Мозаичный массив
Тайлинговые массивы представляют собой подтип микрочипов . Как и традиционные микрочипы, они функционируют путем гибридизации меченых молекул-мишеней ДНК или РНК с зондами, закрепленными на твердой поверхности.
Тайлинговые массивы отличаются от традиционных микрочипов природой зондов. Вместо поиска последовательностей известных или предсказанных генов, которые могут быть рассеяны по всему геному , мозаичные массивы интенсивно исследуют последовательности, о существовании которых известно в смежной области. Это полезно для характеристики областей, которые секвенированы, но чьи локальные функции в значительной степени неизвестны. Массивы тайлинга помогают картировать транскриптом , а также обнаруживать сайты взаимодействия ДНК/ белка ( ChIP-чип , DamID ДНК ), метилирования (MeDIP-чип) и чувствительности к ДНКазе (DNase Chip) и массив CGH. [1] Помимо обнаружения ранее неидентифицированных генов и регуляторных последовательностей, возможно улучшение количественного определения продуктов транскрипции. Конкретные зонды присутствуют в миллионах копий (в отличие от нескольких в традиционных массивах) внутри единицы массива, называемой объектом, причем в каждом массиве содержится от 10 000 до более 6 000 000 различных функций. [2] Переменное разрешение картирования можно получить путем регулирования степени перекрытия последовательностей между зондами или количества известных пар оснований между последовательностями зондов, а также длины зонда. Для меньших геномов, таких как Arabidopsis , можно исследовать целые геномы. [3] Тайлинговые массивы — полезный инструмент для полногеномных исследований ассоциаций .
Синтез и производители
[ редактировать ]Двумя основными способами синтеза массивов мозаики являются фотолитографическое производство и механическое нанесение или печать.
Первый метод включает синтез in situ , при котором зонды размером примерно 25 пар оснований строятся на поверхности чипа. Эти массивы могут содержать до 6 миллионов дискретных объектов, каждый из которых содержит миллионы копий одного зонда.
Другой способ синтеза чипов мозаичного массива — механическая печать датчиков на чипе. Это делается с помощью автоматизированных машин со штифтами, которые размещают на поверхности ранее синтезированные зонды. Из-за ограничения размера контактов эти чипы могут содержать до 400 000 функций. [4] Тремя производителями тайлинговых массивов являются Affymetrix , NimbleGen и Agilent . Их продукция различается по длине зонда и расстоянию между ними. ArrayExplorer.com — бесплатный веб-сервер для сравнения тайловых массивов.
Приложения и типы
[ редактировать ]
Чип-чип
[ редактировать ]Чип-чип — один из самых популярных вариантов использования тайловых массивов. Иммунопреципитация хроматина сайты связывания белков позволяет идентифицировать . Полногеномный вариант известен как ChIP-on-chip. Белки, которые связываются с хроматином , сшиваются in vivo , обычно посредством фиксации формальдегидом . Затем хроматин фрагментируется и подвергается воздействию антител, специфичных к интересующему белку. Эти комплексы затем осаждаются. Затем ДНК выделяют и очищают. При использовании традиционных микрочипов ДНК иммунопреципитированная ДНК гибридизуется с чипом, который содержит зонды, предназначенные для покрытия репрезентативных областей генома. Можно использовать перекрывающиеся датчики или датчики, расположенные очень близко. Это дает объективный анализ с высоким разрешением. Помимо этих преимуществ, массивы тайлинга демонстрируют высокую воспроизводимость, а с перекрывающимися зондами, охватывающими большие сегменты генома, массивы тайлинга могут опрашивать сайты связывания белков, которые содержат повторы. Эксперименты с ChIP-чипами позволили идентифицировать сайты связывания факторов транскрипции по всему геному у дрожжей, дрозофилы и некоторых видов млекопитающих. [5]
Картирование транскриптома
[ редактировать ]Другое популярное применение тайлинговых массивов — поиск экспрессируемых генов. Традиционные методы прогнозирования генов для аннотации геномных последовательностей имели проблемы при использовании для картирования транскриптома, например, не создавали точную структуру генов, а также полностью отсутствовали транскрипты. Метод секвенирования кДНК для поиска транскрибируемых генов также сталкивается с проблемами, такими как неспособность обнаружить редкие или очень короткие молекулы РНК и, следовательно, не обнаруживать гены, которые активны только в ответ на сигналы или специфичны для определенных временных рамок. Тайлинговые массивы могут решить эти проблемы. Благодаря высокому разрешению и чувствительности можно обнаружить даже небольшие и редкие молекулы. Перекрывающаяся природа зондов также позволяет обнаруживать неполиаденилированную РНК и давать более точную картину структуры гена. [6] Более ранние исследования хромосом 21 и 22 показали эффективность мозаичных массивов для идентификации единиц транскрипции. [7] [8] [9] Авторы использовали 25-мерные зонды, расположенные на расстоянии 35 пар оснований друг от друга и охватывающие всю хромосому. Меченые мишени были изготовлены из полиаденилированной РНК. Они обнаружили гораздо больше транскриптов, чем предполагалось, и 90% из них находились за пределами аннотированных экзонов . В другом исследовании Arabidopsis использовались массивы олигонуклеотидов высокой плотности , покрывающие весь геном. Было обнаружено более чем в 10 раз больше транскриптов, чем предсказывали EST. [ нужны разъяснения ] и другие инструменты прогнозирования. [3] [10] Также были обнаружены новые транскрипты в центромерных регионах, где, как считалось, гены не экспрессируются активно. Многие некодирующие и природные антисмысловые РНК были идентифицированы с использованием массивов мозаики. [9]
MeDIP-чип
[ редактировать ]Иммунопреципитация метил-ДНК с последующим укладыванием массива позволяет картировать и измерять метилирование ДНК по всему геному. ДНК метилирована по цитозину в динуклеотидах CG во многих местах генома. Эта модификация является одним из наиболее изученных наследственных эпигенетических изменений и, как показано, влияет на экспрессию генов. Картирование этих сайтов может расширить знания об экспрессируемых генах, а также об эпигенетической регуляции на уровне всего генома. Исследования массива плиток позволили создать карты метилирования с высоким разрешением для генома Arabidopsis, что позволило создать первый «метилом».
ДНКаза-чип
[ редактировать ]ДНКазный чип — это применение мозаичных массивов для идентификации сверхчувствительных участков, сегментов открытого хроматина, которые легче расщепляются DNaseI. Расщепление DNaseI приводит к образованию более крупных фрагментов размером около 1,2 КБ. Было показано, что эти сверхчувствительные сайты точно предсказывают регуляторные элементы, такие как области промотора, энхансеры и сайленсеры. [11] Исторически сложилось так, что этот метод использует Саузерн-блоттинг для поиска переваренных фрагментов. Тайлинговые массивы позволили исследователям применить эту технику в масштабе всего генома.
Сравнительная геномная гибридизация (CGH)
[ редактировать ]CGH на основе массивов — это метод, часто используемый в диагностике для сравнения различий между типами ДНК, например, нормальных и раковых клеток. Для массива CGH обычно используются два типа мозаичных массивов: полный геном и мелкая плитка. Весь геномный подход был бы полезен для выявления вариаций числа копий с высоким разрешением. С другой стороны, CGH с мелкими фрагментами массива обеспечит сверхвысокое разрешение для обнаружения других аномалий, таких как точки останова. [12]
Процедура
[ редактировать ]
Существует несколько различных методов разбиения массива на плитки. Один из протоколов анализа экспрессии генов включает сначала выделение тотальной РНК. Затем его очищают от молекул рРНК. РНК копируется в двухцепочечную ДНК, которая впоследствии амплифицируется и транскрибируется in vitro в кРНК. Продукт разделяется на три экземпляра для получения дцДНК, которую затем фрагментируют и метят. Наконец, образцы гибридизируются с чипом массива мозаики. Сигналы чипа сканируются и интерпретируются компьютерами.
Для анализа данных доступны различные программы и алгоритмы, преимущества которых различаются в зависимости от производителя чипа. Для чипов Affymetrix можно использовать модельный анализ массива мозаики (MAT) или гипергеометрический анализ массивов мозаики (HAT). [13] ) являются эффективными алгоритмами поиска пиков. Для чипов NimbleGen TAMAL больше подходит для обнаружения сайтов связывания. Альтернативные алгоритмы включают MA2C и TileScope, которые менее сложны в использовании. Алгоритм деконволюции привязки соединения обычно используется для чипов Agilent. Если требуется анализ последовательности сайта связывания или аннотация генома, такие программы, как MEME, Gibbs Motif Sampler, система аннотации цис-регуляторных элементов и Galaxy . используются [4]
Преимущества и недостатки
[ редактировать ]Массивы плиток предоставляют беспристрастный инструмент для исследования связывания белков, экспрессии генов и структуры генов на уровне всего генома. Они позволяют выйти на новый уровень понимания транскриптома и метилома.
К недостаткам можно отнести стоимость комплектов плиточного массива. Хотя за последние несколько лет цены упали, они делают непрактичным использование полногеномных массивов мозаики для млекопитающих и других крупных геномов. Другая проблема — «транскрипционный шум», создаваемый его сверхчувствительной способностью обнаружения. [2] Более того, этот подход не обеспечивает четко определенного начала или остановки интересующих областей, определенных массивом. Наконец, массивы обычно дают только номера хромосом и позиций, что часто требует секвенирования как отдельного этапа (хотя некоторые современные массивы действительно предоставляют информацию о последовательности). [14] )
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Язаки, Дж; Грегори, Б.Д.; Экер, младший (октябрь 2007 г.). «Картирование геномного ландшафта с использованием технологии тайлового массива» . Современное мнение в области биологии растений . 10 (5): 534–42. дои : 10.1016/j.pbi.2007.07.006 . ПМК 2665186 . ПМИД 17703988 .
- ^ Перейти обратно: а б Моклер, ТК; Чан, С; Сундаресан, А; Чен, Х; Якобсен, SE; Экер, младший (январь 2005 г.). «Применение массивов мозаики ДНК для полногеномного анализа». Геномика . 85 (1): 1–15. дои : 10.1016/j.ygeno.2004.10.005 . ПМИД 15607417 .
- ^ Перейти обратно: а б Ямада, К; Лим, Дж; Дейл, Дж. М.; Чен, Х; Шинн, П; Палм, CJ; Саутвик, AM; Ву, ХК; Ким, С; Нгуен, М; Фам, П; Чеук, Р; и др. (31 октября 2003 г.). «Эмпирический анализ транскрипционной активности в геноме арабидопсиса». Наука . 302 (5646): 842–6. Бибкод : 2003Sci...302..842Y . дои : 10.1126/science.1088305 . ПМИД 14593172 . S2CID 7076927 .
- ^ Перейти обратно: а б Лю, XS (октябрь 2007 г.). «Начало работы с мозаичным анализом микрочипов» . PLOS Вычислительная биология . 3 (10): 1842–4. Бибкод : 2007PLSCB...3..183L . дои : 10.1371/journal.pcbi.0030183 . ПМК 2041964 . ПМИД 17967045 .
- ^ О'Гин, Х; Скваццо, СЛ; Айенгар, С; Бланик, К; Ринн, Дж.Л.; Чанг, Хай; Грин, Р; Фарнхэм, Пи Джей (июнь 2007 г.). «Полногеномный анализ связывания KAP1 предполагает ауторегуляцию KRAB-ZNF» . ПЛОС Генетика . 3 (6): е89. дои : 10.1371/journal.pgen.0030089 . ПМК 1885280 . ПМИД 17542650 .
- ^ Бертоне, П; Герштейн, М; Снайдер, М. (2005). «Применение массивов мозаики ДНК для экспериментальной аннотации генома и открытия регуляторных путей». Хромосомные исследования . 13 (3): 259–74. дои : 10.1007/s10577-005-2165-0 . PMID 15868420 . S2CID 24058431 .
- ^ Коули, С; Бекиранов С; Нг, ХХ; Капранов П ; Секингер, Э.А.; Кэмп, Д; Пикколбони, А; Семенченко В; Ченг, Дж.; Уильямс, Эй Джей; Уиллер, Р.; Вонг, Б; Дренков, Дж.; Яманака, М; Патель, С; Брубейкер, С; Таммана, Х; Хелт, Г; Струл, К; Гингерас, ТР (20 февраля 2004 г.). «Непредвзятое картирование сайтов связывания транскрипционных факторов вдоль хромосом 21 и 22 человека указывает на широко распространенную регуляцию некодирующих РНК» . Ячейка 116 (4): 499–509. дои : 10.1016/S0092-8674(04) 00127-8 ПМИД 14980218 . S2CID 7793221 .
- ^ Капранов П; Коули, SE; Дренков, Дж; Бекиранов С; Штраусберг, РЛ; Фодор, СП; Гингерас, ТР (3 мая 2002 г.). «Крупномасштабная транскрипционная активность в хромосомах 21 и 22». Наука . 296 (5569): 916–9. Бибкод : 2002Sci...296..916K . дои : 10.1126/science.1068597 . ПМИД 11988577 . S2CID 18336536 .
- ^ Перейти обратно: а б Кэмп, Д; Ченг, Дж.; Капранов П ; Яманака, М; Брубейкер, С; Коули, С; Дренков, Дж.; Пикколбони, А; Бекиранов С ; Хелт, Г; Таммана, Х; Гингерас, ТР (март 2004 г.). «Новые РНК, идентифицированные в результате углубленного анализа транскриптома хромосом 21 и 22 человека» . Геномные исследования . 14 (3): 331–42. дои : 10.1101/гр.2094104 . ПМК 353210 . ПМИД 14993201 .
- ^ Столц, В; Саманта, член парламента; Тонгпрасит, Ж; Сетхи, Х; Лян, С; Нельсон, округ Колумбия; Хегеман, А; Нельсон, К; Ранкур, Д; Беднарек, С; Ульрих, EL; Чжао, Вопрос; Врубель, РЛ; Ньюман, CS; Фокс, Б.Г.; Филлипс, Дж. Н. младший; Маркли, Дж.Л.; Сассман, MR (22 марта 2005 г.). «Идентификация транскрибируемых последовательностей Arabidopsis thaliana с использованием массивов мозаики генома высокого разрешения» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (12): 4453–8. Бибкод : 2005PNAS..102.4453S . дои : 10.1073/pnas.0408203102 . ПМК 555476 . ПМИД 15755812 .
- ^ Кроуфорд, Грегори Э; Дэвис, Шон; Скакери, Питер С; Рено, Габриэль; Халави, Мохамад Дж; Эрдос, Майкл Р.; Грин, Роланд; Мельцер, Пол С; Вольфсберг, Тайра Дж ; Коллинз, Фрэнсис С. (21 июня 2006 г.). «ДНКаза-чип: метод высокого разрешения для выявления гиперчувствительных участков ДНКазы I с использованием мозаичных микрочипов» . Природные методы . 3 (7): 503–9. дои : 10.1038/nmeth888 . ПМК 2698431 . ПМИД 16791207 .
- ^ Хайденблад, М; Линдгрен, Д; Джонсон, Т; Лидберг, Ф; Веерла, С; Чебиль, Г; Гудьонссон, С; Борг, А; Монссон, В; Хёглунд, М. (31 января 2008 г.). «Массив CGH с разрешением плитки и профилирование экспрессии высокой плотности уротелиальных карцином определяют геномные ампликоны и гены-кандидаты-мишени, специфичные для запущенных опухолей» . BMC Медицинская Геномика . 1 :3. дои : 10.1186/1755-8794-1-3 . ПМК 2227947 . ПМИД 18237450 .
- ^ Ташкент, Эрдоган; Бикман, Рене; Рыцарь Йерун; Воутерс, Бас Дж; Питерс, Жюстин К; Тау, Иво П; Рейндерс, Марсель Дж.Т.; Делвелл, Радд (2010). «HAT: Гипергеометрический анализ тайлинг-массивов с применением к данным промотора-GeneChip» . БМК Биоинформатика . 11 (1): 275. дои : 10.1186/1471-2105-11-275 . ПМЦ 2892465 . ПМИД 20492700 .
- ^ Моклер, Тодд С.; Экер, Джозеф Р. (январь 2005 г.). «Применение массивов мозаики ДНК для полногеномного анализа». Геномика . 85 (1): 1–15. дои : 10.1016/j.ygeno.2004.10.005 . ПМИД 15607417 .