Зонд гибридизации
 | Эта статья нуждается в дополнительных цитатах для проверки . ( декабрь 2009 г. ) |
В молекулярной биологии гибридизационный зонд ( ГП ) представляет собой фрагмент ДНК или РНК длиной обычно 15–10 000 нуклеотидов , который можно пометить радиоактивно или флуоресцентно . HP можно использовать для обнаружения присутствия нуклеотидных последовательностей в анализируемой РНК или ДНК, которые комплементарны последовательности в зонде. [1] Меченый зонд сначала денатурируется (при нагревании или в щелочных условиях, таких как воздействие гидроксида натрия ) в одноцепочечную ДНК (оцДНК), а затем гибридизуется с целевой оцДНК ( саузерн-блоттинг ) или РНК ( нозерн-блоттинг ), иммобилизованной на мембране или в место .
Чтобы обнаружить гибридизацию зонда с его целевой последовательностью, зонд помечают (или «помечают») молекулярным маркером либо радиоактивных, либо (в последнее время) флуоресцентных молекул. Обычно используемые маркеры 32 P ( радиоактивный изотоп фосфора , включенный в фосфодиэфирную связь в ДНК-зонде), дигоксигенин , нерадиоактивный маркер на основе антител , биотин или флуоресцеин. Последовательности ДНК или транскрипты РНК, которые имеют умеренное или высокое сходство последовательностей с зондом, затем обнаруживаются путем визуализации гибридизованного зонда с помощью авторадиографии или других методов визуализации. Обычно фильтр делают либо рентгеновскими снимками, либо фильтр помещают под ультрафиолетовый свет. Обнаружение последовательностей с умеренным или высоким сходством зависит от того, насколько строгие условия гибридизации были применены - высокая строгость, например, высокая температура гибридизации и низкое содержание соли в буферах для гибридизации, допускает гибридизацию только между последовательностями нуклеиновых кислот , которые очень похожи, тогда как низкая строгость, например, более низкая температура и высокое содержание соли позволяют проводить гибридизацию, когда последовательности менее похожи.
Зонды гибридизации, используемые в микрочипах ДНК, относятся к ДНК, ковалентно прикрепленной к инертной поверхности, такой как предметные стекла с покрытием или генные чипы мобильная мишень кДНК , с которыми гибридизуется . В зависимости от метода зонд можно синтезировать с использованием фосфорамидитного метода или его можно создать и пометить с помощью ПЦР- амплификации или клонирования (оба метода являются более старыми). В целях повышения стабильности in vivo зонд РНК не используют. Вместо этого аналоги РНК можно использовать морфолино , в частности производные . Зонды на основе молекулярной ДНК или РНК обычно используются при скрининге библиотек генов, обнаружении нуклеотидных последовательностей методами блоттинга и в других генных технологиях, таких как микрочипы нуклеиновых кислот и тканей .
Примеры зондов
[ редактировать ]- Зонды Скорпион®
- Молекулярные зонды- маяки
- TaqMan ® Датчики
- LNA® ( запертая нуклеиновая кислота ) Зонды
- Технология велосипедного зонда (CPT)
Использование в микробной экологии
[ редактировать ]В области микробной экологии олигонуклеотидные зонды используются для определения присутствия микробных видов, родов или микроорганизмов, классифицированных на более широком уровне, таких как бактерии , археи и эукариоты , посредством флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). [2] Зонды рРНК позволили ученым визуализировать микроорганизмы, которые еще предстоит культивировать в лабораторных условиях, путем извлечения последовательностей рРНК непосредственно из окружающей среды. [3] Примеры этих типов микроорганизмов включают:
- Nevskia ramosa : N. ramosa — нейстонная бактерия, образующая типичные дихотомически ветвящиеся розетки на поверхности мелководных пресноводных местообитаний. [4]
- Achromatium oxaliferum : эта огромная бактерия (длина клеток до >100 мкм, диаметр до 50 мкм) содержит шарики серы и массивные включения кальцита и населяет верхние слои пресноводных отложений. Он виден невооруженным глазом и своей устойчивостью к культивированию озадачил поколения микробиологов. [5]
Ограничения
[ редактировать ]В некоторых случаях дифференциация между видами может быть проблематичной при использовании последовательностей 16S рРНК из-за сходства. В таких случаях 23S рРНК . лучшей альтернативой может быть [6] Глобальная стандартная библиотека последовательностей рРНК постоянно расширяется и постоянно обновляется, а значит, и возможность случайной гибридизации между специально разработанным зондом (основанным на полных и текущих данных ряда тестовых организмов) и нежелательным/неизвестным целевой организм не может быть легко отброшен. [7] Напротив, вполне вероятно, что существуют еще не идентифицированные микроорганизмы, которые филогенетически являются членами целевой группы зонда, но имеют частичные или почти идеальные целевые сайты, что обычно применяется при разработке группоспецифичных зондов.
Вероятно, самым большим практическим ограничением этого метода является отсутствие автоматизации. [8]
Использование в судебной медицине
[ редактировать ]В криминалистике гибридизационные зонды используются, например, для обнаружения участков коротких тандемных повторов ( микросателлитов ). [9] и в методах полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ( ПДРФ ), все из которых широко используются как часть анализа профилирования ДНК .
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Гибридизация нуклеиновых кислот» . www.ndsu.edu . Проверено 26 мая 2017 г.
- ^ Аманн Р., Людвиг В. (2000). «Зонды нуклеиновых кислот, нацеленные на рибосомальную РНК, для исследований в микробной экологии» . Обзоры микробиологии FEMS . 24 (5): 555–565. дои : 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00557.x . ПМИД 11077149 .
- ^ Аманн, Р.; Людвиг, В.; Шлейфер, К.-Х. (1995). «Филогенетическая идентификация и обнаружение in situ отдельных микробных клеток без культивирования» . Микробиологические обзоры . 59 (1): 143–169. дои : 10.1128/MMBR.59.1.143-169.1995 . ПМК 239358 . PMID 7535888 .
- ^ Глекнер, Ф.О.; Бабензиен HD; Аманн Р. (1998). «Филогения и идентификация in situ Nevskia ramosa » . Прил. Окружающая среда. Микробиол . 64 (5): 1895–1901. Бибкод : 1998ApEnM..64.1895G . дои : 10.1128/АЕМ.64.5.1895-1901.1998 . ПМК 106248 . ПМИД 9572969 .
- ^ Глекнер, Ф.О.; Бабензиен HD; Аманн Р. (1999). «Филогения и разнообразие Achromatium oxaliferum ». Сист. Прил. Микробиол . 22 (1): 28–38. дои : 10.1016/s0723-2020(99)80025-3 . ПМИД 10188276 .
- ^ Фокс, GE; Визоцки, доктор медицинских наук; Юрщук младший, П. (1992). «Насколько близко значит близко: идентичности последовательности 16S рРНК может быть недостаточно, чтобы гарантировать видовую идентичность» . Межд. Дж. Сист. Бактериол . 42 (1): 166–170. дои : 10.1099/00207713-42-1-166 . ПМИД 1371061 .
- ^ Олсен, Дж.Дж.; Лейн, диджей; Джованнони, С.Дж.; Пейс, Северная Каролина; Шталь, Д.А. (1986). «Микробная экология и эволюция: подход с использованием рибосомальных РНК». Анну. Преподобный Микробиол . 40 : 337–365. дои : 10.1146/annurev.mi.40.100186.002005 . ПМИД 2430518 .
- ^ Аманн Р., Людвиг В. (2000). «Зонды нуклеиновых кислот, нацеленные на рибосомальную РНК, для исследований в микробной экологии» . Обзоры микробиологии FEMS . 24 (5): 555–565. дои : 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00557.x . ПМИД 11077149 .
- ^ Титгат, Оливье (2021). «Зонды STRide: одномеченные зонды для идентификации коротких тандемных повторов» (PDF) . Биосенсоры и биоэлектроника . 180 : 113135. doi : 10.1016/j.bios.2021.113135 . ПМИД 33690100 .