Чип на чипе
ChIP-on-chip (также известный как ChIP-chip ) — это технология, сочетающая иммунопреципитацию хроматина («ChIP») с микрочипом ДНК ( «чип» ). Как и обычный ChIP , ChIP-on-chip используется для исследования взаимодействий между белками и ДНК in vivo . В частности, он позволяет идентифицировать цистром , сумму сайтов связывания , для ДНК-связывающих белков на уровне всего генома. [1] Полногеномный анализ может быть выполнен для определения местоположения сайтов связывания практически любого интересующего белка. [1] Как следует из названия метода, такие белки обычно действуют в контексте хроматина . Наиболее яркими представителями этого класса являются факторы транскрипции , репликацией белки, связанные с , такие как белок комплекса распознавания происхождения (ORC), гистоны , их варианты и модификации гистонов.
Целью ChIP-на-чипе является обнаружение сайтов связывания белков, которые могут помочь идентифицировать функциональные элементы в геноме . Например, в случае транскрипционного фактора как представляющего интерес белка можно определить его сайты связывания с транскрипционным фактором по всему геному. Другие белки позволяют идентифицировать промоторные области , энхансеры , репрессоры и элементы молчания , инсуляторы , пограничные элементы и последовательности, которые контролируют репликацию ДНК. [2] Если гистоны представляют интерес, считается, что распределение модификаций и их локализация могут дать новое понимание механизмов регуляции .
Одной из долгосрочных целей, для которых был разработан ChIP-на-чипе, является создание каталога (избранных) организмов, в котором перечислены все взаимодействия белок-ДНК в различных физиологических условиях. Эти знания в конечном итоге помогут понять механизмы, лежащие в основе регуляции генов, пролиферации клеток и прогрессирования заболеваний. Следовательно, ChIP-на-чипе предлагает как потенциал, дополняющий наши знания об оркестровке генома на уровне нуклеотидов, так и информацию о более высоких уровнях информации и регуляции, распространяемую исследованиями в области эпигенетики .
Технологические платформы
[ редактировать ]Технической платформой для проведения экспериментов «ЧИП-на-чипе» являются микрочипы ДНК , или «чипы» . Их можно классифицировать и различать по различным признакам:
Тип зонда : массивы ДНК могут включать либо механически нанесенные кДНК , либо ПЦР-продукты , механически нанесенные олигонуклеотиды или олигонуклеотиды, синтезированные in situ . Ранние версии микрочипов были разработаны для обнаружения РНК из экспрессируемых геномных областей ( открытых рамок считывания, также известных как ORF). Хотя такие массивы идеально подходят для изучения профилей экспрессии генов , они имеют ограниченное значение в экспериментах с ChIP, поскольку большинство «интересных» белков с точки зрения этого метода связываются в межгенных областях . В настоящее время даже изготовленные по индивидуальному заказу массивы можно спроектировать и настроить в соответствии с требованиями эксперимента. Кроме того, можно синтезировать любую последовательность нуклеотидов, охватывающую как генные, так и межгенные области.
Размер зонда : ранние версии массивов кДНК имели длину зонда около 200 пар оснований. В последних версиях массивов используются олигонуклеотиды длиной от 70 (Microarrays, Inc.) до 25-меров ( Affymetrix ). (февраль 2007 г.)
Состав зонда : Существуют плиточные и неплиточные массивы ДНК. В неплиточных массивах используются зонды, выбранные в соответствии с непространственными критериями, т.е. последовательности ДНК, используемые в качестве зондов, не имеют фиксированных расстояний в геноме. Однако мозаичные массивы выбирают геномную область (или даже целый геном) и делят ее на равные фрагменты. Такая область называется мозаичным путем. Среднее расстояние между каждой парой соседних фрагментов (измеренное от центра каждого фрагмента) дает разрешение мозаичного пути. Путь может быть перекрывающимся, сквозным или разделенным. [3]
Размер массива : первые микрочипы, использованные для ChIP-on-Chip, содержали около 13 000 пятнистых сегментов ДНК, представляющих все ORF и межгенные области генома дрожжей. [2] В настоящее время Affymetrix предлагает полногеномные дрожжевые массивы с разрешением 5 пар оснований (всего 3,2 миллиона зондов). Плиточные массивы человеческого генома также становятся все более мощными. В качестве одного из примеров: Affymetrix предлагает набор из семи массивов, содержащих около 90 миллионов зондов, охватывающих всю неповторяющуюся часть человеческого генома с интервалом около 35 пар оснований. (февраль 2007 г.) Помимо самого микрочипа, для проведения экспериментов «ЧИП-на-чипе» необходимо другое аппаратное и программное оборудование. Обычно микрочипы одной компании не могут быть проанализированы обрабатывающим оборудованием другой компании. Следовательно, покупка массива требует также покупки соответствующего оборудования для рабочих процессов. Наиболее важными элементами являются, среди прочего, печи гибридизации, сканеры чипов и пакеты программного обеспечения для последующего численного анализа необработанных данных.
Рабочий процесс эксперимента «ЧИП-на-чипе»
[ редактировать ]Начиная с биологического вопроса, эксперимент «ЧИП-на-чипе» можно разделить на три основных этапа: первый — это постановка и планирование эксперимента путем выбора подходящего массива и типа зонда. Во-вторых, настоящий эксперимент проводится в «мокрой» лаборатории. Наконец, во время сухой лабораторной части цикла собранные данные анализируются, чтобы либо ответить на первоначальный вопрос, либо привести к появлению новых вопросов, чтобы цикл можно было начать заново.
Мокрая лабораторная часть рабочего процесса
[ редактировать ]
На первом этапе интересующий белок (POI) сшивается с участком ДНК, с которым он связывается, в среде in vitro . Обычно это делается путем мягкой фиксации формальдегидом , обратимой при нагревании.
Затем клетки лизируют , а ДНК разрезают ультразвуком или с использованием микрококковой нуклеазы . В результате образуются двухцепочечные фрагменты ДНК, обычно длиной 1 т.п.н. или меньше. Те, которые были сшиты с POI, образуют комплекс POI-ДНК.
На следующем этапе из набора фрагментов ДНК отфильтровываются только эти комплексы с использованием антитела , специфичного к POI. Антитела могут быть прикреплены к твердой поверхности, могут иметь магнитные шарики или какое-либо другое физическое свойство, позволяющее разделять сшитые комплексы и несвязанные фрагменты. Эта процедура по существу представляет собой иммунопреципитацию (ИП) белка. Это можно сделать либо с помощью меченого белка с антителом против метки (например, FLAG , HA , c-myc), либо с антителом к нативному белку.
Сшивка комплексов POI-ДНК обращается вспять (обычно путем нагревания), и цепи ДНК очищаются. Для остальной части рабочего процесса POI больше не нужен.
После этапа амплификации и денатурации одноцепочечные фрагменты ДНК метят флуоресцентной меткой, такой как Cy5 или Alexa 647.
Наконец, фрагменты разливаются по поверхности микроматрицы ДНК, которая покрыта короткими одноцепочечными последовательностями, покрывающими интересующую часть генома. Всякий раз, когда меченый фрагмент «находит» комплементарный фрагмент на матрице, они гибридизуются и снова образуют двухцепочечный фрагмент ДНК.
Часть рабочего процесса в сухой лаборатории
[ редактировать ]
По истечении достаточно большого периода времени, чтобы обеспечить возможность гибридизации, матрицу освещают флуоресцентным светом. Те зонды на матрице, которые гибридизированы с одним из меченых фрагментов, излучают световой сигнал, который фиксируется камерой. Это изображение содержит все необработанные данные для оставшейся части рабочего процесса.
Эти необработанные данные, закодированные как изображение в искусственных цветах , необходимо преобразовать в числовые значения, прежде чем можно будет провести фактический анализ. Анализ и извлечение информации из необработанных данных часто остается самой сложной частью экспериментов «чип-на-чипе». Проблемы возникают на этом этапе рабочего процесса, начиная от первоначального считывания данных с чипа и заканчивая подходящими методами вычитания фонового шума и, наконец, соответствующими алгоритмами , которые нормализуют данные и делают их доступными для последующего статистического анализа , что, как мы надеемся, затем приведет к лучшее понимание биологического вопроса, на решение которого направлен эксперимент. Кроме того, из-за различных платформ массивов и отсутствия стандартизации между ними хранение и обмен данными представляет собой огромную проблему. Вообще говоря, анализ данных можно разделить на три основных этапа:
На первом этапе захваченные сигналы флуоресценции из массива нормализуются с использованием управляющих сигналов, полученных от того же или второго чипа. Такие контрольные сигналы сообщают, какие зонды на матрице гибридизовались правильно, а какие связались неспецифично.
На втором этапе численные и статистические тесты применяются к контрольным данным и данным фракции IP для выявления областей генома, обогащенных POI. Широко используются следующие три метода: средний процентильный ранг , ошибка одного массива и скользящее окно . Эти методы обычно различаются тем, как обрабатываются сигналы низкой интенсивности, сколько принимается фонового шума и какие характеристики данных подчеркиваются во время вычислений. В недавнем прошлом подход «скользящего окна», по-видимому, получил предпочтение и часто описывается как наиболее эффективный.
На третьем этапе эти регионы анализируются дальше. Если бы, например, POI был фактором транскрипции, такие области представляли бы собой сайты его связывания. Последующий анализ может затем вывести нуклеотидные мотивы и другие закономерности, чтобы обеспечить функциональную аннотацию генома. [4]
Сильные и слабые стороны
[ редактировать ]Используя мозаичные массивы , ChIP -on-chip позволяет создавать карты всего генома с высоким разрешением. Эти карты могут определять сайты связывания многих ДНК-связывающих белков, таких как факторы транскрипции, а также модификации хроматина.
Хотя технология «ЧИП-на-чипе» может быть мощным методом в области геномики, она очень дорогая. В большинстве опубликованных исследований с использованием ChIP-на-чипе эксперименты повторяются как минимум три раза, чтобы получить биологически значимые карты. Стоимость микрочипов ДНК часто является ограничивающим фактором для того, следует ли лаборатории проводить эксперимент «ЧИП-на-чипе». Еще одним ограничением является размер достижимых фрагментов ДНК. Большинство протоколов «ЧИП-на-чипе» используют ультразвуковую обработку как метод разделения ДНК на мелкие кусочки. Однако обработка ультразвуком ограничена минимальным размером фрагмента в 200 п.н. Для карт с более высоким разрешением это ограничение следует преодолеть для достижения меньших фрагментов, предпочтительно до разрешения одной нуклеосомы . Как упоминалось ранее, статистический анализ огромного количества данных, полученных с помощью массивов, является сложной задачей, и процедуры нормализации должны быть направлены на минимизацию артефактов и определение того, что действительно является биологически значимым. До сих пор применение к геномам млекопитающих было серьезным ограничением, например, из-за значительного процента генома, занятого повторами. Однако по мере развития технологии ChIP-on-Chip должны стать достижимыми карты всего генома млекопитающих с высоким разрешением.
Антитела, используемые для ChIP -on-chip, могут быть важным ограничивающим фактором. ChIP -on-chip требует высокоспецифичных антител, которые должны распознавать его эпитоп как в свободном растворе, так и в фиксированных условиях. Если будет продемонстрировано, что он успешно иммунопреципитирует сшитый хроматин , его называют « ChIP-классом ». Компании, предоставляющие антитела класса ChIP, включают Abcam , Cell Signaling Technology , Santa Cruz и Upstate. Чтобы преодолеть проблему специфичности, интересующий белок можно слить с меткой, такой как FLAG или HA , которая распознается антителами. Альтернативой ChIP-on-chip, не требующей антител, является DamID .
Также доступны антитела против специфической модификации гистона, такой как H3 триметил К4 . Как упоминалось ранее, комбинация этих антител и ChIP-на-чипе стала чрезвычайно мощной при определении полногеномного анализа паттернов модификации гистонов и внесет огромный вклад в наше понимание кода гистонов и эпигенетики.
Исследование, демонстрирующее неспецифическую природу ДНК-связывающих белков, было опубликовано в журнале PLoS Biology. Это указывает на то, что альтернативное подтверждение функциональной значимости является необходимым шагом в любом эксперименте с ЧИП-чипом. [5]
История
[ редактировать ]Первый эксперимент «ChIP-на-чипе» был проведен в 1999 году для анализа распределения когезина вдоль хромосомы III почкующихся дрожжей . [6] Хотя геном не был полностью представлен, протокол этого исследования остается эквивалентным тем, которые использовались в более поздних исследованиях. Методика «ЧИП-на-чипе», использующая все ORF генома (которые, тем не менее, остаются неполными, с отсутствующими межгенными участками), была затем успешно применена в трех статьях, опубликованных в 2000 и 2001 годах. [7] [8] [9] Авторы идентифицировали сайты связывания отдельных факторов транскрипции у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae . В 2002 году группа Ричарда Янга [10] определили положения 106 транскрипционных факторов по всему геному, используя систему мечения c-Myc у дрожжей. Первая демонстрация метода ChIp-on-chip млекопитающих, сообщающая об выделении девяти фрагментов хроматина, содержащих слабый и сильный сайт связывания E2F, была проведена лабораторией Пегги Фарнхэм в сотрудничестве с лабораторией Майкла Чжана и опубликована в 2001 году. [11] За этим исследованием последовали несколько месяцев спустя в сотрудничестве лаборатории Янга с лабораторией Брайана Динлахта, которая использовала технику ChIP-на-чипе, чтобы впервые показать, что мишени E2F кодируют компоненты контрольной точки повреждения ДНК и путей восстановления, как а также факторы, участвующие в сборке/конденсации хроматина, сегрегации хромосом и контрольной точке митотического веретена. [12] Другие применения ChIP-на-чипе включают репликацию ДНК , рекомбинацию и структуру хроматина. С тех пор ChIP-на-чипе стал мощным инструментом для определения полногеномных карт модификаций гистонов и многих других факторов транскрипции. Внедрение чипа на чипе в системах млекопитающих было затруднено из-за больших и повторяющихся геномов. Таким образом, многие исследования в клетках млекопитающих были сосредоточены на избранных областях промотора, которые, как предполагается, связывают факторы транскрипции, и не анализировали весь геном. Однако недавно целые массивы геномов млекопитающих стали коммерчески доступны от таких компаний, как Nimblegen. В будущем, когда массивы ChIP-на-чипе станут все более совершенными, карты всего генома высокого разрешения ДНК-связывающих белков и компонентов хроматина млекопитающих будут анализироваться более подробно.
Альтернативы
[ редактировать ]Представленная в 2007 году технология ChIP-секвенирования (ChIP-seq) представляет собой технологию, которая использует иммунопреципитацию хроматина для сшивания интересующих белков с ДНК, но затем вместо использования микроматрицы используется более точный и высокопроизводительный метод секвенирования для локализации точки взаимодействия. [13]
DamID — альтернативный метод, не требующий антител.
ChIP-exo использует обработку экзонуклеазой для достижения разрешения до одной пары оснований.
Секвенирование CUT&RUN использует распознавание антител с целевым ферментативным расщеплением, чтобы устранить некоторые технические ограничения ChIP.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Апарисио, О; Гейсберг, СП; Струл, К. (2004). «Имунопреципитация хроматина для определения ассоциации белков со специфическими геномными последовательностями in vivo ». Современные протоколы клеточной биологии . Том. Глава 17. Университет Южной Калифорнии, Лос-Анджелес, Калифорния, США: John Wiley & Sons, Inc., стр. Раздел 17.7. дои : 10.1002/0471143030.cb1707s23 . ISBN 978-0-471-14303-1 . ISSN 1934-2616 . ПМИД 18228445 . S2CID 30456067 .
- ^ Jump up to: а б Бак, MJ; Либ, JD (2004). «ЧИП-чип: соображения по разработке, анализу и применению экспериментов по полногеномной иммунопреципитации хроматина». Геномика . 83 (3): 349–360. дои : 10.1016/j.ygeno.2003.11.004 . ПМИД 14986705 .
- ^ Ройс, TE; Розовский, Дж.С.; Бертоне, П.; Саманта, М.; Столц, В.; Вайсман, С.; Снайдер, М.; Герштейн, М. (2005). «Проблемы анализа микрочипов тайлинга олигонуклеотидов для картирования транскриптов» . Тенденции в генетике . 21 (8): 466–475. дои : 10.1016/j.tig.2005.06.007 . ПМК 1855044 . ПМИД 15979196 .
- ^ «Ядро биомедицинской геномики - Научно-исследовательский институт Национальной детской больницы» . genomics.nchresearch.org .
- ^ Ли, Сяо-Юн; Макартур, Стюарт; Бургон, Ричард; Никс, Дэвид; Поллард, Дэниел А.; Айер, Венки Н.; Хехмер, Аарон; Симиренко, Лиза; Стэплтон, Марк; Хендрикс, Крис Л. Луенго; Чу, Хоу Ченг; Огава, Нобуо; Инвуд, Уильям; Семенченко Виктор; Битон, Эми; Вайсманн, Ричард; Селникер, Сьюзен Э.; Ноулз, Дэвид В.; Джингерас, Том; Скорость, Теренс П.; Эйзен, Майкл Б.; Биггин, Марк Д. (2008). «Факторы транскрипции связывают тысячи активных и неактивных областей в бластодерме дрозофилы» . ПЛОС Биология . 6 (2): е27. doi : 10.1371/journal.pbio.0060027 . ПМК 2235902 . ПМИД 18271625 .
- ^ Блат, Ю.; Клекнер, Н. (1999). «Когезины связываются с предпочтительными участками на дрожжевой хромосоме III с дифференциальной регуляцией вдоль плеч по сравнению с центральной областью» . Клетка . 98 (2): 249–259. дои : 10.1016/s0092-8674(00)81019-3 . ПМИД 10428036 . S2CID 4689446 .
- ^ Либ, доктор медицинских наук; Лю, X.; Ботштейн, Д.; Браун, ПО (2001). «Промотор-специфическое связывание Rap1, выявленное с помощью полногеномных карт ассоциации белок-ДНК». Природная генетика . 28 (4): 327–334. дои : 10.1038/ng569 . ПМИД 11455386 . S2CID 6707334 .
- ^ Рен, Б.; Роберт, Ф.; Вайрик, Джей-Джей; Апарисио, О.; Дженнингс, Е.Г.; Саймон, И.; Цайтлингер, Дж.; Шрайбер, Дж.; Ханнетт, Н.; Канин, Э.; Волкерт, ТЛ; Уилсон, CJ; Белл, СП; Янг, Р.А. (2000). «Полногеномное расположение и функция ДНК-связывающих белков». Наука . 290 (5500): 2306–2309. Бибкод : 2000Sci...290.2306R . дои : 10.1126/science.290.5500.2306 . ПМИД 11125145 .
- ^ Айер, ВР; Горак, CE; Скаф, CS; Ботштейн, Д.; Снайдер, М.; Браун, ПО (2001). «Геномные сайты связывания факторов транскрипции клеточного цикла дрожжей SBF и MBF». Природа . 409 (6819): 533–538. Бибкод : 2001Natur.409..533I . дои : 10.1038/35054095 . ПМИД 11206552 . S2CID 6440664 .
- ^ Ли, ТИ; Ринальди, Нью-Джерси; Роберт, Ф.; Одом, DT; Бар-Джозеф, З.; Гербер, ГК; Ханнетт, Нью-Мексико; Харбисон, Коннектикут; Томпсон, CM; Саймон, И.; Цайтлингер, Дж.; Дженнингс, Е.Г.; Мюррей, Х.Л.; Гордон, Д.Б.; Рен, Б.; Вайрик, Джей-Джей; Тань, Дж.Б.; Волкерт, ТЛ; Френкель, Э.; Гиффорд, Дания; Янг, Р.А. (2002). «Сети регуляции транскрипции у Saccharomyces cerevisiae». Наука . 298 (5594): 799–804. Бибкод : 2002Sci...298..799L . дои : 10.1126/science.1075090 . ПМИД 12399584 . S2CID 4841222 .
- ^ Вайнманн, А.С.; Бартли, С.М.; Чжан, Т.; Чжан, MQ; Фарнхэм, Пи Джей (2001). «Использование иммунопреципитации хроматина для клонирования новых промоторов-мишеней E2F» . Молекулярная и клеточная биология . 21 (20): 6820–6832. дои : 10.1128/MCB.21.20.6820-6832.2001 . ПМК 99859 . ПМИД 11564866 .
- ^ Рен, Б.; Кэм, Х.; Такахаши, Ю.; Волкерт, Т.; Терраньи, Дж.; Янг, РА; Динлахт, Б.Д. (2002). «E2F объединяет развитие клеточного цикла с восстановлением ДНК, репликацией и контрольными точками G (2) / M» . Гены и развитие . 16 (2): 245–256. дои : 10.1101/gad.949802 . ПМК 155321 . ПМИД 11799067 .
- ^ Джонсон, Дэвид С.; Мортазави, Али; Майерс, Ричард М.; Уолд, Барбара (8 июня 2007 г.). «Полногеномное картирование взаимодействий белка и ДНК in vivo» . Наука . 316 (5830): 1497–1502. Бибкод : 2007Sci...316.1497J . дои : 10.1126/science.1141319 . ПМИД 17540862 . S2CID 519841 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Джонсон, МЫ; Ли, В.; Мейер, Калифорния; Готтардо, Р.; Кэрролл, Дж. С.; Браун, М.; Лю, XS (2006). «Модельно-ориентированный анализ тайлинг-массивов для ChIP-чипа» . Труды Национальной академии наук . 103 (33): 12457–12462. Бибкод : 2006PNAS..10312457J . дои : 10.1073/pnas.0601180103 . ISSN 0027-8424 . ПМЦ 1567901 . ПМИД 16895995 .
- Бенукраф, Туати ; Коши, Пьер; Фенхель, Ромен; Жаньяр, Адриан; Кох, Фредерик; Жегер, Себастьен; Тиффри, Денис; Имбер, Жан; Андрау, Жан-Кристоф; Спикоглиа, Сальваторе; Ферье, Пьер (2009). «CoCAS: пакет анализа ChIP-on-Chip» . Биоинформатика . 25 (7): 954–955. doi : 10.1093/биоинформатика/btp075 . ISSN 1460-2059 . ПМК 2660873 . ПМИД 19193731 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- http://www.genome.gov/10005107 Проект ENCODE
- Информация о пакете чип-на-чипе (CoC) от Amkor Technology