Молекулярный маяк

Молекулярные маяки , или молекулярные маяки-зонды , представляют собой олигонуклеотидов зонды гибридизации , которые могут сообщать о присутствии определенных нуклеиновых кислот в гомогенных растворах. Молекулярные маяки представляют собой шпильки молекулы в форме с внутренним погашенным флуорофором которого , флуоресценция восстанавливается, когда они связываются с последовательностью целевой нуклеиновой кислоты. Это новый нерадиоактивный метод обнаружения специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Они полезны в ситуациях, когда невозможно или желательно изолировать гибриды зонд-мишень от избытка зондов гибридизации.

Молекулярные зонды-маяки

Типичный зонд молекулярного маяка имеет длину 25 нуклеотидов . ^{[ нужна ссылка ]} Средние 15 нуклеотидов комплементарны целевой ДНК или РНК и не образуют пары оснований друг с другом, тогда как пять нуклеотидов на каждом конце комплементарны друг другу, а не целевой ДНК. Типичную структуру молекулярного маяка можно разделить на 4 части: 1) петля, область молекулярного маяка из 18–30 пар оснований, которая комплементарна целевой последовательности; 2) стебель, образованный присоединением к обоим концам петли двух коротких (5–7 нуклеотидных остатков) олигонуклеотидов, комплементарных друг другу; 3) 5'-флуорофор на 5'-конце молекулярного маяка, ковалентно присоединен флуоресцентный краситель; 4) 3'-гасящий (нефлуоресцентный) краситель, ковалентно присоединенный к 3'-концу молекулярного маяка. Когда маяк имеет форму замкнутого контура, тушитель находится вблизи флуорофора, что приводит к тушению флуоресцентного излучения последнего.

Если обнаруживаемая нуклеиновая кислота комплементарна цепи в петле, происходит гибридизация . Дуплекс, образующийся между нуклеиновой кислотой и петлей, более стабилен, чем дуплекс стебля, поскольку первый дуплекс включает больше пар оснований. Это приводит к отделению ножки и, следовательно, флуорофора и тушителя. Как только флуорофор больше не находится рядом с тушителем, освещение гибрида светом приводит к флуоресцентному излучению. Наличие эмиссии сообщает о том, что событие гибридизации произошло и, следовательно, целевая последовательность нуклеиновой кислоты присутствует в тестируемом образце.

Использование в клеточной инженерии

Сообщалось, что флуорогенные сигнальные олигонуклеотидные зонды можно использовать для обнаружения и выделения клеток, экспрессирующих один или несколько желаемых генов, включая производство мультигенных стабильных клеточных линий, экспрессирующих гетеромультимерный эпителиальный натриевый канал (αβγ-ENaC), натриевый потенциалзависимый ионный канал 1.7 (NaV1.7). -αβ1β2), четыре уникальные комбинации субъединиц ионного канала рецептора γ-аминомасляной кислоты A (ГАМКА) α1β3γ2s, α2βγ2s, α3βγ2s и α5βγ2s, регулятор проводимости муковисцидоза (CFTR), CFTR-Δ508 и два рецептора, связанных с G-белком (GPCR). ^{[ 1 ]}

Синтез

Молекулярные маяки представляют собой синтетические олигонуклеотиды , получение которых хорошо документировано. Помимо обычного набора нуклеозид-фосфорамидитов , для синтеза также требуется твердая подложка, дериватизированная тушителем, и фосфорамидитовый строительный блок, предназначенный для прикрепления защищенного флуоресцентного красителя.

Впервые термин «молекулярные маяки, синтез и демонстрация функций» был использован в 1996 году. ^{[ 2 ]}

Альтернативные технологии гомогенного анализа

Анализ TaqMan с 5'-нуклеазой ^{[ 3 ]}
Экситон-контролируемые флуоресцентные олигонуклеотидные зонды, чувствительные к гибридизации (ECHO). ^{[ 4 ]}
Датчики двойной гибридизации (LightCycler®)
Зонды Скорпионс®
Датчики LUX (Light Upon Extension)
Анализы ДНК-связывающего красителя (например, SYBR Green, SYTO9, Melt Doctor, LCGreen Plus и т. д.)

Приложения

Обнаружение SNP ^{[ 3 ]}
Обнаружение нуклеиновых кислот в реальном времени
Количественный анализ ПЦР в реальном времени
Аллельная дискриминация и идентификация ^{[ 3 ]}
Мультиплексные ПЦР-анализы
Диагностические клинические анализы

Ссылки

^ Шекдар К., Лангер Дж., Венкатачалан С., Шмид Л., Анобайл Дж., Шах П. и др. (март 2021 г.). «Метод клеточной инженерии с использованием флюорогенных олигонуклеотидных сигнальных зондов и проточной цитометрии» . Биотехнологические письма . 43 (5): 949–958. дои : 10.1007/s10529-021-03101-5 . ПМЦ 7937778 . ПМИД 33683511 .
^ Тьяги С., Крамер Ф.Р. (март 1996 г.). «Молекулярные маяки: зонды, флуоресцирующие при гибридизации». Природная биотехнология . 14 (3): 303–8. дои : 10.1038/nbt0396-303 . ПМИД 9630890 . S2CID 27010207 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Тэпп И., Мальмберг Л., Реннель Э., Вик М., Сювенен А.С. (апрель 2000 г.). «Гомогенная оценка однонуклеотидных полиморфизмов: сравнение анализа 5'-нуклеазы TaqMan и зондов Molecular Beacon» . БиоТехники . 28 (4): 732–8. дои : 10.2144/00284rr02 . ПМИД 10769752 .
^ Окамото А. (декабрь 2011 г.). «ЭХО-зонды: концепция контроля флуоресценции для практического определения нуклеиновых кислот». Обзоры химического общества . 40 (12): 5815–28. дои : 10.1039/c1cs15025a . ПМИД 21660343 .

[1] Шекдар К., Лангер Дж., Венкатачалан С., Шмид Л., Анобайл Дж., Шах П. и др. (март 2021 г.). «Метод клеточной инженерии с использованием флюорогенных олигонуклеотидных сигнальных зондов и проточной цитометрии» . Биотехнологические письма . 43 (5): 949–958. дои : 10.1007/s10529-021-03101-5 . ПМЦ 7937778 . ПМИД 33683511 .

[2] Тьяги С., Крамер Ф.Р. (март 1996 г.). «Молекулярные маяки: зонды, флуоресцирующие при гибридизации». Природная биотехнология . 14 (3): 303–8. дои : 10.1038/nbt0396-303 . ПМИД 9630890 . S2CID 27010207 .

[snp-3] Jump up to: ^а ^б ^с Тэпп И., Мальмберг Л., Реннель Э., Вик М., Сювенен А.С. (апрель 2000 г.). «Гомогенная оценка однонуклеотидных полиморфизмов: сравнение анализа 5'-нуклеазы TaqMan и зондов Molecular Beacon» . БиоТехники . 28 (4): 732–8. дои : 10.2144/00284rr02 . ПМИД 10769752 .

[4] Окамото А. (декабрь 2011 г.). «ЭХО-зонды: концепция контроля флуоресценции для практического определения нуклеиновых кислот». Обзоры химического общества . 40 (12): 5815–28. дои : 10.1039/c1cs15025a . ПМИД 21660343 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]