Taq -полимераза
| ДНК-полимераза I, термостабильная | |||
|---|---|---|---|
 Большой (Кленов) фрагмент Taq polA, содержащий polA и рудиментарные домены. | |||
| Идентификаторы | |||
| Организм | |||
| Символ | автор А | ||
| ЮниПрот | P19821 | ||
| |||
Taq -полимераза представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу I, названную в честь термофильного эубактериального микроорганизма Thermus aquaticus , из которого она была первоначально выделена Chien et al. в 1976 году. [1] Его название часто сокращается до Taq или Taq pol . Его часто используют в полимеразной цепной реакции (ПЦР), методе значительного увеличения количества коротких сегментов ДНК .
T. aquaticus — бактерия , обитающая в горячих источниках и гидротермальных источниках , и Taq . была идентифицирована полимераза [1] как фермент, способный противостоять условиям денатурации белка (высокая температура), необходимым во время ПЦР. [2] Таким образом, она заменила ДНК-полимеразу E. coli , первоначально использовавшуюся в ПЦР. [3]
Ферментативные свойства
[ редактировать ]Taq Оптимальная температура активности составляет 75–80 ° C, с периодом полураспада более 2 часов при 92,5 ° C, 40 минут при 95 ° C и 9 минут при 97,5 ° C, и он может воспроизводить пару оснований из 1000. цепь ДНК менее чем за 10 секунд при 72 °C. [4] При 75–80 ° C Taq достигает оптимальной скорости полимеризации , составляющей около 150 нуклеотидов в секунду на молекулу фермента, и любые отклонения от оптимального температурного диапазона подавляют скорость расширения фермента. Один Taq синтезирует около 60 нуклеотидов в секунду при 70 °C, 24 нуклеотида в секунду при 55 °C, 1,5 нуклеотидов в секунду при 37 °C и 0,25 нуклеотидов в секунду при 22 °C. При температуре выше 90 °C Taq проявляет очень небольшую активность или вообще не проявляет ее, но сам фермент не денатурирует и остается неповрежденным. [5] Наличие определенных ионов в реакционном сосуде также влияет на удельную активность фермента. Небольшие количества хлорида калия (KCl) и ионов магния (Mg 2+ ) способствуют Taq ферментативной активности . Taq -полимераза максимально активируется при 50 мМ KCl, тогда как оптимальная концентрация Mg 2+ концентрация определяется концентрацией нуклеозидтрифосфатов (dNTP). Высокие концентрации KCl и Mg 2+ ингибировать активность Taq . [6] Обычный хелатор ионов металлов ЭДТА напрямую связывается с Taq в отсутствие ионов этих металлов. [7]
Одним из недостатков Taq является отсутствие от 3’ до 5’. экзонуклеазы корректурной активности [4] что приводит к относительно низкой точности репликации. Первоначально частота ошибок составляла примерно 1 на 9000 нуклеотидов. [8] Некоторые термостабильные ДНК-полимеразы были выделены из других термофильных бактерий и архей, такие как Pfu ДНК-полимераза , обладающая корректурной активностью, и используются вместо Taq (или в сочетании с ним) для высокоточной амплификации. [9] Точность может сильно различаться в зависимости от Taq, что имеет серьезные последствия для последующих приложений секвенирования. [10]
Taq производит продукты ДНК, у которых А ( аденин на 3'-концах имеется выступающий ). Это может быть полезно при клонировании ТА , при этом используется клонирующий вектор (такой как плазмида ), имеющий 3'-конец Т ( тимин ), который дополняет выступ А-конца продукта ПЦР, что позволяет лигировать продукт ПЦР в плазмидный вектор.
В ПЦР
[ редактировать ]В начале 1980-х Кэри Маллис работал в Cetus Corporation над применением синтетических ДНК в биотехнологии . Он был знаком с использованием ДНК- олигонуклеотидов в качестве зондов для связывания с целевыми цепями ДНК, а также с их использованием в качестве праймеров для секвенирования ДНК и синтеза кДНК . В 1983 году он начал использовать два праймера, один для гибридизации с каждой цепью целевой ДНК, и добавлять ДНК-полимеразу в реакцию . Это привело к экспоненциальной репликации ДНК . [11] значительно усиливая дискретные сегменты ДНК между праймерами. [3]
Однако после каждого раунда репликации смесь необходимо нагреть выше 90 ° C, чтобы денатурировать вновь образованную ДНК, позволяя нитям разделиться и действовать как матрицы в следующем раунде амплификации. Этот этап нагревания также инактивирует ДНК-полимеразу, которая использовалась до открытия Taq -полимеразы, фрагмента Кленова (полученного из E. coli ). Taq -полимераза хорошо подходит для этого применения, поскольку она способна выдерживать температуру 95 ° C, необходимую для разделения цепей ДНК без денатурации.
Использование термостабильного Taq позволяет проводить ПЦР при высокой температуре (~60 °C и выше), что способствует высокой специфичности праймеров и снижает образование неспецифических продуктов, таких как димер праймера . Кроме того, использование термостабильной полимеразы устраняет необходимость добавления нового фермента в каждый цикл термоциклирования. одну закрытую трубку в относительно простой машине Для выполнения всего процесса можно использовать . Таким образом, использование Taq -полимеразы стало ключевой идеей, которая сделала ПЦР применимой для решения широкого спектра задач молекулярной биологии, связанных с анализом ДНК. [2]
Патентные вопросы
[ редактировать ]В конечном итоге Hoffmann-La Roche на PCR и Taq купила у Cetus патенты за 330 миллионов долларов, из которых могла получить до 2 миллиардов долларов гонораров. [12] В 1989 году журнал Science Magazine назвал Taq -полимеразу своей первой « молекулой года ». Кэри Маллис получил Нобелевскую премию по химии в 1993 году — единственную премию, присуждаемую за исследования, проведенные в биотехнологической компании. К началу 1990-х годов метод ПЦР с Taq- полимеразой использовался во многих областях, включая фундаментальные исследования в области молекулярной биологии, клинические испытания и судебную экспертизу . Он также начал находить актуальное применение для прямого выявления ВИЧ при СПИДе . [13]
В декабре 1999 года окружной судья США Вон Уокер постановил, что патент 1990 года на полимеразу Taq был выдан частично на основании вводящей в заблуждение информации и ложных заявлений ученых из Cetus Corporation . Постановление поддержало иск корпорации Promega против компании Hoffman-La Roche , которая приобрела патенты Taq в 1991 году. Судья Уокер сослался на предыдущие открытия, сделанные другими лабораториями, включая лабораторию профессора Джона Трелы на Университета Цинциннати факультете биологических наук , как основание для постановления. [14]
Доменная структура
[ редактировать ]| Taq-полимераза, экзонуклеаза | |||
|---|---|---|---|
 Полная ДНК-полимераза Taq , связанная с октамером ДНК | |||
| Идентификаторы | |||
| Символ | Так-экзонук | ||
| Пфам | PF09281 | ||
| ИнтерПро | ИПР015361 | ||
| СКОП2 | 1 кв.м / ОБЪЕМ / СУПФАМ | ||
| |||
Taq Pol A имеет общую структуру, аналогичную структуре PolA E. coli . Средний 3'-5'-домен экзонуклеазы, ответственный за корректуру, резко изменился и не функционирует. [15] Он имеет функциональный 5'-3' экзонуклеазный домен на аминоконце, описанный ниже. Остальные два домена действуют согласованно посредством связанного движения доменов. [16]
Экзонуклеазный домен
[ редактировать ]Taq- Экзонуклеаза полимеразы представляет собой домен, обнаруженный на аминоконце Taq ДНК- полимеразы I (термостабильной). Он предполагает рибонуклеазный H-подобный мотив . Домен придает 5'- 3' экзонуклеазную активность. полимеразе [17]
В отличие от того же домена в E. coli , который разрушает праймеры и должен быть удален путем расщепления для использования в ПЦР, [9] Не говорят, что этот домен ухудшает праймер. [18] Эта активность используется в зонде TaqMan : по мере формирования дочерних цепей зонды, комплементарные матрице, вступают в контакт с полимеразой и расщепляются на флуоресцентные фрагменты. [19]
Связывание с ДНК
[ редактировать ]Taq -полимераза связывается в щели своего активного сайта полимеразы с тупым концом дуплексной ДНК. Когда Taq -полимераза контактирует со связанной ДНК, ее боковые цепи образуют водородные связи с пуринами и пиримидинами ДНК. Тот же участок Taq -полимеразы, который связан с ДНК, также связывается с экзонуклеазой. Эти структуры, связанные с Taq- полимеразой, взаимодействуют по-разному.
Мутанты
[ редактировать ]Сообщалось об эксперименте по сайт-направленному мутагенезу , который улучшает активность рудиментарной 3'-5'-экзонуклеазы в 2 раза, но никогда не сообщалось, снижает ли это частоту ошибок. [20] Следуя аналогичному подходу, белки-химеры были созданы путем сбора доменов из E. coli , Taq и полимеразы I T. neapolitana . Замена рудиментарного домена на функциональный из E. coli позволила создать белок с доказанной эффективностью. способность чтения, но более низкая оптимальная температура и низкая термостабильность. [21]
Были созданы версии полимеразы без 5'-3' экзонуклеазного домена, среди которых Klentaq или фрагмент Стоффеля наиболее известны . Полное отсутствие экзонуклеазной активности делает эти варианты пригодными для праймеров, обладающих вторичной структурой, а также для копирования кольцевых молекул. [9] Другие варианты включают использование Klentaq с высокоточной полимеразой, термосеквеназы , которая распознает субстраты, такие как ДНК-полимераза T7 , мутантов с более высокой толерантностью к ингибиторам или версий с «доменной меткой», которые имеют дополнительный мотив спираль-шпилька-спираль вокруг каталитической сайт, позволяющий более прочно удерживать ДНК, несмотря на неблагоприятные условия. [22]
Значение в выявлении заболеваний
[ редактировать ]Благодаря улучшениям Taq -полимеразы, обеспечиваемым репликацией ДНК ПЦР: более высокой специфичностью, меньшим количеством неспецифических продуктов, а также более простыми процессами и оборудованием, она сыграла важную роль в усилиях по обнаружению заболеваний. «Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний привело к возможности ранней диагностики и надлежащего лечения заболеваний, вызванных прихотливыми патогенами, определения чувствительности к противомикробным препаратам медленно растущих организмов и определения масштаба инфекции». [23] Внедрение Taq -полимеразы спасло бесчисленное количество жизней. Он сыграл важную роль в выявлении многих худших заболеваний в мире, в том числе: туберкулеза, стрептококкового фарингита, атипичной пневмонии, СПИДа, кори, гепатита и язвенных урогенитальных инфекций. ПЦР, метод, используемый для воссоздания копий определенных образцов ДНК, делает возможным обнаружение заболеваний путем нацеливания на определенную последовательность ДНК целевого патогена из образца пациента и амплификации следовых количеств индикаторных последовательностей путем их копирования до миллиардов раз. Хотя это наиболее точный метод выявления заболеваний, особенно ВИЧ, он применяется не так часто, как альтернативные, худшие тесты, из-за относительно высокой стоимости, трудозатрат и времени. [24]
Использование Taq -полимеразы в качестве катализатора процесса репликации ПЦР было подчеркнуто во время пандемии COVID-19 в 2020 году. Нехватка необходимого фермента ослабила способность стран мира производить наборы для тестирования на вирус. Без Taq- полимеразы процесс выявления заболеваний становится намного медленнее и утомительнее. [25]
Несмотря на преимущества использования Taq -полимеразы при выявлении заболеваний с помощью ПЦР, этот фермент не лишен недостатков. Ретровирусные заболевания (ВИЧ, HTLV-1 и HTLV-II) часто включают в своем геноме мутации от гуанина к аденину. Подобные мутации позволяют ПЦР-тестам выявлять заболевания, но относительно низкая точность Taq -полимеразы приводит к возникновению той же мутации G-to-A и, возможно, к ложноположительному результату теста. [26]
См. также
[ редактировать ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Чиен А., Эдгар Д.Б., Трела Дж.М. (сентябрь 1976 г.). «Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты крайнего термофила Thermus aquaticus» . Журнал бактериологии . 127 (3): 1550–7. дои : 10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976 . ПМК 232952 . ПМИД 8432 .
- ^ Jump up to: а б Сайки Р.К., Гельфанд Д.Х., Стоффель С., Шарф С.Дж., Хигучи Р., Хорн Г.Т. и др. (январь 1988 г.). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы». Наука . 239 (4839): 487–91. Бибкод : 1988Sci...239..487S . дои : 10.1126/science.2448875 . ПМИД 2448875 .
- ^ Jump up to: а б Сайки Р.К., Шарф С., Фалуна Ф., Муллис К.Б., Хорн Г.Т., Эрлих Х.А., Арнгейм Н. (декабрь 1985 г.). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии» . Наука . 230 (4732): 1350–4. Бибкод : 1985Sci...230.1350S . дои : 10.1126/science.2999980 . ПМИД 2999980 . Архивировано из оригинала 19 декабря 2008 г.
- ^ Jump up to: а б Юрист ФК, Стоффель С., Сайки Р.К., Чанг С.Ю., Ландре П.А., Абрамсон Р.Д., Гельфанд Д.Х. (май 1993 г.). «Высокоуровневая экспрессия, очистка и ферментативная характеристика полноразмерной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и укороченной формы с дефицитом экзонуклеазной активности от 5' до 3'» . Методы и приложения ПЦР . 2 (4): 275–87. дои : 10.1101/гр.2.4.275 . ПМИД 8324500 .
- ^ Протоколы ПЦР: руководство по методам и применению . Иннис, Майкл А. Сан-Диего: Academic Press. 1990. ISBN 978-0123721808 . OCLC 19723112 .
{{cite book}}: CS1 maint: другие ( ссылка ) - ^ Технология ПЦР: принципы и применение амплификации ДНК . Эрлих, Генри А., 1943-. Нью-Йорк: Стоктон Пресс. 1989. ISBN 978-0333489482 . OCLC 19323242 .
{{cite book}}: CS1 maint: другие ( ссылка ) - ^ Лопата А., Жоярт Б., Сураньи Э.В., Такач Э., Безур Л., Левелес И. и др. (октябрь 2019 г.). «Помимо хелатирования: ЭДТА прочно связывает ДНК-полимеразу Taq, MutT и dUTPase и напрямую ингибирует активность dNTPase» . Биомолекулы . 9 (10): 621. дои : 10.3390/biom9100621 . ПМК 6843921 . ПМИД 31627475 .
- ^ Тиндалл К.Р., Кункель Т.А. (август 1988 г.). «Правильность синтеза ДНК ДНК-полимеразой Thermus aquaticus». Биохимия . 27 (16): 6008–13. дои : 10.1021/bi00416a027 . ПМИД 2847780 .
- ^ Jump up to: а б с ван Пелт-Веркуил Э., ван Белкум А., Хейс Дж. П. (2008). «Taq и другие термостабильные ДНК-полимеразы». Принципы и технические аспекты ПЦР-амплификации . стр. 103–18. дои : 10.1007/978-1-4020-6241-4_7 . ISBN 978-1-4020-6240-7 .
- ^ Брандарис-Фонтес С, Камачо-Санчес М, Вила С, Вега-Пла Х.Л., Рико С., Леонард Х.А. (январь 2015 г.). «Влияние фермента и условий ПЦР на качество результатов высокопроизводительного секвенирования ДНК» . Научные отчеты . 5 : 8056. Бибкод : 2015NatSR...5E8056B . дои : 10.1038/srep08056 . ПМК 4306961 . ПМИД 25623996 .
- ^ Муллис КБ (апрель 1990 г.). «Необычное происхождение полимеразной цепной реакции». Научный американец . 262 (4): 56–61, 64–5. Бибкод : 1990SciAm.262d..56M . doi : 10.1038/scientificamerican0490-56 . ПМИД 2315679 .
- ^ Фор Дж., Вичерс И.Р., Кук-Диган Р. (июль 2006 г.). «Влияние деловой практики, лицензирования и интеллектуальной собственности на развитие и распространение полимеразной цепной реакции: тематическое исследование» . Журнал биомедицинских открытий и сотрудничества . 1 :7. дои : 10.1186/1747-5333-1-7 . ПМЦ 1523369 . ПМИД 16817955 .
Подробная история корпорации Cetus и коммерческие аспекты ПЦР. - ^ Гуателли Дж. К., Гингерас Т. Р., Ричман Д. Д. (апрель 1989 г.). «Амплификация нуклеиновых кислот in vitro: обнаружение последовательностей с низким числом копий и применение для диагностики инфекции вируса иммунодефицита человека типа 1» . Обзоры клинической микробиологии . 2 (2): 217–26. дои : 10.1128/CMR.2.2.217 . ПМК 358112 . ПМИД 2650862 .
- ↑ Карран, Крис, Биомедицина, 7 декабря 1999 г.
- ^ Эом С.Х., Ван Дж., Стейц Т.А. (июль 1996 г.). «Структура Taq-полимеразы с ДНК в активном центре полимеразы». Природа . 382 (6588): 278–81. Бибкод : 1996Natur.382..278E . дои : 10.1038/382278a0 . ПМИД 8717047 . S2CID 4372845 .
- ^ Бу З, Биль Р., Монкенбуш М., Рихтер Д., Каллауэй DJ (декабрь 2005 г.). «Связанное движение белковых доменов в Taq-полимеразе, выявленное с помощью нейтронной спин-эхо-спектроскопии» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (49): 17646–51. Бибкод : 2005PNAS..10217646B . дои : 10.1073/pnas.0503388102 . ПМЦ 1345721 . ПМИД 16306270 .
- ^ Ли Ю, Митаксов В, Ваксман Г (август 1999 г.). «Структурный дизайн Taq ДНК-полимераз с улучшенными свойствами включения дидезоксинуклеотидов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 96 (17): 9491–6. Бибкод : 1999PNAS...96.9491L . дои : 10.1073/pnas.96.17.9491 . ПМК 22236 . ПМИД 10449720 .
- ^ «Будет ли эндонуклеазная активность 5'→3' лоскута ДНК-полимеразы Taq разрушать праймеры?» . НЭБ . Проверено 28 марта 2019 г.
- ^ Экспрессия гена TaqMan - Проекты NCBI
- ^ Пак Ю, Чой Х, Ли Д.С., Ким Ю (июнь 1997 г.). «Улучшение 3'-5' экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы Taq путем белковой инженерии в активном центре» . Молекулы и клетки . 7 (3): 419–24. ПМИД 9264032 .
- ^ Виллбрандт Б., Собек Х., Фрей Б., Шомбург Д. (сентябрь 2000 г.). «Обмен доменами: химеры ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, ДНК-полимеразы I Escherichia coli и ДНК-полимеразы Thermotoga neapolitana» . Белковая инженерия . 13 (9): 645–54. дои : 10.1093/протеин/13.9.645 . ПМИД 11054459 .
- ^ Исино С, Исино Ю (2014). «ДНК-полимеразы как полезные реагенты для биотехнологии - история исследований в этой области» . Границы микробиологии . 5 : 465. дои : 10.3389/fmicb.2014.00465 . ПМК 4148896 . ПМИД 25221550 .
- ^ Менон П.К., Капила К., Охри В.К. (июль 1999 г.). «Полимеразная цепная реакция и достижения в диагностике инфекционных заболеваний» . Медицинский журнал Вооруженных Сил Индии . 55 (3): 229–231. дои : 10.1016/S0377-1237(17)30450-1 . ПМЦ 5531883 . ПМИД 28775636 .
- ^ «Полимеразная цепная реакция (ПЦР)» . stanfordhealthcare.org . Проверено 23 апреля 2020 г.
- ^ «Глава FDA предупреждает о «давлении» на поставку реагентов для тестов на коронавирус» . Медтех-дайв . Проверено 23 апреля 2020 г.
- ^ Овербо Дж., Джексон С.М., Папенхаузен М.Д., Руденси Л.М. (ноябрь 1996 г.). «Лентивирусные геномы с гипермутацией G-на-A могут быть результатом ошибок Taq-полимеразы во время полимеразной цепной реакции». Исследования СПИДа и ретровирусы человека . 12 (17): 1605–13. дои : 10.1089/aid.1996.12.1605 . ПМИД 8947295 .
