, как стали доступны автоматизированные методы.
Иммуноэлектрофорез слитой ракеты представляет собой модификацию одномерного количественного иммуноэлектрофореза, используемую для детального измерения белков во фракциях в экспериментах по разделению белков.
Аффинный иммуноэлектрофорез основан на изменении электрофоретической картины белков за счет специфического взаимодействия или комплексообразования с другими макромолекулами или лигандами. Аффинный иммуноэлектрофорез использовался для оценки констант связывания , например, с лектинами , или для характеристики белков со специфическими характеристиками, такими как содержание гликанов или связывание лигандов . Некоторые варианты аффинного иммуноэлектрофореза аналогичны аффинной хроматографии за счет использования иммобилизованных лигандов .
Связывание лигандов. Открытая структура иммунопреципитата в агарозном геле позволит дополнительно связывать радиоактивно меченные антитела и другие лиганды для выявления специфических белков. Применение этой возможности использовалось, например, для идентификации аллергенов посредством реакции с иммуноглобулином Е (IgE) и для идентификации гликопротеинов с лектинами .
Общие комментарии. Два фактора определяют, что иммуноэлектрофоретические методы не получили широкого распространения. Во-первых, они довольно трудоемки и требуют некоторых ручных навыков. Во-вторых, они требуют довольно большого количества поликлональных антител. Сегодня гель-электрофорез с последующим электроблоттингом является предпочтительным методом характеристики белков из-за простоты использования, высокой чувствительности и низкой потребности в специфических антителах. Кроме того, белки разделяют с помощью гель-электрофореза на основе их кажущейся молекулярной массы, что не достигается с помощью иммуноэлектрофореза, но, тем не менее, иммуноэлектрофоретические методы все еще полезны, когда необходимы невосстанавливающие условия.
Приложения
[ редактировать ]Контриммуноэлектрофорез и его модификации.
По сравнению с другими традиционными методами диагностики, например, тестированием на вирусную инфекцию, противоиммуноэлектрофорез является высокоспецифичным, простым и быстрым методом, который не требует сложных, дорогих инструментов, исходных материалов или долгосрочного наращивания потенциала. Учитывая высокую информативность контриммуноэлектрофореза, результаты на практике порой могут быть сомнительными. В результате, используя изготовленный амфифильный флуоресцеин-содержащий сополимер для усиления взаимодействия антигена и антитела, можно улучшить процедуры противоиммуноэлектрофореза. Согласно полученным результатам, использование смеси сополимера флуоресцеина и антигена улучшило связь с уровнями антител в плазме животных, иммунизированных против геморрагической болезни, и увеличило концентрацию белка в преципитированной зоне. Способность амфифильного сополимера флуоресцеина усиливать ассоциацию антиген-антитело и видеть домен накопления флуоресценции может повысить эффективность контриммуноэлектрофореза для быстрой диагностики инфекционных заболеваний. [3]
Иммунометоды
Терминология, иммунные методы и иммунохимические методы относятся к различным процессам иммуноэлектрофореза, результаты которых идентифицируются с использованием антител и иммунологических методологий. [4] В результате высокая чувствительность иммунометодов является преимуществом по сравнению с большими затратами на использование антител. Чтобы увидеть, как белки перемещаются в различных обстоятельствах, используется множество различных типов агарозного электрофореза. Белки распознаются после истечения таймера путем инкубации гелей с определенными антителами, которые затем окрашиваются синим Комасси. [5]
Радиальная иммунодиффузия
Радиальная иммунодиффузия — это метод иммуноанализа для определения концентрации определенного белка в смеси, включающей другие модули. Он состоит из агарозного геля, как и другие. Кроме того, в этой процедуре материалы помещаются в круглые лунки в центральной части геля и диспергируются через него, образуя кольцо осаждения, диаметр которого зависит от количества диффундировавшего несвязанного белка. [4]
Идентификация взаимодействия наноматериала с белком комплемента C3 и 2D-иммуноэлектрофорез
2D-иммуноэлектрофорез — это потенциальный метод, который можно использовать для ряда функций, связанных с потоком белков мигрантов, таких как глубокое исследование опсонизации белков, последовательно первое измерение как активность молярной массы белка и второе измерение как роль изоэлектрическая точка. Несмотря на то, что в нем содержится большое количество белков, каждое пятно на 2D-геле будет символизировать конкретный белок с определенной молекулярной массой и свойством. [5]
2D-иммуноэлектрофорез также представляет собой ценный инструмент для изучения стимуляции пути передачи сигнала, который является важным фактором при исследовании наночастиц перед доставкой in vivo, поскольку он влияет на долговечность наночастиц, их место назначения и биораспределение. В этом методе используется двумерный электрофорез белков в горизонтальной агарозе для специфической идентификации ассоциации наночастиц с белком C3. Белки можно разделить в первом измерении по их молекулярной массе (чем короче белок, тем дальше он дрейфует), а во втором измерении - по их содержанию. [6]
Некоторые ограничения иммуноэлектрофореза
Хотя иммуноэлектрофорез имеет ряд преимуществ, он также имеет определенные недостатки, например, по сравнению с другими методами электрофореза, такими как иммунофиксация, этот метод медленный и менее точный. Интерпретировать результаты может быть сложно. Несколько крошечных моноклональных белков идентифицировать сложнее. Доступность конкретных антител ограничивает их применимость в аналитических методах. Традиционный (классический или традиционный) иммуноэлектрофорез имеет ряд недостатков, в том числе тот факт, что он требует много времени и протокол может занять до 3 дней, имеет ограниченную специфичность и чувствительность, а результаты могут быть трудно читаемыми. В результате новые методы иммуноэлектрофореза в значительной степени вытеснили традиционный иммуноэлектрофорез.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Хомбургер, Генри А.; Сингх, Равиндер Джит (2008). «96 – Оценка белков иммунной системы». В Риче, Роберт Р.; Флейшер, Томас А.; Ширер, Уильям Т.; Шредер-младший, Гарри В.; Фрю, Энтони Дж.; Вейанд, Корнелия М. (ред.). Клиническая иммунология: принципы и практика (3-е изд.). Эльзевир. стр. 1419–1434. дои : 10.1016/b978-0-323-04404-2.10096-x . ISBN 9780323044042 .
- ^ Линг И.Т.; Куксли С.; Бейтс, Пенсильвания; Хемпельманн Э.; Уилсон Р.Дж.М. (1986). «Антитела к глутаматдегидрогеназе Plasmodium falciparum » (PDF) . Паразитология . 92 (2): 313–324. дои : 10.1017/s0031182000064088 . ПМИД 3086819 . S2CID 16953840 . Проверено 10 ноября 2022 г.
- ^ Остапив, Д.Д.; Кузьмина, Н.В.; Козак, М.Р.; Ху, Шан; Влизло, В.В.; Коциумбас, И.Я.; Варваренко С.М.; Самарик В.Я.; Носова, Н.Г.; Яковив, М.В. (2021). «Применение сополимера флуоресцеина для повышения эффективности контриммуноэлектрофореза в диагностике инфекционных болезней животных» . Украинский биохимический журнал . 93 (1): 104–112. дои : 10.15407/ubj93.01.104 . S2CID 233915465 .
- ^ Jump up to: а б Вотье, Кристина; Бушемаль, Каутар (24 декабря 2008 г.). «Методы получения и производства полимерных наночастиц» . Фармацевтические исследования . 26 (5): 1025–1058. дои : 10.1007/s11095-008-9800-3 . ISSN 0724-8741 . ПМИД 19107579 . S2CID 22199493 .
- ^ Jump up to: а б Форнагера, Кристина; Соланс, Конксита (27 января 2017 г.). «Методы характеристики нанопрепаратов in vitro — взаимодействие биологических компонентов» . Журнал персонализированной медицины . 7 (1): 2. дои : 10.3390/jpm7010002 . ISSN 2075-4426 . ПМЦ 5374392 . ПМИД 28134833 .
- ^ Бертолон, Изабель; Вотье, Кристина; Лабарр, Дени (25 мая 2006 г.). «Активация комплемента с помощью наночастиц поли(изобутилцианоакрилата)-полисахарида ядро-оболочка: влияние морфологии поверхности, длины и типа полисахарида». Фармацевтические исследования . 23 (6): 1313–1323. дои : 10.1007/s11095-006-0069-0 . ISSN 0724-8741 . ПМИД 16715369 . S2CID 30404102 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Полный текст под редакцией Нильса Х. Аксельсена в Скандинавском журнале иммунологии, 1975 г., Приложение к тому 4.
- Иммуноэлектрофорез в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
- https://web.archive.org/web/20070612225626/http://www.lib.mcg.edu/edu/esimmuno/ch4/immelec.htm
- Иммуно-электрофорез. Иммунодиффузия. Архивировано 20 декабря 2011 г. в Wayback Machine.
| Базы данных органов управления : Национальные |
|---|
