✖


Jump to content

Хромогенная in situ гибридизация

Хромогенная in situ гибридизация ( CISH ) представляет собой цитогенетический метод, который сочетает в себе метод обнаружения хромогенного сигнала иммуногистохимии (ИГХ) с гибридизацией in situ . [1] [2] Он был разработан примерно в 2000 году как альтернатива флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для обнаружения амплификации онкогена HER-2/neu. [1] CISH похож на FISH в том, что они оба представляют собой методы гибридизации in situ, используемые для обнаружения присутствия или отсутствия определенных участков ДНК. [1] Однако CISH гораздо более практичен в диагностических лабораториях, поскольку в нем используются микроскопы светлого поля, а не более дорогие и сложные флуоресцентные микроскопы, используемые в FISH. [1] [3]

Процедура

[ редактировать ]
Процедура проведения хромогенной in situ гибридизации

Конструкция зонда

[ редактировать ]

Конструкция зонда для CISH очень похожа на конструкцию для FISH, с различиями только в маркировке и обнаружении. Зонды FISH обычно маркируются различными флуоресцентными метками и могут быть обнаружены только под флуоресцентным микроскопом. [4] тогда как зонды CISH помечены биотином или дигоксигенином. [5] и может быть обнаружен с помощью микроскопа светлого поля после применения других этапов лечения. [1]

Зонды CISH имеют длину около 20 нуклеотидов и предназначены для ДНК-мишеней. Они комплементарны целевой последовательности и связываются с ней после стадии денатурации и гибридизации. На коммерческой основе доступно лишь несколько зондов CISH, поэтому для большинства применений их необходимо экстрагировать, амплифицировать, секвенировать, метить и картировать из бактериальных искусственных хромосом (BAC) . [6] BAC были разработаны во время проекта «Геном человека», поскольку было необходимо изолировать и амплифицировать короткие фрагменты ДНК человека для целей секвенирования. [7] В настоящее время BAC можно выбирать и размещать в геноме человека с использованием общедоступных баз данных, таких как браузер генома UCSC. [6] Это обеспечивает оптимальную комплементарность и специфичность последовательности. ДНК экстрагируют из клонов BAC и амплифицируют с использованием метода, основанного на полимеразе, такого как ПЦР с вырожденным олигонуклеотидом (DOP). [8] Далее клоны секвенируются и проверяется их положение в геноме. [9] Мечение зонда может быть осуществлено с использованием либо случайного прайминга, либо ник-трансляции для включения биотина или дигоксигенина . [10]

Подготовка ткани, гибридизация зондов и обнаружение.

[ редактировать ]

Чтобы CISH работал оптимально, хромосомы должны находиться либо в интерфазе, либо в метафазе. Образцы тканей надежно прикрепляются к поверхности, которая обычно представляет собой предметное стекло, с помощью парафина. [11] Затем образцы тканей необходимо несколько раз промыть и нагреть, чтобы удалить парафин перед этапом гибридизации. После этого образец должен подвергнуться расщеплению пепсином, чтобы обеспечить доступность мишени. [11] На последнем этапе добавляют 10–20 мкл зонда, образец накрывают покровным стеклом, запечатанным резиновым клеем, и предметное стекло нагревают до 97 °C в течение 5–10 минут для денатурации ДНК. [11] Затем предметное стекло помещают в печь с температурой 37 °C на ночь, чтобы зонд мог гибридизироваться. [11] [12] На следующий день образец промывают и наносят блокатор неспецифических участков связывания белков. [11] Если пероксидазу хрена (HRP) , образец необходимо инкубировать в перекиси водорода для подавления активности эндогенной пероксидазы. планируется использовать [11] Если в качестве метки зонда использовался дигоксигенин, против флуоресцеина против дигоксигенина, а затем вторичное антитело против флуоресцеина, конъюгированное с HRP. затем применяют первичное антитело [1] Если в качестве метки зонда использовался биотин, неспецифические сайты связывания необходимо сначала заблокировать с помощью бычьего сывороточного альбумина (БСА) . [11] Затем конъюгированный с HRP стрептавидин . для обнаружения используют [6] [11] Затем HRP превращает диаминобензидин (DAB) в нерастворимый коричневый продукт, который можно обнаружить в светлопольном микроскопе при 40–60-кратном увеличении. [11] [13] Легкое окрашивание гематоксилином можно использовать в качестве контрастного красителя, чтобы сделать продукт более заметным. [5]

Сравнение с другими методами

[ редактировать ]
А) Прямое обнаружение FISH. Флуоресцентные метки прикрепляются к зонду, который гибридизуется с целевой цепью ДНК. Б) Косвенное обнаружение FISH. Биотин, например, прикрепляется к зонду. Стрептавидин, связанный с флуоресцентной меткой, связывает биотин с высокой специфичностью. В) Косвенное обнаружение CISH. Опять же, биотин прикреплен к зонду. Стрептавидин, связанный с пероксидазой хрена, связывает биотин с высокой специфичностью. Пероксидаза хрена превращает диаминобензидин в коричневый осадок.

По сравнению с РЫБОЙ

[ редактировать ]

FISH считается золотым стандартом обнаружения хромосомных аномалий, поскольку он очень чувствителен и имеет высокое разрешение. [3] [14] Другие методы, разработанные для обнаружения хромосомных аномалий, обычно сравнивают с чувствительностью и специфичностью FISH, чтобы увидеть, насколько они соответствуют действительности. [3] [14] Например, было показано, что по сравнению с FISH метод CISH имеет чувствительность 97,5% и специфичность 94% для обнаружения амплификации гена HER-2/neu. [3] Степень совпадения между FISH и CISH составила 94,8%, что показывает, что CISH является методом, сравнимым с FISH. [3] Большинство других источников согласны и сообщают о почти одинаковой эффективности анализов амплификации генов для FISH и CISH. [15] [16] Однако иногда CISH показывает более низкую чувствительность для усиления низкого уровня. [1]

CISH имеет некоторые преимущества перед FISH в отношении используемых реагентов и оборудования. Как отмечалось выше, CISH намного дешевле и проще в использовании, поскольку в нем используются микроскопы светлого поля вместо флуоресцентных микроскопов. [1] [3] Кроме того, реагенты CISH более стабильны, чем реагенты FISH, поэтому их можно хранить и исследовать один и тот же образец несколько раз. [3] [14] Реагенты FISH со временем выцветают из-за фотообесцвечивания, поэтому образец можно исследовать только один раз. [3] [14] Помимо дорогого флуоресцентного микроскопа, FISH также требует цифровой камеры высокого разрешения для получения микрофотографий образца до того, как флуоресценция затухнет. [14] Еще одним преимуществом использования микроскопии светлого поля является то, что образец ткани или клеток в целом можно визуализировать с помощью CISH, тогда как морфологию клеток трудно оценить с помощью флуоресцентной микроскопии в FISH. [3] [14]

CISH также отличается от FISH используемыми зондами, а также методом в целом. Существует множество различных типов FISH-зондов, таких как повторные зонды, зонды, обнаруживающие определенные гены или теломеры, и зонды, обнаруживающие хромосомные аномалии. [14] Напротив, существует ограниченное разнообразие коммерчески доступных зондов CISH, включая зонды, которые связывают центромеры хромосом 3, 7, 8, 9, 10, 11, 17, 18, X и Y, а также ген-специфические зонды для гены, связанные с раком, такие как HER-2, EGFR, MYC и TOP2A. [14] Несмотря на ограниченное разнообразие доступных зондов CISH, они, как правило, более экономичны, чем зонды FISH. [14] Что касается общего метода, FISH можно проводить с использованием прямого мечения (флюорохромы прикрепляются к зондам) или непрямого мечения (зонды метят биотином или дигоксигенином, которые затем обнаруживаются с помощью флуоресцентно меченного стрептавидина или антител соответственно). [14] CISH выполняется с использованием непрямого мечения, при котором антитела или стрептавидин конъюгируются с такими ферментами, как HRP или щелочная фосфатаза (AP) . [14]

По сравнению с ИГХ

[ редактировать ]

CISH и IHC схожи тем, что оба используются с одной и той же целью (в основном для обнаружения амплификации HER-2/neu), и оба они используют ферментативные реакции (HRP/AP) для измерения амплификации. [13] CISH и IHC отличаются тем, что IHC измеряет экспрессию белка, тогда как CISH измеряет амплификацию ДНК. [13] Это различие особенно полезно для HER-2/neu, поскольку было обнаружено, что амплификация гена имеет более высокую прогностическую ценность, чем экспрессия белка. [17]

Недостатком ИГХ является невозможность выявления ложноотрицательных и ложноположительных результатов. [17] В CISH, если нет сигнала от эталонного зонда, анализ не пройден.

Для низкой и высокой сверхэкспрессии белка/амплификации генов CISH и IHC показывают совпадение более 86% и более 89% соответственно. [18] Было показано, что моноклональные антитела лучше, чем поликлональные, для обнаружения как в ИГХ, так и в CISH, поскольку они связываются более специфично, что приводит к более высокому уровню совпадения. [18]

Для средней экспрессии белка/амплификации гена конкордантность варьируется, но она выше при использовании моноклональных антител, чем при использовании поликлональных антител. [18] Переменная конкордантность связана с тем, что амплификация генов не коррелирует строго с экспрессией белка и что гетерогенность опухоли может затруднить обнаружение сверхэкспрессии белка в ткани. [18]

Медицинские применения

[ редактировать ]

CISH часто применяется для оценки амплификации генов, например, статуса HER-2/neu в образцах рака молочной железы. [2] [19] Амплификация HER-2/neu связана с более высокой смертностью, более высокой частотой рецидивов и плохим прогнозом при раке молочной железы. [20] Моноклональное антитело трастузумаб представляет собой блокатор рецепторов, который, как было доказано, клинически очень эффективен при опухолях со сверхэкспрессией HER-2/neu. [21] Поэтому крайне важно определить статус рецептора перед началом лечения рака. [21]

CISH также используется для обнаружения хромосомных перестроек и слияний, таких как слияние тирозинкиназного домена ALK с промотором и 5'-областью EML4 при раке легких. АЛК-положительные опухоли представляют собой клинически значимую подгруппу, поскольку их можно очень эффективно лечить ингибитором АЛК кризотинибом. [22] [23]

Было показано, что помимо рака CISH также полезен при обнаружении инфекций, вызванных вирусом папилломы человека. [24]

Вариации

[ редактировать ]

Гибридизация с усилением серебра in situ (SISH)

[ редактировать ]

В SISH используется тот же метод, что и в CISH, но конечным продуктом является осадок серебра, а не коричневый продукт. [25] В этом методе зонд, меченный динитрофенолом (DNP), связывается с целевой последовательностью. [25] Затем добавляют первичное антитело против DNP, а затем вторичное антитело, конъюгированное с HRP. [25] Затем ко вторичному антителу добавляют ацетат серебра, гидрохинон и перекись водорода, и HRP катализирует полимеризацию серебра в присутствии перекиси водорода. [25] В результате металлическое серебро откладывается в ядрах клеток. [25] Амплификация HER-2/neu видна в виде черных точек. [25]

ДуоЦИШ

[ редактировать ]

DuoCISH — это вариант CISH, который устраняет необходимость использования двух разных датчиков на одном предметном стекле. [26] Это хорошо зарекомендовавший себя метод обнаружения амплификации HER-2/neu, хотя иногда сообщается, что он менее эффективен, чем FISH. [27] В этом методе один зонд связывает эталон, которым в случае обнаружения амплификации HER-2/neu является CEN17 (центромера хромосомы 17), тогда как другой зонд связывает целевую последовательность, которая представляет собой HER-2/neu. [26] [27] DuoCISH сочетает в себе как FISH, так и CISH, поскольку он преобразует сигналы от зондов FISH в хромогенные субстраты. [26] [27] Он работает по принципу: синий цианиновый краситель является субстратом для HRP, а красный — для AP. Например, сигналы зеленого изотиоцианата флуоресцеина (FITC) преобразуются в синие хромогенные преципитаты с помощью антитела против FITC, конъюгированного с HRP, а сигналы Texas Red преобразуются в красные хромогенные преципитаты с помощью антитела против Texas Red, конъюгированного с AP. [26] [27] Преимущество DuoCISH заключается в том, что можно отличить хромосомную анеуплоидию от амплификации гена, поскольку эталонный ген также будет амплифицироваться при анеуплоидии, но не при обнаружении амплификации гена. [26] [27]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Jump up to: а б с д и ж г час Таннер, М; Ганцберг, Д; Ди Лео, А; Ларсимонт, Д; Руас, Г; Пикарт, MJ; Изола, Дж (2000). «Хромогенная гибридизация in situ : практическая альтернатива флуоресцентной гибридизации in situ для обнаружения амплификации онкогена HER-2/neu в архивных образцах рака молочной железы» . Американский журнал патологии . 157 (5): 1467–72. дои : 10.1016/S0002-9440(10)64785-2 . ПМК   1885742 . ПМИД   11073807 .
  2. ^ Jump up to: а б Мадрид, Массачусетс; Ло, Р.В. (2004). «Хромогенная гибридизация in situ (FISH): новая альтернатива скринингу архивных образцов ткани рака молочной железы на статус HER-2/neu» . Исследование рака молочной железы . 6 (5): 593–600 рэндов. дои : 10.1186/bcr915 . ПМК   549176 . ПМИД   15318940 .
  3. ^ Jump up to: а б с д и ж г час я Саес, А; Андреу, Ф.Дж.; Сеги, Массачусетс; Баре, ML; Фернандес, С; Динарес, К; Рей, М. (2006). «Амплификация гена HER-2 путем хромогенной гибридизации in situ (CISH) по сравнению с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) при раке молочной железы - исследование двухсот случаев». Грудь . 15 (4): 519–27. дои : 10.1016/j.breast.2005.09.008 . ПМИД   16290155 .
  4. ^ Гаримберти, Э; Тоси, С (2010). «Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), основные принципы и методология». Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) . Методы молекулярной биологии. Том. 659. стр. 3–20. дои : 10.1007/978-1-60761-789-1_1 . ISBN  978-1-60761-788-4 . ПМИД   20809300 .
  5. ^ Jump up to: а б Ламброс, МБ; Симпсон, ПТ; Джонс, К; Натраян, Р; Вестбери, К; Стил, Д; Сэвидж, К; Маккей, А; Шмитт, ФК; Эшворт, А; Рейс-Фильо, Дж.С. (2006). «Разблокирование архивов патологий для молекулярно-генетических исследований: надежный метод создания зондов для хромогенной и флуоресцентной гибридизации in situ » . Лабораторное исследование . 86 (4): 398–408. дои : 10.1038/labinvest.3700390 . ПМИД   16446704 .
  6. ^ Jump up to: а б с Саммерсгилл, БМ; Шипли, Дж. М. (2010). «Анализ флуоресцентной гибридизации in situ фиксированных формалином тканей, залитых парафином, включая тканевые микрочипы». Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) . Методы молекулярной биологии. Том. 659. стр. 51–70. дои : 10.1007/978-1-60761-789-1_4 . ISBN  978-1-60761-788-4 . ПМИД   20809303 .
  7. ^ Шизуя, Х; Курос-Мехр, Х (2001). «Разработка и применение системы клонирования бактериальных искусственных хромосом» . Медицинский журнал Кейо . 50 (1): 26–30. дои : 10.2302/kjm.50.26 . ПМИД   11296661 .
  8. ^ Даруич, С; Попович, К; Миссириан, К; Монкла, А (2012). «Использование DOP-PCR для амплификации и маркировки ДНК BAC для FISH». Биотехника и гистохимия . 87 (2): 117–21. дои : 10.3109/10520295.2011.559175 . ПМИД   21314248 . S2CID   1326145 .
  9. ^ Де Брекелер, Э; Дуэ-Гильбер, Н.; Басинко А; Морель, Ф; Ле Брис, MJ; Ферек, К; Де Брекелер, М (2011). «Использование бактериальных искусственных хромосом в исследованиях лейкемии: опыт университетской лаборатории цитогенетики в Бресте, Франция» . Журнал биомедицины и биотехнологии . 2011 : 1–7. дои : 10.1155/2011/329471 . ПМК   3025366 . ПМИД   21274439 .
  10. ^ Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор. (2012) «Маркировка ДНК-зондов Ником Переводом» . Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство .
  11. ^ Jump up to: а б с д и ж г час я Парк, К; Ким, Дж; Лим, С; Хан, С; Ли, JY (2003). «Сравнение методов флуоресцентной гибридизации in situ и хромогенной гибридизации in situ для определения статуса HER2 / neu при первичной карциноме молочной железы с использованием тканевого микрочипа» . Современная патология . 16 (9): 937–43. дои : 10.1097/01.MP.0000086487.78558.7D . ПМИД   13679458 .
  12. ^ Шильдхаус, Ху; Демл, К.Ф.; Шмитц, К; Мейбум, М; Бино, Э; Хауке, С; Меркельбах-Брюс, С; Бюттнер, Р. (2013). «Хромогенная гибридизация in situ является надежным методом обнаружения перестроек ALK в аденокарциномах легких» . Современная патология . 26 (11): 1468–77. дои : 10.1038/modpathol.2013.95 . ПМИД   23743932 .
  13. ^ Jump up to: а б с Гупта, Д; Миддлтон, LP; Уитакер, MJ; Абрамс, Дж (2003). «Сравнение флуоресценции и хромогенной гибридизации in situ для обнаружения онкогена HER-2/neu при раке молочной железы» . Американский журнал клинической патологии . 119 (3): 381–7. дои : 10.1309/P40P2EAD42PUKDMG . ПМИД   12645340 .
  14. ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к Ламброс, МБ; Натраян, Р; Рейс-Фильо, Дж. С. (2007). «Хромогенная и флуоресцентная гибридизация in situ при раке молочной железы». Патология человека . 38 (8): 1105–22. дои : 10.1016/j.humpath.2007.04.011 . ПМИД   17640550 .
  15. ^ Чжао, Дж; Ву, Р; Ау, А; Маркес, А; Ю, Ю; Ши, З. (2002). «Определение амплификации гена HER2 методом хромогенной гибридизации in situ (CISH) при архивной карциноме молочной железы» . Современная патология . 15 (6): 657–65. doi : 10.1038/modpathol.3880582 . ПМИД   12065780 . S2CID   19329525 .
  16. ^ Шиа, Дж; Климстра, Д.С.; Ли, Арканзас; Цинь, Дж; Сальц, Л; Теруя-Фельдштейн, Дж; Акрам, М; Чунг, Кентукки; Яо, Д; Пати, П.Б.; Джеральд, В; Чен, Б. (2005). «Экспрессия рецептора эпидермального фактора роста и амплификация генов при колоректальной карциноме: иммуногистохимическое и хромогенное in situ исследование гибридизации » . Современная патология . 18 (10): 1350–6. doi : 10.1038/modpathol.3800417 . ПМИД   15832190 .
  17. ^ Jump up to: а б Тодорович-Ракович, Н; Йованович, Д; Нескович-Константинович, З; Николич-Вукосавлевич, Д (2005). «Сравнение иммуногистохимии и хромогенной гибридизации in situ при оценке статуса HER-2 при раке молочной железы». Международная патология . 55 (6): 318–23. дои : 10.1111/j.1440-1827.2005.01831.x . ПМИД   15943788 . S2CID   24153338 .
  18. ^ Jump up to: а б с д Роза, FE; Сантос, РМ; Рогатто, СР; Домингес, Массачусетс (2013). «Хромогенная гибридизация in situ по сравнению с другими подходами к оценке статуса HER2/neu при раке молочной железы» . Бразильский журнал медицинских и биологических исследований . 46 (3): 207–16. дои : 10.1590/1414-431x20132483 . ПМЦ   3854374 . ПМИД   23558859 .
  19. ^ Кумамото, Х; Сасано, Х; Танигучи, Т; Сузуки, Т; Мория, Т; Итинохасама, Р. (2001). «Хромогенный гибридизационный анализ in situ статуса HER-2/neu при карциноме молочной железы: применение при скрининге пациентов на терапию трастузумабом (Герцептином)». Международная патология . 51 (8): 579–84. дои : 10.1046/j.1440-1827.2001.01255.x . ПМИД   11564211 . S2CID   21849968 .
  20. ^ Митри, З; Константин, Т; О'Риган, Р. (2012). «Рецептор HER2 при раке молочной железы: патофизиология, клиническое использование и новые достижения в терапии» . Исследования и практика химиотерапии . 2012 : 1–7. дои : 10.1155/2012/743193 . ПМЦ   3539433 . ПМИД   23320171 .
  21. ^ Jump up to: а б Суэйн, С.М.; Ким, С.Б.; Кортес, Дж; Ро, Дж; Семиглазов, В; Кампоне, М; Сируэлос, Э; Ферреро, Дж. М.; Шневайс, А; Нотт, А; Кларк, Э; Росс, Дж; Беньюнес, MC; Базельга, Дж (2013). «Пертузумаб, трастузумаб и доцетаксел при HER2-положительном метастатическом раке молочной железы (исследование CLEOPATRA): результаты общего выживаемости по результатам рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования фазы 3» . Ланцет онкологии . 14 (6): 461–71. дои : 10.1016/S1470-2045(13)70130-X . ПМК   4076842 . ПМИД   23602601 .
  22. ^ Квак, Э.Л.; Банг, Ю.Дж.; Камидж, ДР; Шоу, AT; Соломон, Б; Маки, Р.Г.; Оу, С.Х.; Дезубе, Би Джей; Янне, Пенсильвания; Коста, Д.Б.; Варелла-Гарсия, М; Ким, WH; Линч, Ти Джей; Фидиас, П; Стаббс, Х; Энгельман, Дж. А.; Секвист, Л.В.; Тан, Вт; Ганди, Л; Мино-Кенудсон, М; Вэй, GC; Шрив, С.М.; Ратен, MJ; Сеттлман, Дж; Кристенсен, Дж.Г.; Хабер, Д.А.; Вилнер, К; Салгия, Р; Шапиро, Дж.И.; и др. (2010). «Ингибирование киназы анапластической лимфомы при немелкоклеточном раке легкого» . Медицинский журнал Новой Англии . 363 (18): 1693–703. дои : 10.1056/NEJMoa1006448 . ПМК   3014291 . ПМИД   20979469 .
  23. ^ Вагнер, Ф; Штребель, А; Рот, А; Стефан-Фалькенау, С; Майрингер, Т (2014). «Хромогенная гибридизация in situ (CISH) является мощным методом обнаружения ALK-положительного немелкоклеточного рака легких». Журнал клинической патологии . 67 (5): 403–7. doi : 10.1136/jclinpath-2013-201974 . ПМИД   24293609 . S2CID   25718718 .
  24. ^ Заппакоста, Р; Коласанте, А; Виола, П; д'Антуоно, Т; Латтанцио, Дж; Капанна, С; Гатта, DM; Розини, С. (2013). «Хромогенная гибридизация in situ и двойное окрашивание p16/Ki67 на образцах шейки матки, фиксированных формалином и залитых в парафин: корреляция с тестом ДНК ВПЧ, тестом мРНК E6/E7 и потенциальными клиническими применениями» . БиоМед Исследования Интернэшнл . 2013 : 1–11. дои : 10.1155/2013/453606 . ПМЦ   3858005 . ПМИД   24369532 .
  25. ^ Jump up to: а б с д и ж Шуша, С; Пестон, Д; Амо-Такий, Б; Морган, М; Джасани, Б (2009). «Оценка автоматизированной гибридизации in situ с усилением серебром (SISH) для обнаружения амплификации гена HER2 при иссечении карциномы молочной железы и образцах основной биопсии». Гистопатология . 54 (2): 248–53. дои : 10.1111/j.1365-2559.2008.03185.x . ПМИД   19207950 . S2CID   31938310 .
  26. ^ Jump up to: а б с д и Хенриксен У., Мюллер С. и Шёнау А. (2009) Глава 14: «Двухцветный CISH и преобразование FISH в CISH», стр. 97–101 в Г.Л. Кумаре и Л. Рудбеке (ред.), Иммуногистохимический (IHC) Методы окрашивания, пятое издание . Карпинтерия, Калифорния: Дако, Северная Америка
  27. ^ Jump up to: а б с д и Моллерап, Дж; Хенриксен, Ю; Мюллер, С; Шёнау, А (2012). «Двухцветная хромогенная гибридизация in situ для определения статуса HER2 при раке молочной железы: большое сравнительное исследование с современным состоянием флуоресцентной гибридизации in situ » . Клиническая патология BMC . 12 :3. дои : 10.1186/1472-6890-12-3 . ПМЦ   3305592 . ПМИД   22333181 .
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Chromogenic_in_situ_hybridization&oldid=1188179798"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 0f0f3d96f8669fa613632f532fae609c__1701625260
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/0f/9c/0f0f3d96f8669fa613632f532fae609c.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Chromogenic in situ hybridization - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)