Южное пятно
Саузерн-блоттинг — это метод, используемый для обнаружения и количественного определения определенной последовательности ДНК в образцах ДНК. Этот метод используется в молекулярной биологии . Вкратце, очищенная ДНК из биологического образца (например, крови или ткани) расщепляется ферментами рестрикции , а полученные фрагменты ДНК разделяются с помощью электрического тока , который перемещает их через ситообразный гель или матрицу, что позволяет более мелким фрагментам двигаться быстрее, чем более крупные фрагменты. Фрагменты ДНК переносятся из геля или матрицы на твердую мембрану, которая затем подвергается воздействию ДНК-зонда, помеченного радиоактивной, флуоресцентной или химической меткой. Метка позволяет визуализировать любые фрагменты ДНК, содержащие последовательности, комплементарные последовательности ДНК-зонда, в рамках Саузерн-блоттинга. [1]
Саузерн-блоттинг сочетает в себе перенос фрагментов ДНК, разделенных электрофорезом, на мембрану фильтра в процессе, называемом блоттингом , и последующее обнаружение фрагментов путем гибридизации зонда . [2]
Метод назван в честь британского биолога Эдвина Саузерна , впервые опубликовавшего его в 1975 году. [3] Другие блоттинга методы (например, вестерн-блоттинг , [4] северный блот , восточный блот , юго-западный блот ), в которых используются аналогичные принципы, но с использованием РНК или белка, позже были названы в честь направлений компаса как своего рода каламбур от имени Саузерна. Поскольку название одноименное , слово Southern пишется с заглавной буквы, как это принято в именах собственных . По аналогии этому соглашению могут следовать и названия других методов блоттинга. [5]
История [ править ]
Саузерн изобрел Саузерн-блот после объединения трех инноваций, первая из которых - это эндонуклеазы рестрикции, которые были разработаны в Университете Джона Хопкинса Томом Келли и Гамильтоном Смитом . Эти эндонуклеазы рестрикции используются для разрезания ДНК по определенной последовательности. Кеннет и Норин Мюррей представили эту технику как южную. Второе нововведение — это гель-электрофорез, основанный на разделении смесей ДНК, РНК или белков в зависимости от размера молекул, который также был разработан в Университете Джонса Хопкинса Дэниелом Натансом и Кэтлин Данна в 1971 году. Третье нововведение — методы блоттинга. который был разработан Фредериком Сэнгером , когда он перенес молекулы РНК на бумагу DEAE. Саузерн-блоттинг был изобретен в 1973 году, но не был опубликован до 1975 года. Хотя он был опубликован позже, метод получил распространение, когда Саузерн представил метод Саузерн-блоттинга ученому из лаборатории Колд-Спринг-Харбор по имени Майкл Мэтьюз, нарисовав этот метод на бумаге. [6]
Метод [ править ]
Геномную ДНК расщепляют одним или несколькими ферментами рестрикции, затем фрагменты ДНК фракционируют по размеру с помощью гель-электрофореза. Прежде чем фрагменты ДНК будут перенесены на твердую мембрану, представляющую собой нейлоновую или нитроцеллюлозную мембрану, ее сначала денатурируют щелочной обработкой. [7] После иммобилизации фрагментов ДНК на мембране используются методы прегибридизации для уменьшения неспецифического связывания зондов, затем фрагменты на мембране гибридизуются либо с радиоактивно меченными, либо с нерадиоактивно меченными ДНК, РНК или олигонуклеотидными зондами, которые комплементарны целевой последовательности ДНК. затем методы обнаружения используются для визуализации целевой ДНК. [8]
- Выделение ДНК. Исследуемая ДНК выделяется из различных тканей. Наиболее подходящим источником ДНК является ткань крови. Однако его можно выделить из разных тканей (волос, спермы, слюны и т. д.).
- Расщепление ДНК: рестрикционные эндонуклеазы используются для разрезания нитей ДНК с высокой молекулярной массой на более мелкие фрагменты. Это делается путем добавления желаемого количества ДНК, которое можно изменить в зависимости от используемого зонда и сложности ДНК, с ферментом рестрикции, ферментным буфером и очищенной водой, а затем инкубируют реакцию при 37 ° C в течение ночи.
- Гель-электрофорез: фрагменты ДНК затем подвергаются электрофорезу в агарозном геле, чтобы разделить их по размеру. Если размер некоторых фрагментов ДНК превышает 15 т.п.н. , то перед блоттингом гель можно обработать кислотой, например разбавленной HCl . Это депуринирует фрагменты ДНК, разбивая ДНК на более мелкие части, тем самым обеспечивая более эффективный перенос из геля на мембрану.
- Денатурация: если используются щелочные методы переноса, гель ДНК помещают в щелочной раствор (обычно содержащий гидроксид натрия ) для денатурации двухцепочечной ДНК. Денатурация в щелочной среде может улучшить связывание отрицательно заряженных остатков тимина ДНК с положительно заряженными аминогруппами мембраны, разделяя ее на отдельные цепи ДНК для последующей гибридизации с зондом (см. ниже), и разрушая любую остаточную РНК, которая может все еще присутствуют в ДНК. Однако выбор щелочного метода переноса вместо нейтрального часто является эмпирическим и может привести к эквивалентным результатам. [ нужна ссылка ]
- Блоттинг: лист нитроцеллюлозной (или, альтернативно, нейлоновой ) мембраны помещается поверх (или под, в зависимости от направления переноса) геля. К гелю постоянно прикладывают давление (либо с помощью всасывания, либо путем размещения стопки бумажных полотенец и груза поверх мембраны и геля), чтобы обеспечить хороший и равномерный контакт между гелем и мембраной. При переносе путем отсасывания используется 20X буфер SSC для обеспечения герметичности и предотвращения высыхания геля. Затем используется перенос буфера под действием капиллярности из области с высоким водным потенциалом в область с низким водным потенциалом (обычно фильтровальная бумага и бумажные салфетки) для перемещения ДНК из геля на мембрану; ионообменные взаимодействия связывают ДНК с мембраной за счет отрицательного заряда ДНК и положительного заряда мембраны. Для переноса фрагментов ДНК на твердую мембрану можно использовать пять методов: [8] 1. Капиллярный перенос вверх: этот метод переносит фрагмент ДНК вверх из геля на мембрану, где поток жидкости или буфера будет направлен вверх. 2. Капиллярный перенос вниз: этот метод осуществляется путем помещения геля на поверхность мембрана (обычно нейлоновая заряженная мембрана), и фрагменты ДНК будут перенесены в нисходящем направлении с потоком щелочного буфера. 3. Одновременный перенос на две мембраны: этот метод используется для одновременного переноса фрагментов ДНК высокой концентрации из геля. на две мембраны, 4. Электрофоретический перенос: в этом методе обычно используется сильный электрический ток, что затрудняет эффективный перенос ДНК из-за температуры используемого буфера, поэтому эти машины могут быть либо оснащены охлаждающими машинами, либо использоваться в холодном помещении. , 5. Вакуумный перенос: в этом методе используется буфер из верхней камеры для переноса ДНК из геля на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану, гель помещается непосредственно на мембрану, а мембрана помещается на пористый экран в вакууме. камера.
- Иммобилизация: затем мембрану запекают в вакууме или обычной печи при температуре 80 °C в течение 2 часов (стандартные условия: нитроцеллюлозная или нейлоновая мембрана) или подвергают воздействию ультрафиолетового излучения (нейлоновая мембрана) для постоянного прикрепления перенесенной ДНК к мембране.
- Гибридизация: после этого зонд гибридизации — одиночный фрагмент ДНК с определенной последовательностью, присутствие которой в целевой ДНК должно быть установлено, — подвергается воздействию мембраны. ДНК-зонд помечается так, чтобы ее можно было обнаружить, обычно путем включения радиоактивности или маркировки молекулы флуоресцентным или хромогенным красителем . В некоторых случаях гибридизационный зонд может быть изготовлен из РНК, а не из ДНК. Чтобы гарантировать специфичность связывания зонда с ДНК образца, в наиболее распространенных методах гибридизации используют ДНК спермы лосося или сельди для блокирования поверхности мембраны и целевой ДНК, деионизированный формамид и детергенты, такие как SDS, для уменьшения неспецифического связывания зонд.
- Обнаружение: После гибридизации избыток зонда смывается с мембраны (обычно с использованием SSC-буфера ), и картина гибридизации визуализируется на рентгеновской пленке с помощью авторадиографии в случае радиоактивного или флуоресцентного зонда или по развитию цвета на мембрану, если используется хромогенный метод обнаружения.
Интерпретация результатов [ править ]
Гибридизация зонда со специфическим фрагментом ДНК на мембране фильтра указывает на то, что этот фрагмент содержит последовательность ДНК, комплементарную зонду.Стадия переноса ДНК из геля электрофореза на мембрану позволяет легко связывать меченый зонд гибридизации с фракционированной по размеру ДНК. Это также позволяет фиксировать гибриды мишень-зонд, необходимые для анализа авторадиографией или другими методами обнаружения.Саузерн-блоттинг, выполненный с геномной ДНК, расщепленной рестрикционным ферментом, можно использовать для определения количества последовательностей (например, копий гена) в геноме . Зонд, который гибридизуется только с одним сегментом ДНК, который не был разрезан рестриктазой, будет давать одну полосу при Саузерн-блоттинге, тогда как, вероятно, будут наблюдаться множественные полосы, когда зонд гибридизуется с несколькими очень похожими последовательностями (например, с теми, которые может быть результатом дублирования последовательности). Чтобы улучшить специфичность и снизить гибридизацию зонда с последовательностями, идентичными менее чем на 100%, параметры гибридизации можно изменить (например, за счет повышения температуры гибридизации или снижения содержания соли). Нейлоновая мембрана более долговечна и обладает более высокой способностью связывания фрагментов ДНК, чем нитроцеллюлозная мембрана, поэтому фрагменты ДНК будут лучше фиксироваться на мембране, даже если мембрана инкубируется при высоких температурах. Кроме того, по сравнению с нитроцеллюлозной мембраной, которая требует буфера с высокой ионной силой для связывания фрагментов ДНК с мембраной, в нейлоновых заряженных мембранах используются буферы с очень низкой ионной силой для переноса на мембрану даже небольших фрагментов ДНК размером около 50 пар оснований, обычно ДНК, подлежащую переносу, отделяется полиакриламидным гелем. На этапе блоттинга наиболее эффективным методом переноса ДНК из геля на мембрану является вакуумный перенос, поскольку он переносит ДНК более быстро и количественно. [8]
Приложения [ править ]
- Саузерн-блоттинг-перенос можно использовать для клонирования на основе гомологии на основе аминокислотной последовательности белкового продукта целевого гена. Олигонуклеотиды сконструированы так, что они комплементарны целевой последовательности. Олигонуклеотиды химически синтезируются, маркируются радиоактивным изотопом и используются для скрининга библиотеки ДНК или других коллекций клонированных фрагментов ДНК. Последовательности, которые гибридизуются с зондом гибридизации, дополнительно анализируются, например, для получения полноразмерной последовательности целевого гена.
- С помощью этого метода можно изучить нормальную хромосомную или генную перестройку. [7]
- Может использоваться для поиска подобных последовательностей у других видов или в геноме за счет снижения специфичности гибридизации. [7]
- В смеси, имеющей разные размеры переваренной ДНК, его используют для идентификации рестрикционного фрагмента определенного размера. [7]
- Это полезно для выявления изменений, происходящих в генах, включая вставки, перестановки, делеции и точечные мутации , которые влияют на сайты рестрикции. [7]
- Более того, он используется для идентификации конкретной области, которая использует множество различных ферментов рестрикции при рестрикционном картировании. Также его используют для определения того, какой сайт узнавания был изменен из-за полиморфизма одного нуклеотида , который изменяет конкретный фермент рестрикции. [7]
- Саузерн-блоттинг также можно использовать для идентификации метилированных участков в определенных генах. Особенно полезны нуклеазы рестрикции MspI и HpaII , обе из которых распознают и расщепляют одну и ту же последовательность. Однако HpaII требует, чтобы C в этом сайте был метилирован, тогда как MspI расщепляет только неметилированную в этом сайте ДНК. Следовательно, любые метилированные сайты в последовательности, анализируемой с помощью конкретного зонда, будут расщепляться первым, но не вторым ферментом. [9]
- Может использоваться для идентификации личности посредством снятия отпечатков пальцев и для диагностики заболеваний. [10]
Ограничения [ править ]
- По сравнению с другими тестами Саузерн-блоттинг представляет собой сложную методику, состоящую из нескольких этапов, и эти этапы требуют дорогостоящего оборудования и реагентов. [10]
- Необходимо высокое качество и большое количество ДНК. [10]
- Саузерн-блоттинг — трудоемкий метод, с помощью которого можно оценить только размер ДНК, поскольку это полуколичественный метод. [10]
- Его нельзя использовать для обнаружения мутаций на уровне пары оснований. [10]
См. также [ править ]
- Гель-электрофорез нуклеиновых кислот
- Фрагмент ограничения
- Генетический отпечаток пальца
- Нозерн-блот
- Вестерн-блоттинг
- Восточное пятно
- Юго-западный блот
- Северо-западный блот
Ссылки [ править ]
- ^ «Говорящий словарь генетических терминов | NHGRI» . www.genome.gov . Национальные институты здравоохранения . Проверено 24 января 2023 г.
В данной статье использован текст из этого источника, находящегося в свободном доступе . - ^ «Южное пятно» .
- ^ Южный, Эдвин Меллор (5 ноября 1975 г.). «Обнаружение специфических последовательностей среди фрагментов ДНК, разделенных с помощью гель-электрофореза». Журнал молекулярной биологии . 98 (3): 503–517. дои : 10.1016/S0022-2836(75)80083-0 . ISSN 0022-2836 . ПМИД 1195397 . S2CID 20126741 .
- ^ Таубин; Штелин, Т; Гордон, Дж; и др. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на листы нитроцеллюлозы: методика и некоторые применения» . ПНАС . 76 (9): 4350–4. Бибкод : 1979PNAS...76.4350T . дои : 10.1073/pnas.76.9.4350 . ПМК 411572 . ПМИД 388439 .
- ^ Бернетт, В. Нил (апрель 1981 г.). «Вестерн-блоттинг: электрофоретический перенос белков из гелей додецилсульфата натрия и полиакриламида в немодифицированную нитроцеллюлозу и рентгенографическое обнаружение с помощью антител и радиойодированного белка А». Аналитическая биохимия . 112 (2): 195–203. дои : 10.1016/0003-2697(81)90281-5 . ISSN 0003-2697 . ПМИД 6266278 .
- ^ Тофано, Дайдри; Вичерс, Ильза Р.; Кук-Диган, Роберт (15 августа 2006 г.). «Эдвин Саузерн, блоттинг ДНК и технология микрочипов: тематическое исследование меняющейся роли патентов в академической молекулярной биологии» . Геномика, общество и политика . 2 (2). дои : 10.1186/1746-5354-2-2-50 . ISSN 1746-5354 . ПМЦ 5424904 .
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с д и ж Гленн, Гэри; Андреу, Лефкотеа-Василики (01 января 2013 г.), «Глава пятая - Анализ ДНК методом Саузерн-блоттинга», в Лорш, Джон (ред.), ДНК , том. 529, Academic Press, стр. 47–63, doi : 10.1016/b978-0-12-418687-3.00005-7 , ISBN. 9780124186873 , PMID 24011036 , получено 4 января 2023 г.
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с Грин, Майкл Р.; Сэмбрук, Джозеф (июль 2021 г.). «Анализ ДНК методом Саузерн-блоттинга» . Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2021 (7): pdb.top100396. дои : 10.1101/pdb.top100396 . ISSN 1940-3402 . ПМИД 34210774 . S2CID 235710916 .
- ^ Биохимия, 3-е издание, Мэтьюз, Ван Холд и др., Addison Wesley Publishing, стр. 977.
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с д и Сапкота, Анупама (3 июня 2021 г.). «Саузерн-блоттинг – определение, принцип, этапы, результаты, применение» . Микробные заметки . Проверено 4 января 2023 г.
