ТакМан
TaqMan Зонды представляют собой гидролизные зонды , предназначенные для повышения специфичности количественной ПЦР . Впервые об этом методе сообщил в 1991 году исследователь Кэри Маллис из Cetus Corporation. [1] Впоследствии эта технология была разработана компанией Hoffmann-La Roche для диагностических анализов и компанией Applied Biosystems (теперь часть Thermo Fisher Scientific ) для исследовательских целей.
Принцип зонда TaqMan основан на 5´-3´- экзонуклеазной активности Taq- полимеразы для расщепления зонда с двойной меткой во время гибридизации с комплементарной целевой последовательностью и обнаружения на основе флуорофора . [2] Как и в других методах количественной ПЦР , результирующий сигнал флуоресценции позволяет количественно измерять накопление продукта на экспоненциальных стадиях ПЦР; однако зонд TaqMan значительно повышает специфичность обнаружения. Зонды TaqMan были названы в честь видеоигры Pac-Man ( Taq Polymerase + PacMan = TaqMan), поскольку их механизм основан на принципе Pac-Man. [3]
Принцип
[ редактировать ]
Зонды TaqMan состоят из флуорофора, ковалентно прикрепленного к 5'-концу олигонуклеотидного зонда, и тушителя на 3'-конце. [4] несколько различных флуорофоров (например, 6-карбоксифлуоресцеин , акроним: FAM или тетрахлорфлуоресцеин, акроним: TET) и гасителей (например, тетраметилродамин , акроним: TAMRA). Доступны [5] Молекула-гаситель гасит флуоресценцию , излучаемую флуорофором при возбуждении источником света циклера посредством резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET). [6] Пока флуорофор и тушитель находятся рядом, гашение подавляет любые сигналы флуоресценции.
Зонды TaqMan сконструированы таким образом, что они отжигаются внутри участка ДНК, амплифицированного определенным набором праймеров. (В отличие от диаграммы, зонд связывается с одноцепочечной ДНК.) Зонды TaqMan можно конъюгировать с фрагментом, связывающим малую бороздку (MGB), трипептидом дигидроциклопирроиндола (DPI 3 ), чтобы увеличить его аффинность связывания с целевой последовательностью; Зонды, сопряженные с МГБ, имеют более высокую температуру плавления (T m ) из-за повышенной стабилизации сил Ван-дер-Ваальса. Когда Taq -полимераза удлиняет праймер и синтезирует возникающую цепь (из одноцепочечной матрицы), экзонуклеазная активность Taq -полимеразы с 5' по 3' разрушает зонд, который отжигается с матрицей. Деградация зонда высвобождает из него флуорофор и нарушает близость к тушителю, тем самым снимая эффект тушения и обеспечивая флуоресценцию флуорофора. Следовательно, флуоресценция, обнаруженная в количественной ПЦР, термоциклере прямо пропорциональна высвобожденному флуорофору и количеству ДНК-матрицы, присутствующей в ПЦР.
Приложения
[ редактировать ]Анализы на основе зондов TaqMan широко используются в количественной ПЦР в исследовательских и медицинских лабораториях :
- экспрессии генов Анализы
- Фармакогеномика
- Генотипирование человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)
- Определение вирусной нагрузки в клинических образцах ( ВИЧ , Гепатит )
- Бактериальная идентификация [7] анализы
- ДНК Количественное определение
- SNP-генотипирование
- Проверка микрочипов результатов
См. также
[ редактировать ]- Количественная ПЦР
- СИБР Зеленый
- Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
- Молекулярный маяк
- Экспрессия генов
Примечания и ссылки
[ редактировать ]- ^ Голландия, премьер-министр; Абрамсон, РД; Уотсон, Р.; Гельфанд, Д.Х. (1991). «Обнаружение специфического продукта полимеразной цепной реакции с использованием 5'----3'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы Thermus aquaticus» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 88 (16): 7276–7280. Бибкод : 1991PNAS...88.7276H . дои : 10.1073/pnas.88.16.7276 . ПМК 52277 . ПМИД 1871133 .
- ^ Экспрессия гена TaqMan - Проекты NCBI
- ^ ПЦР TaqMan в реальном времени и приложения в ветеринарной медицине - от PacMan до TaqMan - повторное посещение компьютерной игры. Архивировано 5 мая 2009 г. на Wayback Machine.
- ^ Зонды TaqMan: Введение, функционирование и применение.
- ^ Кутявин И.В., Афонина И.А., Миллс А., Горн В.В., Лухтанов Е.А., Белоусов Е.С., Сингер М.Дж., Вальбургер Д.К., Лохов С.Г., Галл А.А., Демпси Р., Рид М.В., Мейер Р.Б., Хеджпет Дж. (2000). «3'-зонды связывания ДНК с малой бороздкой повышают специфичность последовательности при температурах удлинения ПЦР» . Нуклеиновые кислоты Рез . 28 (2): 655–661. дои : 10.1093/нар/28.2.655 . ПМК 102528 . ПМИД 10606668 .
- ^ Бустин С.А. (октябрь 2000 г.). «Абсолютное количественное определение мРНК с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени» . Дж. Мол. Эндокринол . 25 (2): 169–93. дои : 10.1677/jme.0.0250169 . ПМИД 11013345 .
- ^ AlleleID - Дизайн анализа для идентификации бактерий
Внешние ссылки
[ редактировать ]1. Ресурсы TaqMan RT-PCR — базы данных праймеров, программное обеспечение, протоколы. Архивировано 25 ноября 2010 г. на Wayback Machine.
2. Beacon Designer — программное обеспечение для разработки праймеров и зондов для ПЦР в реальном времени, включая праймеры SYBR Green, зонды TaqMan, молекулярные маяки.