олигонуклеотид
Олигонуклеотиды — это короткие ДНК или РНК молекулы , олигомеры , которые имеют широкий спектр применения в генетическом тестировании , исследованиях и судебной экспертизе . Обычно изготавливается в лаборатории методом твердофазного химического синтеза . [1] Эти небольшие фрагменты нуклеиновых кислот могут быть изготовлены в виде одноцепочечных молекул с любой заданной пользователем последовательностью, и поэтому они жизненно важны для синтеза искусственных генов , полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирования ДНК , молекулярного клонирования и в качестве молекулярных зондов . В природе олигонуклеотиды обычно встречаются в виде небольших молекул РНК, которые участвуют в регуляции экспрессии генов (например, микроРНК ). [2] или являются промежуточными продуктами деградации, полученными в результате распада более крупных молекул нуклеиновой кислоты.
Олигонуклеотиды характеризуются последовательностью нуклеотидных остатков , составляющих всю молекулу. Длину олигонуклеотида обычно обозначают « -mer » (от греческого meros — «часть»). Например, олигонуклеотид из шести нуклеотидов (нт) представляет собой гексамер, тогда как олигонуклеотид из 25 нуклеотидов обычно называют «25-мером». Олигонуклеотиды легко связываются специфичным для последовательности образом с соответствующими комплементарными олигонуклеотидами, ДНК или РНК, образуя дуплексы или, реже, гибриды более высокого порядка. Это основное свойство служит основой для использования олигонуклеотидов в качестве зондов для обнаружения специфических последовательностей ДНК или РНК. Примеры процедур, в которых используются олигонуклеотиды, включают микрочипы ДНК , Саузерн-блоттинг , анализ ASO , [3] флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), ПЦР и синтез искусственных генов.
Олигонуклеотиды состоят из 2'-дезоксирибонуклеотидов (олигодезоксирибонуклеотидов), которые можно модифицировать в основной цепи или в положении 2'-сахара для достижения различных фармакологических эффектов. Эти модификации придают олигонуклеотидам новые свойства и делают их ключевым элементом антисмысловой терапии . [4] [5]
Синтез [ править ]
Олигонуклеотиды химически синтезируются с использованием строительных блоков, защищенных фосфорамидитов природных или химически модифицированных нуклеозидов или, в меньшей степени, ненуклеозидных соединений. Сборка олигонуклеотидной цепи происходит в направлении от 3’ к 5’ в соответствии с обычной процедурой, называемой «синтетическим циклом». Завершение одного синтетического цикла приводит к добавлению одного нуклеотидного остатка к растущей цепи. Выход менее 100% каждой стадии синтеза и возникновение побочных реакций устанавливают практические пределы эффективности процесса. В целом олигонуклеотидные последовательности обычно короткие (длиной 13–25 нуклеотидов). [6] Максимальная длина синтетических олигонуклеотидов едва превышает 200 нуклеотидных остатков. ВЭЖХ и другие методы можно использовать для выделения продуктов с желаемой последовательностью. [ нужна цитата ]
Химические модификации [ править ]
Создание химически стабильных коротких олигонуклеотидов было самой ранней задачей в разработке терапии АСО. Природные олигонуклеотиды легко разлагаются нуклеазами — ферментом, который расщепляет нуклеотиды и которого достаточно во всех типах клеток. [7] Короткие олигонуклеотидные последовательности также обладают слабой внутренней аффинностью связывания, что способствует их деградации in vivo. [8]
Модификации магистрали [ править ]
Нуклеозидорганотиофосфатные ( ПС ) аналоги нуклеотидов придают олигонуклеотидам некоторые полезные свойства. Ключевые полезные свойства, которые каркас PS придает нуклеотидам, - это идентификация диастереомера каждого нуклеотида и способность легко следить за реакциями с участием фосфоротиоатных нуклеотидов, что полезно при синтезе олигонуклеотидов. [9] Модификации скелета PS олигонуклеотидов защищают их от нежелательной деградации ферментами. [10] Модификация нуклеотидного остова широко используется, поскольку ее можно относительно легко и точно осуществить для большинства нуклеотидов. [9] Сообщалось, что флуоресцентные модификации на 5'- и 3'-концах олигонуклеотидов позволяют оценить структуру, динамику и взаимодействие олигонуклеотидов по отношению к окружающей среде. [11]
кольца Модификации сахарного
Другой модификацией олигонуклеотидов, полезной для медицинского применения, являются модификации 2'-сахара . Модификация сахара в 2'-положении повышает эффективность олигонуклеотидов за счет усиления способности олигонуклеотидов связываться с мишенями, особенно в терапии антисмысловыми олигонуклеотидами . [8] Они также уменьшают неспецифическое связывание белков, повышая точность воздействия на конкретные белки. [8] Двумя наиболее часто используемыми модификациями являются 2'-O-метил и 2'-O-метоксиэтил. [8] Также сообщалось о флуоресцентных модификациях нуклеиновых оснований. [11]
Антисмысловые олигонуклеотиды [ править ]
Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) представляют собой одиночные цепи ДНК или РНК, комплементарные выбранной последовательности. [6] В случае антисмысловой РНК они предотвращают трансляцию белков определенных цепей информационной РНК путем связывания с ними в процессе, называемом гибридизацией . [12] Антисмысловые олигонуклеотиды можно использовать для нацеливания на специфическую комплементарную (кодирующую или некодирующую ) РНК. Если связывание имеет место, этот гибрид может быть разрушен ферментом РНКазой H. [12] РНКаза H представляет собой фермент, который гидролизует РНК, и при использовании в качестве антисмысловых олигонуклеотидов приводит к снижению экспрессии мРНК на 80-95%. [6]
Использование морфолино антисмысловых олигонуклеотидов для нокдауна генов у позвоночных , которое в настоящее время является стандартным методом в биологии развития и используется для изучения измененной экспрессии генов и функций генов, было впервые разработано Джанет Хисман с использованием Xenopus . [13] К одобренным FDA препаратам Морфолино относятся этеплирсен и голодирсен . Антисмысловые олигонуклеотиды также использовались для ингибирования репликации вируса гриппа в клеточных линиях. [14] [15]
Нейродегенеративные заболевания, возникающие в результате одного мутантного белка, являются хорошими мишенями для терапии антисмысловыми олигонуклеотидами из-за их способности нацеливать и модифицировать очень специфические последовательности РНК с высокой селективностью. [3] Многие генетические заболевания, включая болезнь Хантингтона , болезнь Альцгеймера , болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз (АЛС), связаны с изменениями ДНК, которые приводят к неправильным последовательностям РНК и приводят к неправильной трансляции белков, оказывающих токсическое физиологическое воздействие. [16]
Интернализация клеток [ править ]
Поглощение/интернализация клетками по-прежнему представляет собой самое большое препятствие на пути к успешной терапии олигонуклеотидами (ON). Прямому усвоению, как и большинству низкомолекулярных лекарств, препятствует полианионная основная цепь и молекулярный размер ON. Точные механизмы поглощения и внутриклеточного транспорта к месту действия до сих пор во многом неясны. Более того, небольшие различия в структуре/модификациях ON (см. выше) и различия в типах клеток приводят к огромным различиям в поглощении. Считается, что поглощение клетками происходит по разным путям после адсорбции ON на поверхности клетки. Примечательно, что исследования показывают, что большинство клеток тканевой культуры легко поглощают АСО (фосфоротиотные связи) непродуктивным образом, а это означает, что никакого антисмыслового эффекта не наблюдается. В отличие от этого конъюгация АСО с лигандами, распознаваемыми G-связанными рецепторами, приводит к повышенному продуктивному поглощению. [17] Помимо этой классификации (непродуктивный или продуктивный), интернализация клеток в основном протекает энергозависимым путем (рецептор-опосредованный эндоцитоз), но нельзя исключать энергонезависимую пассивную диффузию (гимноз). После прохождения клеточной мембраны ON-терапевтические препараты инкапсулируются в ранних эндосомах , которые транспортируются к поздним эндосомам, которые в конечном итоге сливаются с лизосомами, содержащими деградирующие ферменты при низком pH. [18] Чтобы реализовать свою терапевтическую функцию, ON должен покинуть эндосому до ее деградации. В настоящее время не существует универсального метода преодоления проблем доставки, захвата клеток и выхода из эндосом, но существует несколько подходов, адаптированных к конкретным клеткам и их рецепторам. [19]
Конъюгация ON-терапевтических средств с объектом, ответственным за распознавание/поглощение клетками, не только увеличивает поглощение (см. выше), но также, как полагают, уменьшает сложность поглощения клетками, поскольку тогда задействуется преимущественно один (идеально известный) механизм. [18] Это было достигнуто с помощью конъюгатов малых молекул с ON, например, несущих N-ацетилгалактозамин , который воздействует на рецепторы гепатоцитов . [20] Эти конъюгаты являются отличным примером увеличения клеточного поглощения в сочетании с адресной доставкой, поскольку соответствующие рецепторы сверхэкспрессируются на клетках-мишенях, что приводит к таргетному терапевтическому действию (сравните конъюгаты антитело-лекарственное средство, которые используют сверхэкспрессированные рецепторы на раковых клетках). [19] Еще одним широко используемым и тщательно исследованным объектом для адресной доставки и увеличения поглощения олигонуклеотидов клетками являются антитела .
Аналитические методы [ править ]
Хроматография [ править ]
Алкиламиды можно использовать в качестве хроматографических неподвижных фаз. [21] Эти фазы были исследованы для разделения олигонуклеотидов. [22] Ионно-парная обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография используется для разделения и анализа олигонуклеотидов после автоматического синтеза. [23]
Масс-спектрометрия [ править ]
Смесь 5-метоксисалициловой кислоты и спермина можно использовать в качестве матрицы для анализа олигонуклеотидов в масс-спектрометрии MALDI . [24] Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) также является мощным инструментом для определения массы олигонуклеотидов. [25]
ДНК-микрочип [ править ]
ДНК-микрочипы представляют собой полезное аналитическое применение олигонуклеотидов. По сравнению со стандартными микрочипами кДНК , микрочипы на основе олигонуклеотидов обладают более контролируемой специфичностью в отношении гибридизации и способностью измерять наличие и распространенность альтернативно сплайсированных или полиаденилированных последовательностей. [26] Один из подтипов ДНК-микрочипов можно охарактеризовать как субстраты (нейлон, стекло и т. д.), с которыми с высокой плотностью связаны олигонуклеотиды. [27] Существует ряд применений микрочипов ДНК в науках о жизни. [ нужна цитата ]
См. также [ править ]
- Аптамеры , олигонуклеотиды с важным биологическим применением.
- Морфолино , олигонуклеотиды с неприродным остовом, которые не активируют РНКазу-H, но могут снижать экспрессию генов или модифицировать сплайсинг РНК.
- Полиморфизм , появление в популяции одного и того же гена в нескольких формах вследствие мутаций; часто можно проверить с помощью датчиков ASO
- CpG-олигодезоксинуклеотид , ОДН с иммуностимулирующими свойствами.
- Полипуриновые шпильки обратного Хугстина , PPRH, олигонуклеотиды, которые могут связывать ДНК или РНК и снижать экспрессию генов.
Ссылки [ править ]
- ^ Ян Дж., Столи Дж.А., Цзян Х., Сяо Л., Кисман В.Ф., Антиа Ф.Д. и др. (октябрь 2018 г.). «Твердофазный синтез фосфоротиоатных олигонуклеотидов с использованием побочных продуктов сульфуризации для кэпирования in situ». Журнал органической химии . 83 (19): 11577–11585. дои : 10.1021/acs.joc.8b01553 . ПМИД 30179468 . S2CID 52157806 .
- ^ Куреши А., Тхакур Н., Монга И., Тхакур А., Кумар М. (1 января 2014 г.). «VIRmiRNA: комплексный ресурс экспериментально подтвержденных вирусных микроРНК и их мишеней» . База данных . 2014 : бау103. дои : 10.1093/база данных/bau103 . ПМК 4224276 . ПМИД 25380780 .
- ^ Перейти обратно: а б Монга И., Куреши А., Тхакур Н., Гупта А.К., Кумар М. (2017). «ASPsiRNA: ресурс ASP-siRNA, обладающий терапевтическим потенциалом в отношении генетических нарушений человека, и алгоритм прогнозирования их ингибирующей эффективности» . G3: Гены, геномы, генетика . 7 (9): 2931–2943. дои : 10.1534/g3.117.044024 . ПМК 5592921 . ПМИД 28696921 .
- ^ Вайс, Б., изд. (1997). Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды и антисмысловая РНК: новые фармакологические и терапевтические средства. Бока-Ратон, Флорида: CRC Press
- ^ Вайс Б., Давидкова Г., Чжоу Л.В. (1999). «Генная терапия антисмысловыми РНК для изучения и модуляции биологических процессов» . Клеточные и молекулярные науки о жизни . 55 (3): 334–58. дои : 10.1007/s000180050296 . ПМЦ 11146801 . ПМИД 10228554 . S2CID 9448271 .
- ^ Перейти обратно: а б с Диас Н., Штейн, Калифорния (март 2002 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: основные понятия и механизмы» . Молекулярная терапия рака . 1 (5): 347–55. ПМИД 12489851 .
- ^ Фрейзер К.С. (январь 2015 г.). «Терапия антисмысловыми олигонуклеотидами: перспективы и проблемы с точки зрения токсикологического патолога». Токсикологическая патология . 43 (1): 78–89. дои : 10.1177/0192623314551840 . ПМИД 25385330 . S2CID 37981276 .
- ^ Перейти обратно: а б с д ДеВос С.Л., Миллер Т.М. (июль 2013 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: лечение нейродегенерации на уровне РНК» . Нейротерапия . 10 (3): 486–97. дои : 10.1007/s13311-013-0194-5 . ПМК 3701770 . ПМИД 23686823 .
- ^ Перейти обратно: а б Экстайн Ф. (апрель 2000 г.). «Фосфоротиоатолигодезоксинуклеотиды: каково их происхождение и что в них уникального?». Разработка лекарств на основе антисмысловых и нуклеиновых кислот . 10 (2): 117–21. дои : 10.1089/oli.1.2000.10.117 . ПМИД 10805163 .
- ^ Штейн К.А., Субасингхе С., Шинозука К., Коэн Дж.С. (апрель 1988 г.). «Физико-химические свойства фосфоротиоатолигодезоксинуклеотидов» . Исследования нуклеиновых кислот . 16 (8): 3209–21. дои : 10.1093/нар/16.8.3209 . ПМК 336489 . ПМИД 2836790 .
- ^ Перейти обратно: а б Мишель БЯ, Дзюба Д, Бенхида Р, Демченко А.П., Бургер А (2020). «Исследование структур нуклеиновых кислот, динамики и взаимодействия с экологически чувствительными флуоресцентными метками» . Границы в химии . 8 : 112. Бибкод : 2020FrCh....8..112M . дои : 10.3389/fchem.2020.00112 . ПМК 7059644 . ПМИД 32181238 .
- ^ Перейти обратно: а б Крук С.Т. (апрель 2017 г.). «Молекулярные механизмы антисмысловых олигонуклеотидов» . Нуклеиновая кислотная терапия . 27 (2): 70–77. дои : 10.1089/нат.2016.0656 . ПМЦ 5372764 . ПМИД 28080221 .
- ^ Хисман Дж., Кофрон М., Уайли С. (июнь 2000 г.). «Сигнальная активность бета-катенина, анализируемая у ранних эмбрионов Xenopus: новый антисмысловой подход» . Биология развития . 222 (1): 124–34. дои : 10.1006/dbio.2000.9720 . ПМИД 10885751 .
- ^ Кумар П., Кумар Б., Раджпут Р., Саксена Л., Банерджи А.С., Ханна М. (ноябрь 2013 г.). «Перекрестный защитный эффект антисмыслового олигонуклеотида, проявленный против обычного 3'-NCR генома вируса гриппа А». Молекулярная биотехнология . 55 (3): 203–11. дои : 10.1007/s12033-013-9670-8 . ПМИД 23729285 . S2CID 24496875 .
- ^ Кумар Б., Ханна М., Кумар П., Суд В., Вьяс Р., Банерджиа А.С. (май 2012 г.). «Опосредованное нуклеиновой кислотой расщепление гена M1 вируса гриппа А значительно усиливается антисмысловыми молекулами, нацеленными на гибридизацию вблизи места расщепления». Молекулярная биотехнология . 51 (1): 27–36. дои : 10.1007/s12033-011-9437-z . ПМИД 21744034 . S2CID 45686564 .
- ^ Смит Р.А., Миллер Т.М., Яманака К., Мония Б.П., Кондон Т.П., Хунг Г. и др. (август 2006 г.). «Антисмысловая олигонуклеотидная терапия нейродегенеративных заболеваний» . Журнал клинических исследований . 116 (8): 2290–6. дои : 10.1172/JCI25424 . ПМК 1518790 . ПМИД 16878173 .
- ^ Мин, Синь; Алам, штат Мэриленд Роушон; Фишер, Майкл; Ян, Юнджун; Чен, Сяоюань; Джулиано, Рудольф Л. (15 июня 2010 г.). «Внутриклеточная доставка антисмыслового олигонуклеотида посредством эндоцитоза рецептора, связанного с G-белком» . Исследования нуклеиновых кислот . 38 (19): 6567–6576. дои : 10.1093/нар/gkq534 . ISSN 1362-4962 . ПМЦ 2965246 . ПМИД 20551131 .
- ^ Перейти обратно: а б Хонер, Мануэль; Духо, Кристиан (16 декабря 2020 г.). «Клеточное нацеливание олигонуклеотидов путем конъюгации с малыми молекулами» . Молекулы . 25 (24): 5963. doi : 10,3390/molecules25245963 . ISSN 1420-3049 . ПМЦ 7766908 . ПМИД 33339365 .
- ^ Перейти обратно: а б Крук, ST (2017). «Клеточное поглощение и транспортировка антисмысловых олигонуклеотидов» . Нат. Биотехнология . 35 (3): 230–237. дои : 10.1038/nbt.3779 . ПМИД 28244996 . S2CID 1049452 .
- ^ Пракаш, Тажа П.; Грэм, Марк Дж.; Ю, Цзинхуа; Карти, Рик; Лоу, Одри; Чаппелл, Альфред; Шмидт, Карстен; Чжао, Чэньгуан; Агаджан, Мариам; Мюррей, Хизер Ф.; Райни, Стэн; Бутен, Шери Л.; Мюррей, Сьюзен Ф.; Гаус, Ганс; Кросби, Джефф (июль 2014 г.). «Направленная доставка антисмысловых олигонуклеотидов в гепатоциты с использованием триантеннарного N-ацетилгалактозамина улучшает эффективность у мышей в 10 раз» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (13): 8796–8807. дои : 10.1093/nar/gku531 . ISSN 1362-4962 . ПМК 4117763 . ПМИД 24992960 .
- ^ Бушевски Б., Кастури П., Гилпин Р.К., Гангода М.Е., Яронец М. (август 1994 г.). «Хроматографические и сопутствующие исследования алкиламидных фаз». Хроматография . 39 (3–4): 155–61. дои : 10.1007/BF02274494 . S2CID 97825477 .
- ^ Бушевски Б., Сафаи З., Студзиньска С. (январь 2015 г.). «Анализ олигонуклеотидов методом жидкостной хроматографии с неподвижной фазой алкиламида» . Открытая химия . 13 (1). doi : 10.1515/chem-2015-0141 .
- ^ Гилар, М.; Фонтан, Кей Джей; Будман, Ю.; Нойе, УД; Ярдли, КР; Рейнвилл, Пенсильвания; Рассел Р.Дж., 2-й; Геблер, Дж. К. (7 июня 2002 г.). «Ионно-парный обращенно-фазовый высокоэффективный жидкостный хроматографический анализ олигонуклеотидов:: Прогнозирование удерживания» . Журнал хроматографии А. 958 (1–2): 167–182. дои : 10.1016/S0021-9673(02)00306-0 . ISSN 0021-9673 . ПМИД 12134814 .
{{cite journal}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка ) - ^ Дистлер А.М., Эллисон Дж. (апрель 2001 г.). «5-Метоксисалициловая кислота и спермин: новая матрица для масс-спектрометрического анализа олигонуклеотидов с помощью матричной лазерной десорбции / ионизации». Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 12 (4): 456–62. Бибкод : 2001JASMS..12..456D . дои : 10.1016/S1044-0305(01)00212-4 . ПМИД 11322192 . S2CID 18280663 .
- ^ Шах С., Фридман Ш. (март 2008 г.). «Метод ESI-MS для характеристики нативных и модифицированных олигонуклеотидов, используемых для РНК-интерференции и других биологических применений». Протоколы природы . 3 (3): 351–6. дои : 10.1038/nprot.2007.535 . ПМИД 18323805 . S2CID 2093309 .
- ^ Релогио А, Швагер С, Рихтер А, Ансорж В, Валькарсель Дж (июнь 2002 г.). «Оптимизация ДНК-микрочипов на основе олигонуклеотидов» . Исследования нуклеиновых кислот . 30 (11): 51д–51. дои : 10.1093/нар/30.11.e51 . ПМЦ 117213 . ПМИД 12034852 .
- ^ Гонг П., Харберс ГМ, Грейнджер Д.В. (апрель 2006 г.). «Мультиметодическое сравнение поверхностной плотности иммобилизованных и гибридизированных олигонуклеотидов на коммерческих предметных стеклах микрочипов, реагирующих на амины». Аналитическая химия . 78 (7): 2342–51. дои : 10.1021/ac051812m . ПМИД 16579618 .
Дальнейшее чтение [ править ]
- Спинглер Б. (январь 2012 г.). «Глава 3. Конформационные изменения олигонуклеотидов, стимулируемые ионами металлов». В Sigel A, Sigel H, Sigel RK (ред.). Взаимодействие между ионами металлов и нуклеиновыми кислотами . Том. 10. Springer Science & Business Media. стр. 103–118. дои : 10.1007/978-94-007-2172-2_3 . ПМИД 22210336 .
{{cite book}}:|journal=игнорируется ( помогите )
Внешние ссылки [ править ]
- Атлас RNAi : база данных библиотек RNAi и результатов их целевого анализа.
- physorg.com | Генетический источник мышечной дистрофии нейтрализован
Виды нуклеиновых кислот | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Составляющие | |||||||
| Рибонуклеиновые кислоты (кодирование, некодирование ) |
| ||||||
| Дезоксирибонуклеиновая кислоты | |||||||
| Аналоги | |||||||
| Клонирование векторов | |||||||
