Блот (биология)

В молекулярной биологии и генетике блоттинг — это метод переноса крупных биомолекул ( белков , ДНК или РНК ) на носитель, например мембрану , состоящую из нитроцеллюлозы , поливинилиденфторида или нейлона . Во многих случаях это делается после гель-электрофореза , перенося молекулы из геля на блоттинг-мембрану , а в других случаях добавляя образцы непосредственно на мембрану. После блоттинга перенесенные молекулы затем визуализируются с помощью окрашивания красителем (например, окрашивания белков серебром), авторадиографической визуализации меченных радиоактивным изотопом молекул (выполняется перед блотингом) или специфического мечения некоторых белков или нуклеиновых кислот . Последнее делается с помощью антител или гибридизационных зондов , которые связываются только с некоторыми молекулами блота и к которым присоединен фермент . После правильной промывки эта ферментативная активность (и, следовательно, молекулы, обнаруженные в блоте) визуализируется путем инкубации с соответствующим реагентом, в результате чего на блоте образуется либо окрашенный осадок, либо хемилюминесцентная реакция, регистрируемая фотопленкой .

Южное пятно

Саузерн -блоттинг — это метод, обычно используемый в молекулярной биологии для обнаружения определенной последовательности ДНК в образцах ДНК. Саузерн-блоттинг сочетает в себе перенос фрагментов ДНК, разделенных электрофорезом, на мембрану фильтра и последующее обнаружение фрагментов путем гибридизации зонда. ^[1]

Вестерн-блоттинг

Вестерн -блоттинг используется для обнаружения специфических белков в сложных образцах. Белки сначала разделяют по размеру с помощью электрофореза, а затем переносят на соответствующую матрицу для блоттинга (обычно поливинилиденфторид или нитроцеллюлозу ) и последующего обнаружения с помощью антител.

Дальнезападный блот

Подобно вестерн-блоттингу , дальне-вестерн-блоттинг использует белок-белковые взаимодействия для обнаружения присутствия конкретного белка, иммобилизованного на матрице для блоттинга. Затем антитела используются для обнаружения присутствия белок-белкового комплекса, что делает дальневосточный блот специфическим случаем вестерн-блоттинга.

Юго-западный блот

Юго -вестерн-блоттинг основан на Саузерн-блоттинге и используется для идентификации и характеристики ДНК-связывающих белков по их способности связываться со специфическими олигонуклеотидными зондами. ^[2] Белки разделяют с помощью гель-электрофореза и впоследствии переносят на нитроцеллюлозные мембраны аналогично другим типам блоттинга.

Восточное пятно

Истерн -блоттинг используется для обнаружения специфических посттрансляционных модификаций белков. Белки разделяют с помощью гель-электрофореза перед переносом на блоттинг-матрицу, после чего посттрансляционные модификации выявляются с помощью специфических субстратов (холерного токсина, конканавалина, фосфомолибдата и т. д.) или антител. ^[3]

Дальневосточное пятно

Дальневосточный блоттинг предназначен для обнаружения липид-связанных олигосахаридов . Высокоэффективная тонкослойная хроматография сначала используется для разделения липидов по физическим и химическим характеристикам, затем переносится на матрицу для блоттинга, прежде чем олигосахариды будут обнаружены специфическим связывающим белком (т.е. антителами или лектинами).

Нозерн-блот

Нозерн -блоттинг предназначен для обнаружения специфических последовательностей РНК в сложных образцах. Нозерн-блоттинг сначала разделяет образцы по размеру с помощью гель-электрофореза, а затем их переносят в матрицу для блоттинга и обнаруживают с помощью меченых зондов РНК.

Обратный нозерн-блот

Обратный нозерн-блот отличается как от нозерн-, так и от Саузерн-блоттинга тем, что ДНК сначала иммобилизуют на матрице для блоттинга, а специфические последовательности выявляют с помощью меченых зондов РНК.

Дот-блот

Дот -блоттинг является частным случаем любого из вышеперечисленных блотов, когда аналит добавляется непосредственно в матрицу для блоттинга (и выглядит как «точка»), а не разделяет образец электрофорезом перед блоттингом.

Список пятен

Саузерн-блоттинг ДНК
нозерн-блот на РНК
обратный нозерн-блоттинг РНК
вестерн-блоттинг белков
дальневестерн-блоттинг белок -белковых взаимодействий
восточный блот для посттрансляционной модификации
дальневосточный блот на гликолипиды
точечное пятно

См. также

Иммуноскрининг

Ссылки

^ Таубин, Штелин Т., Гордон Дж. и др. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на листы нитроцеллюлозы: методика и некоторые применения» . ПНАС . 76 (9): 4350–4. Бибкод : 1979PNAS...76.4350T . дои : 10.1073/pnas.76.9.4350 . ПМК 411572 . ПМИД 388439 .
^ Боуэн Б., Стейнберг Дж., Леммли Великобритания, Вайнтрауб Х. (январь 1980 г.). «Обнаружение ДНК-связывающих белков методом белкового блоттинга» . Нуклеиновые кислоты Рез . 8 (1): 1–20. дои : 10.1093/нар/8.1.1 . ПМЦ 327239 . ПМИД 6243775 .
^ Томас, Тирумалапура Н., Кроссли Э.К., Исмаил Н., Уокер Д.Х. и др. (2009). «Модификации антигенных белков при эрлихиях» . Иммунология паразитов . 31 (6): 296–303. дои : 10.1111/j.1365-3024.2009.01099.x . ПМЦ 2731653 . ПМИД 19493209 .

[1] Таубин, Штелин Т., Гордон Дж. и др. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на листы нитроцеллюлозы: методика и некоторые применения» . ПНАС . 76 (9): 4350–4. Бибкод : 1979PNAS...76.4350T . дои : 10.1073/pnas.76.9.4350 . ПМК 411572 . ПМИД 388439 .

[pmid6243775-2] Боуэн Б., Стейнберг Дж., Леммли Великобритания, Вайнтрауб Х. (январь 1980 г.). «Обнаружение ДНК-связывающих белков методом белкового блоттинга» . Нуклеиновые кислоты Рез . 8 (1): 1–20. дои : 10.1093/нар/8.1.1 . ПМЦ 327239 . ПМИД 6243775 .

[3] Томас, Тирумалапура Н., Кроссли Э.К., Исмаил Н., Уокер Д.Х. и др. (2009). «Модификации антигенных белков при эрлихиях» . Иммунология паразитов . 31 (6): 296–303. дои : 10.1111/j.1365-3024.2009.01099.x . ПМЦ 2731653 . ПМИД 19493209 .

[1]

[2]

[3]