Обратный нозерн-блот
Обратный нозерн-блоттинг — это метод, с помощью которого можно анализировать закономерности экспрессии генов путем сравнения изолированных молекул РНК из тестируемого образца с образцами в контрольной библиотеке кДНК. Это вариант нозерн- блоттинга , в котором нуклеиновая кислота, иммобилизованная на мембране, представляет собой набор изолированных фрагментов ДНК , а не РНК , а зонд представляет собой РНК, экстрагированную из ткани и радиоактивно помеченную. Обратный нозерн-блоттинг можно использовать для профилирования уровней экспрессии определенных наборов последовательностей РНК в ткани или для определения присутствия определенной последовательности РНК в образце. [ 1 ] Хотя ДНК-микрочипы и новые методы следующего поколения в целом вытеснили обратный нозерн-блоттинг, они все еще используются сегодня и обеспечивают относительно дешевые и простые средства определения экспрессии больших наборов генов.
Процедура
[ редактировать ]Чтобы подготовить обратную северную мембрану, последовательности кДНК интересующих транскриптов иммобилизуют на нейлоновых мембранах, что можно осуществить с помощью дот-блоттинга или двунаправленного блоттинга в агарозном геле и УФ-фиксации ДНК на мембранах. Во многих случаях зонды кДНК могут быть предпочтительнее зондов РНК, чтобы смягчить проблемы деградации РНК под действием РНКаз или тканевых метаболитов. [ 2 ] Подготовленные мембраны обратного нозерн-блоттинга предварительно гибридизуют в растворе Денхардта с буфером SSC, а меченые зонды кДНК денатурируют при 100 ° C и добавляют в раствор для предварительной гибридизации. Мембрану инкубируют с зондами не менее 15 часов при температуре 65°С, затем промывают и экспонируют. [ 3 ]
Приложения
[ редактировать ]Количественная оценка уровней экспрессии мРНК
[ редактировать ]
Обратный нозерн-блоттинг, во многом похожий на нозерн-блоттинг, на котором он основан, используется для определения уровней экспрессии генов в определенных тканях. По сравнению с нозерн-блоттингом обратный нозерн-блоттинг позволяет одновременно исследовать большое количество транскриптов с меньшей специфичностью в отношении зондов, чем это требуется для нозерн-блоттинга. [ 4 ] Часто это будет включать использование библиотек супрессивной субтрактивной гибридизации (SSH) или дифференциального дисплея для выделения дифференциально экспрессируемых транскриптов и создания бактериальных клонов, содержащих вставки для этих последовательностей. Они будут служить мишенями, гибридизованными с мембраной, и будут исследованы образцом РНК. Уровни экспрессии можно определить количественно по увеличению или уменьшению флуоресцентного или радиоактивного сигнала по сравнению с контрольным лечением. [ 3 ] Полосы или точки, которые кажутся более темными и крупными, означают транскрипты, которые сверхэкспрессируются в интересующем образце, а более светлые точки указывают на то, что транскрипт подавлен по сравнению с контрольным образцом.
Подтверждение результатов дифференциального отображения
[ редактировать ]Из-за тенденции генерировать большое количество ложноположительных результатов, вызванных загрязнением полос гетерогенными последовательностями, совпадения дифференциального отображения необходимо будет подтверждать альтернативным методом определения дифференциальной экспрессии. [ 5 ] Хотя нозерн-блоттинг или q-ПЦР часто используются для подтверждения результатов, оба метода имеют недостатки. Нозерн-блоттинг ограничен своей способностью зондировать только одну мРНК за раз, в то время как к-ПЦР требует, чтобы транскрипты были достаточно длинными для создания праймеров для последовательности, а зонды могут быть дорогостоящими. Таким образом, обратный нозерн использовался как один из способов подтверждения совпадений с помощью DD-PCR или последовательностей с измененными уровнями экспрессии. В этом случае мембрана будет покрыта амплифицированными продуктами DD-PCR, которые были клонированы в векторы, секвенированы и повторно амплифицированы. [ 4 ]
ДНК-микрочипы
[ редактировать ]ДНК-микрочипы работают по процедурам, аналогичным тем, которые используются в обратном нозерн-блоттинге, и состоят из множества ДНК-зондов, гибридизованных с твердым стеклянным, пластиковым или кремниевым субстратом, который зондируется меченой РНК или кДНК. Это позволяет значительно расширить профилирование экспрессии генов . [ 6 ] Массивы можно приобрести у коммерческих поставщиков, адаптированных для исследовательских нужд, например, микрочипы рака, клеточного цикла или токсикологии, или могут быть созданы для индивидуальных целей. [ 7 ] Флуоресцентные или радиоактивные сигналы, генерируемые в результате гибридизации изолированных образцов кДНК-зондов, будут пропорциональны распространенности транскрипта в исследуемой ткани. [ 8 ]
Исследовательские приложения
[ редактировать ]- Обратный нозерн-блоттинг использовался в исследовании 2013 года, опубликованном в журнале Gene , в котором автор идентифицировал ряд генов, ответственных за раннюю реакцию устойчивости к холоду у морозостойких цитрусовых Poncirus trifoliata. Библиотеки супрессивной субтрактивной гибридизации формировали из обработанных холодом и контрольных растений, а клоны кДНК секвенировали и гибридизовали с мембраной, которую зондировали с помощью DIG-меченной кДНК как из контрольных, так и из обработанных холодом растений. Гены, в которых наблюдалась особенно сильная активация, включали гены спасения и защиты клеток, клеточного метаболизма и регуляции транскрипции. К ним относятся активаза оксигеназы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы, которая регулирует фотосинтетический фермент RuBisCO, GAPDH, который участвует в гликолизе и реакции на окислительный стресс, а также белок контроля деления клеток CDC91 и ген устойчивости к болезням NBS-LLR. Эти результаты были затем подтверждены с помощью qPCR. [ 9 ]
- В исследовании использовался этот метод для определения различий в ткани полосатого тела у крыс, получавших 3-NP, который часто используется в экспериментах для создания фенотипа, подобного болезни Хантингтона, у крыс. Субтрактивную гибридизацию с прямым и обратным подавлением использовали для создания профилей повышенной и недостаточной экспрессии генов, и эти библиотеки использовали для блоттинга двух мембран. Помимо аналогичных повреждений в рассеченном мозге крыс, группа наблюдала значительно повышенную экспрессию профилина-2 (Pfn2) в полосатом теле. Его сверхэкспрессия связана с уменьшением полимеризации актина и, как следствие, с более низкой плотностью дендритных шипов. [ 10 ]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Примроуз, Сэнди Б.; Твайман, Ричард (1 апреля 2009 г.). Принципы геномного анализа и геномики . Джон Уайли и сыновья. ISBN 9781444311280 .
- ^ Яакола, Лаура (2001). «Блоттинг CDNA предлагает альтернативный метод исследования экспрессии генов». Репортер по молекулярной биологии растений . 19 (2): 125–128. дои : 10.1007/BF02772154 . S2CID 22160714 .
- ^ Jump up to: а б Боулер, доктор Крис (1 января 2002 г.). Молекулярная биология растений: практический подход . Издательство Оксфордского университета. ISBN 9780199638185 .
- ^ Jump up to: а б Дилкс, Дэниел В.; Ринг, Роберт Х; Хаваджа, Ксавье З; Новак, Томас Дж; Астон, Кристофер (15 февраля 2003 г.). «Высокопроизводительное подтверждение результатов ПЦР с дифференциальным дисплеем с использованием обратного нозерн-блоттинга». Журнал методов нейробиологии . 123 (1): 47–54. CiteSeerX 10.1.1.333.8554 . дои : 10.1016/S0165-0270(02)00343-6 . ПМИД 12581848 . S2CID 6174017 .
- ^ Каллард, Д.; Лескюр, Б.; Маццолини, Л. (1994). «Метод исключения ложноположительных результатов, генерируемых методом дифференциального отображения мРНК». БиоТехники . 16 (6): 1096–7, 1100–3. ПМИД 7521188 .
- ^ Томар, Рукам С. (15 января 2010 г.). Молекулярные маркеры и биотехнология растений . Издательство Новой Индии. ISBN 9789380235257 .
- ^ Курназ, Исил Аксан (08 мая 2015 г.). Методы генной инженерии . ЦРК Пресс. ISBN 9781482260908 .
- ^ Офферманнс, Стефан (14 августа 2008 г.). Энциклопедия молекулярной фармакологии . Springer Science & Business Media. ISBN 9783540389163 .
- ^ Шахин-Чевик, Мехтап (10 января 2013 г.). «Идентификация и анализ экспрессии ранних генов, индуцированных холодом, у холодостойкого родственника цитрусовых Poncirus trifoliata (L.) Raf». Джин . 512 (2): 536–545. дои : 10.1016/j.gene.2012.09.084 . ПМИД 23026217 .
- ^ Чакраборти, Дж.; Панди, М.; Навнеет, АК; Аппукуттан, штат Техас; Варгезе, М.; Сритама, Южная Каролина; Раджамма, У.; Моханакумар, КП (2014). «Увеличенная экспрессия профилина-2 и его измененное взаимодействие с β-актином в полосатом теле при болезни Хантингтона, вызванной 3-нитропропионовой кислотой, у крыс». Нейронаука . 281 : 216–228. doi : 10.1016/j.neuroscience.2014.09.035 . ПМИД 25255934 . S2CID 5289485 .