Технология циклического зонда
Технология циклических зондов (CPT) — это молекулярно-биологический метод обнаружения определенных последовательностей ДНК . CPT работает в изотермических условиях. В некоторых случаях CPT предлагает альтернативу ПЦР . Однако, в отличие от ПЦР, CPT сам по себе не генерирует множественные копии целевой ДНК, а амплификация сигнала является линейной, в отличие от экспоненциальной амплификации целевой ДНК в ПЦР. CPT использует химерный зонд, специфичный для последовательности, который гибридизуется с комплементарной целевой последовательностью ДНК и становится субстратом для РНКазы H. Расщепление происходит по межнуклеотидным связям РНК и приводит к диссоциации зонда от мишени, тем самым делая его доступным для следующей молекулы зонда. [1] интегрированные электрокинетические системы . Для использования в CPT были разработаны [2]
Зонд
[ редактировать ]Технология циклического зонда использует химерный зонд нуклеиновой кислоты для обнаружения присутствия определенной последовательности ДНК . Химерный зонд состоит из сегмента РНК, зажатого между двумя сегментами ДНК. Сегмент РНК содержит 4 смежных пуриновых нуклеотида. Зонды должны иметь длину менее 30 нуклеотидов и быть спроектированы таким образом, чтобы минимизировать взаимодействия внутри и между зондами. [3]
Процесс
[ редактировать ]В технологии циклических зондов используется циклический изотермический процесс, который начинается с гибридизации химерного зонда с целевой ДНК. После гибридизации зонд становится подходящим субстратом для РНКазы H. РНКаза H, эндонуклеаза , расщепляет РНК-часть зонда, в результате чего образуются два химерных фрагмента. Температура плавления (T m ) вновь расщепленных фрагментов ниже температуры плавления исходного зонда. Поскольку реакция CPT изотермически поддерживается чуть выше температуры плавления исходного зонда, расщепленные фрагменты диссоциируют от целевой ДНК. После диссоциации целевая ДНК может свободно гибридизоваться с новым зондом, начиная цикл заново. [3] [4]
После того как фрагменты были расколоты и диссоциированы, они становятся обнаруживаемыми. Общая стратегия обнаружения фрагментов включает флуоресценцию . При использовании этого метода флуоресцентный маркер прикрепляется к 5'-концу зонда, а гаситель - к 3'-концу зонда. [4] [5] Когда РНКаза H расщепляет зонд, тушитель и флуоресцентный маркер разделяются, увеличивая интенсивность флуоресцентного маркера. Альтернативно расщепленные фрагменты можно обнаружить посредством амплификации (например, ПЦР ) или дальнейшей модификации, позволяющей использовать другие химические способы обнаружения. [6]
При работе с небольшими концентрациями целевой ДНК протокол CPT можно модифицировать для повышения специфичности и эффективности. Было показано, что увеличение отведенного времени повышает эффективность расщепления зонда. [4] Было показано, что как увеличение концентрации РНКазы H, так и использование зонда, не склонного к межзондовым и внутризондовым взаимодействиям, повышают специфичность. [3]
Преимущества
[ редактировать ]Поскольку технология циклического зондирования не предполагает амплификации целевой ДНК, CPT имеет меньший риск перекрестного загрязнения , чем ПЦР. [3] [4] Кроме того, CPT быстрее, чем PCR. [4] и не требует специального термоциклера . CPT также не требует использования продуктов CPT на геле .
Недостатки
[ редактировать ]Для CPT требуются специализированные химерные зонды, что делает анализы CPT более дорогими, чем ПЦР. [5] Поскольку зонды CPT очень специфичны, для каждого уникального анализа необходимо разрабатывать новый зонд, что еще больше увеличивает стоимость. Клиническая реализация затруднена с финансовой точки зрения, но она также ограничена возможностью получения образцов, содержащих неспецифические РНКазы, отличные от РНКазы H. [3]
Приложения
[ редактировать ]КПТ можно использовать для обнаружения специфических последовательностей ДНК и, в более широком смысле, специфических генотипов . Например, CPT можно использовать для того, чтобы отличить продукцию, содержащую ГМО , от продукции, не содержащей ГМО. [5] Клинически КПТ может использоваться как альтернатива культивированию клеток для выявления антибактериальной резистентности возбудителя. [4]
По своей сути CPT определяет, присутствует ли в образце определенная последовательность. Но поскольку расщепленные зонды накапливаются в соответствии с линейной кинетикой скорости , количество целевой ДНК можно определить количественно. Следовательно, CPT использовался для количественной оценки количества некодирующих повторов в организмах. [3]
CPT можно использовать в сочетании с другими технологиями, такими как молекулярные маяки и qPCR . [7]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Бхатт Р., Скотт Б., Уитни С., Брайан Р.Н., Клони Л., Лебедев А. (1999). «Обнаружение нуклеиновых кислот с помощью технологии циклического зондирования на магнитных частицах: высокая чувствительность и простота разделения». Нуклеозиды и нуклеотиды . 18 (6–7): 1297–9. дои : 10.1080/07328319908044696 . ПМИД 10474219 .
- ^ Тан Т., Бадал М.Ю., Оквирк Г., Ли ВЕ, Бадер Д.Е., Беккауи Ф., Харрисон DJ (февраль 2002 г.). «Интегрированная система микрофлюидного электрофореза для анализа генетических материалов с использованием методов усиления сигнала». Аналитическая химия . 74 (4): 725–33. дои : 10.1021/ac010874j . ПМИД 11866051 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж Беггс М.Л., Кейв М.Д., Марлоу С., Клони Л., Дак П., Эйзенах К.Д. (декабрь 1996 г.). «Характеристика прямой повторяющейся последовательности комплекса микобактерий туберкулеза для использования в реакции циклического зондирования» . Журнал клинической микробиологии . 34 (12): 2985–9. doi : 10.1128/JCM.34.12.2985-2989.1996 . ПМК 229446 . ПМИД 8940435 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж Фонг В.К., Модрусан З., Макневин Дж.П., Маростенмаки Дж., Зин Б., Беккауи Ф. (июль 2000 г.). «Быстрый твердофазный иммуноанализ для выявления метициллин-резистентного золотистого стафилококка с использованием технологии циклического зондирования» . Журнал клинической микробиологии . 38 (7): 2525–9. дои : 10.1128/JCM.38.7.2525-2529.2000 . ПМК 86959 . ПМИД 10878037 .
- ^ Jump up to: а б с Бух Гаспарик М., Джанкар К., Зел Дж., Груден К. (март 2008 г.). «Сравнение различных химических методов ПЦР в реальном времени и их пригодности для обнаружения и количественного определения генетически модифицированных организмов» . БМК Биотехнология . 8:26 . дои : 10.1186/1472-6750-8-26 . ПМК 2322970 . ПМИД 18325084 .
- ^ Уолкотт MJ (октябрь 1992 г.). «Достижения в методах обнаружения на основе нуклеиновых кислот» . Обзоры клинической микробиологии . 5 (4): 370–86. дои : 10.1128/cmr.5.4.370 . ПМЦ 358255 . ПМИД 1423216 .
- ^ Жакру Т., Рик Д.К., Цуй Р., Оуян Ю., Донг В.Дж. (январь 2013 г.). «Ферментативная амплификация передачи сигналов гибридного молекулярного маяка ДНК / РНК при обнаружении нуклеиновых кислот» . Аналитическая биохимия . 432 (2): 106–14. дои : 10.1016/j.ab.2012.09.015 . ПМЦ 3522425 . ПМИД 23000602 .