ПЦР с горячим стартом

ПЦР с горячим стартом — это модифицированная форма традиционной полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая уменьшает присутствие нежелательных продуктов и димеров праймеров за счет неспецифической амплификации ДНК при комнатной (или более холодной) температуре. ^[1]^[2] Для достижения более высоких выходов было разработано множество вариантов и модификаций процедуры ПЦР; ПЦР с горячим стартом – один из них. ^[3] ПЦР с горячим стартом следует тем же принципам, что и обычная ПЦР, - в ней используется ДНК-полимераза для синтеза ДНК из одноцепочечной матрицы. ^[4] Однако в нем используются дополнительные методы нагревания и разделения, такие как инактивация или ингибирование связывания Taq-полимеразы и позднее добавление Taq-полимеразы, чтобы увеличить выход продукта, а также обеспечить более высокую специфичность и чувствительность. ^[5] Неспецифическое связывание и праймирование или образование димеров праймеров сводятся к минимуму за счет завершения реакционной смеси после денатурации . ^[6] Некоторые способы завершения реакционных смесей при высоких температурах включают модификации, которые блокируют активность ДНК-полимеразы при низких температурах. ^[1]^[7] использование модифицированных дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP), ^[8] и физическое добавление одного из основных реагентов после денатурации. ^[9]

Благодаря этим дополнительным методам ПЦР с горячим стартом способна уменьшить количество неспецифических амплификаций, которые естественным образом возникают при более низких температурах, что остается проблемой для традиционной ПЦР. Эти модификации в целом гарантируют, что определенные ферменты в растворе останутся неактивными или ингибируются до тех пор, пока не будет достигнута оптимальная температура отжига. ^[10] Ингибирование образования неспецифических продуктов ПЦР, особенно в ранних циклах, приводит к существенному повышению чувствительности амплификации методом ПЦР. Это имеет первостепенное значение в диагностических применениях ПЦР или RT-PCR.

Фон

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярной биологии, используемый для амплификации определенных сегментов ДНК на несколько порядков. Конкретные сегменты ДНК амплифицируются в ходе трех процессов: денатурации, отжига и удлинения, при которых цепи ДНК разделяются путем повышения температуры до оптимальной по сравнению с комнатной, прежде чем праймеры связываются, а полимераза выравнивает нуклеотиды с цепью матрицы. Он использует ДНК-полимеразу , которая малоактивна при низких температурах. ^[1] В обычной ПЦР реакционная смесь завершается при комнатной температуре, и из-за активности ДНК-полимеразы праймеры могут образовывать димеры праймеров или неспецифически отжигаться с ДНК. Во время процедуры ПЦР ДНК-полимераза удлиняет любой участок ДНК связанными праймерами, генерируя целевые продукты, а также неспецифические продукты, которые снижают выход. При ПЦР с горячим стартом некоторые реагенты хранятся отдельно до тех пор, пока смесь не нагреется до определенной температуры отжига. Это сокращает время отжига, что, в свою очередь, снижает вероятность неспецифического удлинения ДНК и влияние связывания неспецифического праймера перед денатурацией. ^[6]^[5]

В обычной ПЦР более низкие температуры ниже оптимальной температуры отжига (50–65 ° C) приводят к нецелевым модификациям, таким как неспецифические амплификации, когда праймеры неспецифично связываются с нуклеиновой кислотой. ^[5] Эти неспецифические комплексы праймеров, которые находятся в избытке в смеси, являются причиной синтеза побочных продуктов, таких как димеры праймеров и неправильное праймирование. ^[10] Неправильный прайминг значительно затрудняет и снижает эффективность ПЦР-амплификации из-за активной конкуренции с целевыми последовательностями за амплификацию. Аналогично, димеры праймеров образуют комплексы, что уменьшает количество получаемых амплификаций числа копий. ^[10] Это можно контролировать путем внедрения ПЦР с горячим стартом, которая позволяет блокировать удлинение праймера до тех пор, пока не будут достигнуты оптимальные температуры. ^[2]

При ПЦР с горячим стартом важные реагенты (такие как ДНК-полимераза и кофакторы магния ) не могут вступать в реакцию в смеси для ПЦР до тех пор, пока не будут достигнуты оптимальные температуры за счет физического разделения или химических модификаций. ^[5]^[2] ПЦР с горячим стартом также может происходить, когда Taq-полимераза ингибируется/инактивируется или ее добавление задерживается до достижения оптимальных температур отжига, посредством модификаций дезоксирибонуклеотидтрифосфата или путем модификации праймеров посредством захвата клеток и манипуляций со вторичной структурой .

ПЦР с горячим стартом часто является лучшим подходом по сравнению с традиционной ПЦР в обстоятельствах, когда в реакционной смеси низкая концентрация ДНК, матрица ДНК очень сложна или если присутствует несколько пар олигонуклеотидных праймеров. в ПЦР ^[3]

Методы

ПЦР с горячим стартом — это метод, который предотвращает расширение ДНК-полимеразы при более низкой температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание и минимизировать потерю выхода. ПЦР с горячим стартом снижает количество неспецифического связывания за счет ограничения реагентов до этапа нагревания ПЦР - ограничивайте реакцию на ранней стадии, ограничивая ДНК-полимеразу Taq в реакции. Неспецифическое связывание часто приводит к образованию димеров праймеров и неправильному праймированию/ложному праймированию мишеней. ^[11] Их можно исправить с помощью модифицированных методов, таких как:

Инактивация/ингибирование ДНК-полимеразы Taq

Фермент-связанные антитела/ДНК-полимераза Taq в комплексе с антителами против ДНК-полимеразы Taq:

Связанные с ферментом антитела инактивируют ДНК-полимеразу Taq. Антитела связываются с полимеразой, предотвращая раннюю амплификацию ДНК, которая может произойти при более низких температурах. Как только будет достигнута оптимальная температура отжига, антитела начнут разлагаться и диссоциировать, высвобождая ДНК-полимеразу Taq в реакцию и позволяя начать процесс амплификации. ^[2]^[12] ДНК-полимераза Platinum Taq и ДНК-полимераза AccuStart Taq (обе разработаны Аюбом Ращианом из Life Technologies и Quanta BioSciences соответственно) являются примерами коммерчески доступных ДНК-полимераз Taq с горячим стартом на основе антител. Эти ДНК-полимеразы Taq предварительно образуют комплекс со смесью моноклональных антител, специфичных к ДНК-полимеразе Taq. ^[13]

Восковые бусины:

Между ДНК-полимеразой Taq и остальными компонентами ПЦР создается физический барьер с помощью восковых шариков, которые зависят от температуры. Как только температура поднимается выше 70 °C, на этапе денатурации в первом цикле восковые шарики плавятся, позволяя ДНК-полимеразе Taq выйти за барьер и высвободиться в реакцию, запуская процесс амплификации. Затем на стадии амплификации слой воска перемещается к верхней части реакционной смеси, чтобы позже действовать как барьер для пара. ^[2]

Высокоспецифичные олигонуклеотиды:

Олигонуклеотиды представляют собой короткие полимеры нуклеиновой кислоты, которые легко связываются. Высокоспецифичные олигонуклеотиды, такие как аптамеры, связываются с ДНК-полимеразой Taq при более низких температурах, что делает ее неактивной в смеси. Только при более высоких температурах олигонуклеотиды отделятся от Taq, позволяя ему вступить в реакцию. ^[5]

Это наиболее эффективные методы ПЦР с горячим стартом. Методы с использованием связанных с ферментом антител и высокоспецифичных олигонуклеотидов особенно подходят для процедур, требующих более короткого времени инактивации. ^[14] Однако известно, что реализуются и другие методы, такие как:

Позднее добавление ДНК-полимеразы Taq

Предварительный нагрев:

Аппарат для ПЦР заранее нагревается, пока компоненты смешиваются со льдом, а затем сразу же помещаются в аппарат для ПЦР, как только он достигнет оптимальной температуры. Это устранит необходимый процесс прогрева, уменьшит неспецифический отжиг праймеров и обеспечит разделение любых не спаренных праймеров в смеси. ^[15]

Замораживание:

Замораживание действует как форма физического разделения, подобно восковым шарикам. Реакционную смесь, содержащую праймеры, цепь матрицы, воду и дезоксирибонуклеотидтрифосфат (dNTP), замораживают перед Taq-полимеразой, а остальные компоненты ПЦР добавляют поверх замороженной смеси. Это предотвращает неспецифическое связывание. ^[15]

Позднее добавление Taq:

Компоненты ПЦР в реакционной смеси готовят и нагревают без добавления Taq. Taq вводится в смесь только позже, когда достигается оптимальная температура. Однако этот метод наименее надежен и может привести к загрязнению компонентов. ^[15]

Другой метод - это ПЦР с горячим стартом, опосредованная дезоксирибонуклеотидтрифосфатом, которая модифицирует нуклеотидные основания посредством защитной группы.

Модификации дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP)

Горячий старт dNTP может быть химически модифицирован для включения термочувствительной защитной группы на 3-м штрих-конце. Эта модификация предотвратит взаимодействие нуклеотидов с Taq-полимеразой для связывания с цепью матрицы до тех пор, пока не будут достигнуты оптимальные температуры, поэтому защитная группа будет удалена на этапе тепловой активации. Горячий старт dNTP, dA, dT, dC и dG заменяют природные нуклеотиды. ^[16]^[17] Рекомендуется использовать все четыре модифицированных нуклеотида, однако предыдущие исследования показали, что замены одного или двух природных нуклеотидов модифицированными dNTP будет достаточно, чтобы гарантировать отсутствие неспецифической амплификации. ^[16]^[17] Другая химическая модификация нуклеиновой кислоты осуществляется посредством термообратимой ковалентной модификации, которая препятствует гибридизации праймеров с интересующей матрицей. Аминогруппа гуанозина взаимодействует с глиоксалем с образованием dG. ^[18]

Модифицированные праймеры

Вторичная структура:

Определенная вторичная структура может препятствовать функциям праймеров. Например, олигонуклеотиды со структурой шпильки не могут эффективно действовать в качестве праймера. Однако после нагрева реакционной смеси до температуры отжига праймер претерпит конформационное изменение, позволяя вместо этого праймеру сформировать линейную структуру, что позволяет праймеру прикрепиться к целевому сегменту и начать ПЦР. ^[19]^[20] На самом деле, существует более стабильная конфигурация шпилечных праймеров, называемая «двухпузырчатыми» праймерами, которые образуют гомодимерную конфигурацию «от головы к хвосту», которую можно использовать как для обратной транскрипции, так и для ПЦР с горячим стартом. ^[21]

Фотохимически съемные клетки:

Каркасная группа, которая представляет собой защитную группу, удаляемую фотохимически, такая как каркасные тимидинфосфорамидиты, включена в олигонуклеотидный праймер. Это позволяет активировать и деактивировать функцию праймера с помощью УФ-облучения (365 нм). Следовательно, праймеры можно активировать после достижения температуры отжига. ^[22]

Контролируемое добавление магния

Магний необходим для ПЦР и действует как кофактор, поскольку Taq-полимераза зависит от магния. ^[23] Увеличение концентрации магния и фосфата по сравнению со стандартными буферными реагентами приводит к образованию осадка магния , обеспечивая горячий старт реакции, поскольку магний для ДНК-полимеразы отсутствует до стадии термоциклирования. Во время термоциклирования магний снова растворяется в растворе и становится доступным для использования полимеразой, что позволяет ей нормально функционировать. ^[24]

Преимущества

Преимущество ПЦР с горячим стартом заключается в том, что она требует меньше манипуляций и снижает риск загрязнения. ПЦР с горячим стартом может быть либо химически модифицированной, либо основанной на антителах, что дает этой процедуре различные преимущества. При химически модифицированной ПЦР с горячим стартом процедуру можно проводить при комнатной температуре, и она значительно уменьшает образование димеров праймеров, предотвращая связывание праймеров друг с другом до начала процесса ПЦР, а также ограничивая неспецифическое праймирование. Аналогичным образом, ПЦР с горячим стартом ингибирует связывание праймеров с последовательностями матрицы, имеющими низкую гомологию, что приводит к неправильному праймированию. Благодаря строгим условиям он также может улучшить специфичность и чувствительность, а также увеличить выход продукта целевого фрагмента. ^[5] В ПЦР с горячим стартом на основе антител полимераза активируется после начальной стадии денатурации во время циклического процесса, что сокращает необходимое время. Это также приводит к высокой специфичности . ^[14]

Ограничения

Наряду со своими преимуществами, ПЦР с горячим стартом также имеет ограничения, которые необходимо учитывать перед внедрением метода. ПЦР с горячим стартом требует добавления тепла в течение более длительных периодов времени, в отличие от обычной ПЦР, поэтому ДНК-матрица более подвержена повреждению. Увеличенное время нагрева также означает, что эта процедура несовместима с некоторыми процедурами, такими как метод обратной транскрипции-ПЦР с одной пробиркой и одним буфером, который требует более низкой температуры для прохождения стадии обратной транскрипции. ^[12] При химически модифицированной ПЦР с горячим стартом процесс амплификации ДНК может быть отрицательно затронут, во-первых, из-за значительного увеличения времени реактивации, необходимого для активации полимеразы, и, во-вторых, если длина матрицы целевой ДНК слишком велика. ^[14] В процедурах, основанных на антителах, для каждого фермента требуется отдельное антитело, и поэтому стоимость выполнения процедуры выше. ^[15] Есть также свидетельства того, что многие коммерческие ферменты горячего старта действительно имеют некоторый уровень активности до денатурации, и лишь немногие поставщики предоставляют какую-либо информацию о тестировании этой остаточной активности. ^[25] Это означает, что преимущества, приписываемые ферментам горячего старта, могут быть не реализованы или, в лучшем случае, будут различаться в зависимости от партии или производителя.

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б ^с Шарки DJ, Скалис Э.Р., Кристи К.Г., Этвуд С.М., Дайс Дж.Л. (май 1994 г.). «Антитела как термолабильные переключатели: запуск полимеразной цепной реакции при высокой температуре». Био/Технологии . 12 (5): 506–9. дои : 10.1038/nbt0594-506 . PMID 7764710 . S2CID 2885453 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Пол Н., Шум Дж., Ле Т. (2010). «ПЦР с горячим стартом». Протоколы ОТ-ПЦР . Методы молекулярной биологии. Том. 630. Хумана Пресс. стр. 301–18. дои : 10.1007/978-1-60761-629-0_19 . ISBN 9781607616283 . ПМИД 20301005 .
^ Jump up to: ^а ^б Грин, Майкл Р.; Сэмбрук, Джозеф (май 2018 г.). «Полимеразная цепная реакция с горячим стартом (ПЦР)». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2018 (5): pdb.prot095125. дои : 10.1101/pdb.prot095125 . ISSN 1940-3402 . ПМИД 29717052 .
^ Арьял, Сагар (23 апреля 2015 г.). «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – принцип, процедура, типы, применение и анимация» . Микробиология Info.com . Проверено 29 мая 2020 г.
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Берч Д.Э. (май 1996 г.). «Упрощенная ПЦР с горячим стартом». Природа . 381 (6581): 445–6. Бибкод : 1996Natur.381..445B . дои : 10.1038/381445a0 . ПМИД 8632804 . S2CID 4267296 .
^ Jump up to: ^а ^б ван Пелт-Веркуил Э., ван Белкум А., Хейс Дж. П., ред. (2008). «Варианты и адаптации стандартного протокола ПЦР». Принципы и технические аспекты ПЦР-амплификации . Спрингер Нидерланды. стр. 231–276. дои : 10.1007/978-1-4020-6241-4_12 . ISBN 9781402062414 .
^ «Чем технология горячего старта полезна для вашей ПЦР» . Термофишер . Проверено 3 октября 2019 г.
^ «DNTP — Wiki школы биомедицинских наук» . учить.ncl.ac.uk . Проверено 9 октября 2019 г.
^ Коулман ВБ (2016). Диагностика молекулярной патологии . [Лондон]: Elsevier Academic Press. ISBN 9780128011577 . OCLC 960448665 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Лебедев Александр Владимирович; Павел, Наташа; Да, Джойклин; Тимощук Виктор А.; Шум, Джонатан; Мияги, Кей; Келлум, Джек; Хогрефе, Ричард И.; Зон, Джеральд (ноябрь 2008 г.). «ПЦР с горячим стартом с термоактивируемыми праймерами: новый подход к повышению эффективности ПЦР» . Исследования нуклеиновых кислот . 36 (20): е131. дои : 10.1093/нар/gkn575 . ISSN 1362-4962 . ПМЦ 2582603 . ПМИД 18796527 .
^ Кермекчиев Милко Б.; Цеков, Анатолий; Барнс, Уэйн М. (1 ноября 2003 г.). «Чувствительные к холоду мутанты ДНК-полимеразы Taq обеспечивают горячий старт для ПЦР» . Исследования нуклеиновых кислот . 31 (21): 6139–6147. дои : 10.1093/нар/gkg813 . ISSN 0305-1048 . ПМК 275455 . ПМИД 14576300 .
^ Jump up to: ^а ^б Шенбруннер, Нэнси Дж; Гупта, Амар П; Янг, Карен К.Ю.; Уилл, Стивен Дж. (01 января 2017 г.). «Ковалентная модификация праймеров повышает специфичность и выход ПЦР-амплификации» . Биологические методы и протоколы . 2 (1): bpx011. doi : 10.1093/biomethods/bpx011 . ISSN 2396-8923 . ПМК 6994073 . ПМИД 32161793 .
^ Вестфолл и др. (1997), Фокус 19.3, стр. 46.
^ Jump up to: ^а ^б ^с «Чем технология горячего старта полезна для вашей ПЦР - AU» . www.thermofisher.com . Проверено 29 мая 2020 г.
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д «Что такое ПЦР с горячим стартом?» . Генетическое образование . 03.03.2019 . Проверено 29 мая 2020 г.
^ Jump up to: ^а ^б Кухарева Инна; Лебедев, Александр (15 июня 2009 г.). «3'-Защищенные 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты как инструмент термической активации полимеразной цепной реакции» . Аналитическая химия . 81 (12): 4955–4962. дои : 10.1021/ac8026977 . ISSN 0003-2700 . ПМК 2712722 . ПМИД 19438248 .
^ Jump up to: ^а ^б Кухарева И.; Хаоцян, Х.; Да, Дж.; Шум, Дж.; Пол, Н.; Хогрефе, Род-Айленд; Лебедев, А.В. (01.09.2008). «Термоактивируемые 3'-модифицированные dNTP: синтез и применение для ПЦР с горячим стартом» . Серия симпозиумов по нуклеиновым кислотам . 52 (1): 259–260. дои : 10.1093/насс/nrn131 . ISSN 0261-3166 . ПМИД 18776352 .
^ Заявка США 20030162199 , Боннер, Алекс, «Обратимая химическая модификация нуклеиновых кислот и улучшенный метод гибридизации нуклеиновых кислот», опубликованная 28 августа 2003 г., передана BioLink Partners Inc. , но отменена.
^ Айленберг, М. и Сильверман, М., 1 ноября 2000 г., Контролируемый горячий старт и улучшенная специфичность при проведении ПЦР с использованием подправочных и петлевых праймеров (TULIPS), Biotechniques, 29 (5): 1018-1022, doi: 10.2144/00295st03,PMID: 11084864
^ Кабоев, ОК; Лучкина Л.А.; Третьяков А.Н.; Бахрманд, Арканзас (1 ноября 2000 г.). «ПЦР горячего старта с использованием праймеров со структурой молекулярных маяков (шпилькообразная структура)» . Исследования нуклеиновых кислот . 28 (21): е94. дои : 10.1093/нар/28.21.e94 . ISSN 0305-1048 . ПМЦ 113163 . ПМИД 11058144 .
^ Айленберг М., Капус А. и Ротштейн О.Д., 14 сентября 2021 г., Улучшенное обнаружение и генотипирование ПЦР SARS-CoV-2 с помощью двухпузырьковых праймеров, Biotechniques, 71 (6): 587-597, DOI: 10.2144/ бтн-2021-0063
^ Янг, Дуглас Д.; Эдвардс, Уэсли Ф.; Лусич, Хрвое; Лайвли, Марк О.; Дейтерс, Александр (10 января 2008 г.). «Светозависимая полимеразная цепная реакция» . Химические коммуникации (4): 462–464. дои : 10.1039/B715152G . ISSN 1364-548X . ПМК 3760149 . ПМИД 18188468 .
^ Маркулатос, П.; Сиафакас, Н.; Монкани, М. (2002). «Мультиплексная полимеразная цепная реакция: практический подход» . Журнал клинического лабораторного анализа . 16 (1): 47–51. дои : 10.1002/jcla.2058 . ISSN 0887-8013 . ПМК 6808141 . ПМИД 11835531 .
^ Барнс, Уэйн М; Роулик, Кэтрин Р. (июнь 2002 г.). «Метод горячего старта осадка магния для ПЦР». Молекулярные и клеточные зонды . 16 (3): 167–171. дои : 10.1006/mcpr.2002.0407 . ПМИД 12219733 .
^ Стивенс А.Дж. и др. (август 2016 г.). «Многие коммерческие полимеразы с горячим стартом демонстрируют активность до термической активации» . БиоТехники . 61 (6): 293–296. дои : 10.2144/000114481 . ПМИД 25967906 .

[:02-1] Jump up to: ^а ^б ^с Шарки DJ, Скалис Э.Р., Кристи К.Г., Этвуд С.М., Дайс Дж.Л. (май 1994 г.). «Антитела как термолабильные переключатели: запуск полимеразной цепной реакции при высокой температуре». Био/Технологии . 12 (5): 506–9. дои : 10.1038/nbt0594-506 . PMID 7764710 . S2CID 2885453 .

[:0-2] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Пол Н., Шум Дж., Ле Т. (2010). «ПЦР с горячим стартом». Протоколы ОТ-ПЦР . Методы молекулярной биологии. Том. 630. Хумана Пресс. стр. 301–18. дои : 10.1007/978-1-60761-629-0_19 . ISBN 9781607616283 . ПМИД 20301005 .

[:6-3] Jump up to: ^а ^б Грин, Майкл Р.; Сэмбрук, Джозеф (май 2018 г.). «Полимеразная цепная реакция с горячим стартом (ПЦР)». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2018 (5): pdb.prot095125. дои : 10.1101/pdb.prot095125 . ISSN 1940-3402 . ПМИД 29717052 .

[4] Арьял, Сагар (23 апреля 2015 г.). «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – принцип, процедура, типы, применение и анимация» . Микробиология Info.com . Проверено 29 мая 2020 г.

[:2-5] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Берч Д.Э. (май 1996 г.). «Упрощенная ПЦР с горячим стартом». Природа . 381 (6581): 445–6. Бибкод : 1996Natur.381..445B . дои : 10.1038/381445a0 . ПМИД 8632804 . S2CID 4267296 .

[:3-6] Jump up to: ^а ^б ван Пелт-Веркуил Э., ван Белкум А., Хейс Дж. П., ред. (2008). «Варианты и адаптации стандартного протокола ПЦР». Принципы и технические аспекты ПЦР-амплификации . Спрингер Нидерланды. стр. 231–276. дои : 10.1007/978-1-4020-6241-4_12 . ISBN 9781402062414 .

[:1-7] «Чем технология горячего старта полезна для вашей ПЦР» . Термофишер . Проверено 3 октября 2019 г.

[:4-8] «DNTP — Wiki школы биомедицинских наук» . учить.ncl.ac.uk . Проверено 9 октября 2019 г.

[:5-9] Коулман ВБ (2016). Диагностика молекулярной патологии . [Лондон]: Elsevier Academic Press. ISBN 9780128011577 . OCLC 960448665 .

[:7-10] Jump up to: ^а ^б ^с Лебедев Александр Владимирович; Павел, Наташа; Да, Джойклин; Тимощук Виктор А.; Шум, Джонатан; Мияги, Кей; Келлум, Джек; Хогрефе, Ричард И.; Зон, Джеральд (ноябрь 2008 г.). «ПЦР с горячим стартом с термоактивируемыми праймерами: новый подход к повышению эффективности ПЦР» . Исследования нуклеиновых кислот . 36 (20): е131. дои : 10.1093/нар/gkn575 . ISSN 1362-4962 . ПМЦ 2582603 . ПМИД 18796527 .

[11] Кермекчиев Милко Б.; Цеков, Анатолий; Барнс, Уэйн М. (1 ноября 2003 г.). «Чувствительные к холоду мутанты ДНК-полимеразы Taq обеспечивают горячий старт для ПЦР» . Исследования нуклеиновых кислот . 31 (21): 6139–6147. дои : 10.1093/нар/gkg813 . ISSN 0305-1048 . ПМК 275455 . ПМИД 14576300 .

[:8-12] Jump up to: ^а ^б Шенбруннер, Нэнси Дж; Гупта, Амар П; Янг, Карен К.Ю.; Уилл, Стивен Дж. (01 января 2017 г.). «Ковалентная модификация праймеров повышает специфичность и выход ПЦР-амплификации» . Биологические методы и протоколы . 2 (1): bpx011. doi : 10.1093/biomethods/bpx011 . ISSN 2396-8923 . ПМК 6994073 . ПМИД 32161793 .

[13] Вестфолл и др. (1997), Фокус 19.3, стр. 46.

[:9-14] Jump up to: ^а ^б ^с «Чем технология горячего старта полезна для вашей ПЦР - AU» . www.thermofisher.com . Проверено 29 мая 2020 г.

[:10-15] Jump up to: ^а ^б ^с ^д «Что такое ПЦР с горячим стартом?» . Генетическое образование . 03.03.2019 . Проверено 29 мая 2020 г.

[:11-16] Jump up to: ^а ^б Кухарева Инна; Лебедев, Александр (15 июня 2009 г.). «3'-Защищенные 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты как инструмент термической активации полимеразной цепной реакции» . Аналитическая химия . 81 (12): 4955–4962. дои : 10.1021/ac8026977 . ISSN 0003-2700 . ПМК 2712722 . ПМИД 19438248 .

[:12-17] Jump up to: ^а ^б Кухарева И.; Хаоцян, Х.; Да, Дж.; Шум, Дж.; Пол, Н.; Хогрефе, Род-Айленд; Лебедев, А.В. (01.09.2008). «Термоактивируемые 3'-модифицированные dNTP: синтез и применение для ПЦР с горячим стартом» . Серия симпозиумов по нуклеиновым кислотам . 52 (1): 259–260. дои : 10.1093/насс/nrn131 . ISSN 0261-3166 . ПМИД 18776352 .

[18] Заявка США 20030162199 , Боннер, Алекс, «Обратимая химическая модификация нуклеиновых кислот и улучшенный метод гибридизации нуклеиновых кислот», опубликованная 28 августа 2003 г., передана BioLink Partners Inc. , но отменена.

[19] Айленберг, М. и Сильверман, М., 1 ноября 2000 г., Контролируемый горячий старт и улучшенная специфичность при проведении ПЦР с использованием подправочных и петлевых праймеров (TULIPS), Biotechniques, 29 (5): 1018-1022, doi: 10.2144/00295st03,PMID: 11084864

[20] Кабоев, ОК; Лучкина Л.А.; Третьяков А.Н.; Бахрманд, Арканзас (1 ноября 2000 г.). «ПЦР горячего старта с использованием праймеров со структурой молекулярных маяков (шпилькообразная структура)» . Исследования нуклеиновых кислот . 28 (21): е94. дои : 10.1093/нар/28.21.e94 . ISSN 0305-1048 . ПМЦ 113163 . ПМИД 11058144 .

[21] Айленберг М., Капус А. и Ротштейн О.Д., 14 сентября 2021 г., Улучшенное обнаружение и генотипирование ПЦР SARS-CoV-2 с помощью двухпузырьковых праймеров, Biotechniques, 71 (6): 587-597, DOI: 10.2144/ бтн-2021-0063

[22] Янг, Дуглас Д.; Эдвардс, Уэсли Ф.; Лусич, Хрвое; Лайвли, Марк О.; Дейтерс, Александр (10 января 2008 г.). «Светозависимая полимеразная цепная реакция» . Химические коммуникации (4): 462–464. дои : 10.1039/B715152G . ISSN 1364-548X . ПМК 3760149 . ПМИД 18188468 .

[23] Маркулатос, П.; Сиафакас, Н.; Монкани, М. (2002). «Мультиплексная полимеразная цепная реакция: практический подход» . Журнал клинического лабораторного анализа . 16 (1): 47–51. дои : 10.1002/jcla.2058 . ISSN 0887-8013 . ПМК 6808141 . ПМИД 11835531 .

[24] Барнс, Уэйн М; Роулик, Кэтрин Р. (июнь 2002 г.). «Метод горячего старта осадка магния для ПЦР». Молекулярные и клеточные зонды . 16 (3): 167–171. дои : 10.1006/mcpr.2002.0407 . ПМИД 12219733 .

[:24-25] Стивенс А.Дж. и др. (август 2016 г.). «Многие коммерческие полимеразы с горячим стартом демонстрируют активность до термической активации» . БиоТехники . 61 (6): 293–296. дои : 10.2144/000114481 . ПМИД 25967906 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]

[19]

[20]

[21]

[22]

[23]

[24]

[25]

v т и полимеразной цепной реакции Методы
Процедура	Инициализация Цикл Денатурация Отжиг Удлинение Окончательное удлинение Окончательное удержание
Полимераза	Кленов Т4 и Т7 Так Тт Пфу Вентиляция Проф. Тли Уф
Оптимизация и варианты	Количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР) Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) Обратная полимеразная цепная реакция (обратная ПЦР) Вложенная полимеразная цепная реакция (вложенная ПЦР) Полимеразная цепная реакция приземления ПЦР с горячим стартом Полимеразная цепная реакция с перекрытием (OE-PCR) Мультиплексная полимеразная цепная реакция (мультиплексная ПЦР) Мультиплексная амплификация зонда, зависимая от лигирования (MLPA) Коамплификация при более низкой температуре денатурации ПЦР (ХОЛОДНАЯ ПЦР) Случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD)
История и люди	Кэри Маллис Кьелл Клеппе Алиса Дог