Полимеразная цепная реакция перекрывающегося расширения
Полимеразная цепная реакция с перекрытием (или ОЭ-ПЦР ) является вариантом ПЦР . Его также называют ПЦР сплайсингом путем перекрывания / сплайсингом с выступающим удлинением (SOE) . Он используется для сборки нескольких меньших фрагментов двухцепочечной ДНК в более крупную последовательность ДНК. ОЕ-ПЦР широко используется для вставки мутаций в определенные точки последовательности или для сборки индивидуальной последовательности ДНК из более мелких фрагментов ДНК в более крупный полинуклеотид . [1]
Сплайсинг молекул ДНК
[ редактировать ]
Как и в большинстве реакций ПЦР, для каждой последовательности используются два праймера — по одному на каждый конец. Для сращивания двух молекул ДНК на соединяемых концах используются специальные праймеры. Для каждой молекулы праймер на конце, подлежащем соединению, сконструирован таким образом, что он имеет 5'-выступающий конец, комплементарный концу другой молекулы. После отжига, когда происходит репликация, ДНК удлиняется за счет новой последовательности, комплементарной молекуле, к которой она должна быть присоединена. Как только обе молекулы ДНК удлиняются таким образом, их смешивают и проводят ПЦР только с праймерами для дальних концов. Введенные перекрывающиеся комплементарные последовательности будут служить праймерами, и две последовательности будут слиты. Этот метод имеет преимущество перед другими методами сплайсинга генов, поскольку не требует сайтов рестрикции.
Чтобы получить более высокие выходы, некоторые праймеры используются в избытке, как в асимметричной ПЦР .
Введение мутаций
[ редактировать ]
Для вставки мутации в последовательность ДНК специальный праймер создается . Праймер может содержать одну замену или содержать новую последовательность на своем 5'-конце. Если требуется делеция , добавляется последовательность, которая находится на 5'-конце делеции, поскольку 3'-конец праймера должен иметь комплементарность цепи матрицы, чтобы праймер мог в достаточной степени отжигаться с ДНК-матрицей.
После отжига праймера с матрицей репликация ДНК продолжается до конца матрицы. Дуплекс денатурируется, и второй праймер отжигается с вновь образованной цепью ДНК, содержащей последовательность первого праймера. Репликация продолжается до образования цепи необходимой последовательности, содержащей мутацию.
Дуплекс снова денатурируется, и теперь первый праймер может связываться с последней цепью ДНК. Реакция репликации продолжает производить полностью димеризованный фрагмент ДНК. После дальнейших циклов ПЦР для амплификации ДНК образец можно разделить с помощью электрофореза в агарозном геле с последующим электроэлюированием для сбора.
Эффективно генерировать олигонуклеотиды длиной более ~110 нуклеотидов очень сложно, поэтому для вставки мутации дальше в последовательность, чем позволяет праймер длиной 110 нуклеотидов, необходимо использовать ПЦР с удлинением с перекрытием. В ОЕ-ПЦР модифицируемая последовательность используется для создания двух модифицированных цепей с мутацией на противоположных концах с использованием метода, описанного выше. После смешивания и денатурации нити подвергаются отжигу для получения трех различных комбинаций, как показано на схеме. Только дуплекс без перекрытия на 5'-конце позволяет ДНК-полимеразе расширять его в направлении от 3' к 5'.
После продления реакции ОЕ-ПЦР смесь ПЦР или элюированные фрагменты соответствующего размера подвергают обычной ПЦР с использованием крайних праймеров, используемых в первоначальных мутагенных реакциях ПЦР.
Кроме того, комбинация ОЭ-ПЦР и асимметричной ПЦР может быть использована для повышения эффективности сайт-направленного мутагенеза . [2]
Применение в молекулярном клонировании
[ редактировать ]
Помимо введения мутаций, ПЦР с перекрытием широко используется для сборки сложных последовательностей ДНК без введения нежелательных нуклеотидов в любом положении. Это возможно, поскольку ОЕ-ПЦР основана на использовании дополнительных выступов для обеспечения безрубцового сплайсинга индивидуальных фрагментов ДНК в желаемом порядке. Это главное преимущество OE-PCR и других методов клонирования на основе длинной гомологии, таких как сборка Гибсона , которые преодолевают ограничения традиционных методов расщепления рестриктазами и лигирования . [3]
Сборка индивидуальных последовательностей ДНК с помощью OE-PCR состоит из трех основных этапов. Сначала отдельные последовательности ДНК амплифицируются с помощью ПЦР на разных матрицах и фланкируются необходимыми комплементарными выступами. Во-вторых, ранее полученные продукты ПЦР объединяются вместе в реакции ПЦР с перекрытием, в которой комплементарные выступающие части связываются попарно, позволяя полимеразе удлинять цепь ДНК. В конце концов, используются внешние праймеры, нацеленные на внешние выступы, и желаемый продукт ДНК амплифицируется в финальной реакции ПЦР.
Технические соображения
[ редактировать ]Общий успех сборок ДНК на основе OE-PCR зависит от нескольких факторов, наиболее важными из которых являются внутренние особенности собираемой последовательности ДНК, последовательность и длина перекрывающихся выступов, дизайн внешних праймеров для окончательной амплификации и условия реакции ПЦР. Обычно в одной реакции ОЭ-ПЦР можно одновременно сплайсировать от 2 до 6 фрагментов. [4] Выступы должны иметь длину не менее 40 нуклеотидов, чтобы обеспечить адекватное взаимодействие между фрагментами. Праймеры для окончательной амплификации обычно разрабатываются в соответствии с общими рекомендациями для ПЦР, однако они используются в концентрациях, в 2–5 раз меньших, чем в стандартных реакциях ПЦР, поскольку было показано, что это снижает нежелательные амплификации. [5] использовать корректирующие Кроме того, настоятельно рекомендуется ДНК-полимеразы.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Хигучи Р., Круммель Б., Сайки Р. (1988). «Общий метод получения in vitro и специфического мутагенеза фрагментов ДНК: исследование взаимодействий белка и ДНК» . Нуклеиновые кислоты Рез . 16 (15): 7351–67. дои : 10.1093/нар/16.15.7351 . ПМЦ 338413 . ПМИД 3045756 .
- ^ Сяо, Юэ-Хуа; Инь, Мэн-Хуэй; Хоу, Лей; Ло, Мин; Пей, Ян (1 июня 2007 г.). «Метод ПЦР с асимметричным перекрытием, минуя промежуточную очистку и амплификацию матрицы дикого типа при сайт-направленном мутагенезе» . Биотехнологические письма . 29 (6): 925–930. дои : 10.1007/s10529-007-9327-4 . ISSN 1573-6776 . ПМИД 17356793 . S2CID 1765921 .
- ^ Пыхтила, Брук. «Плазмиды 101: сборка Гибсона и другие методы клонирования на основе длинной гомологии» . blog.addgene.org . Проверено 7 апреля 2023 г.
- ^ Ло, Вэй-Гуй; Лю, Хуэй-Чжэнь; Линь, Ван-Хуан; Кабир, Мохаммед Хумаюн; Су, Йи (9 сентября 2013 г.). «Одновременный сплайсинг нескольких фрагментов ДНК в одной реакции ПЦР» . Биологические процедуры онлайн . 15 (1): 9. дои : 10.1186/1480-9222-15-9 . ISSN 1480-9222 . ПМЦ 3847634 . ПМИД 24015676 .
- ^ Хилгарт, Роланд С.; Ланиган, Томас М. (01 января 2020 г.). «Оптимизация ПЦР с удлинением перекрытия для эффективного конструирования трансгена» . МетодыX . 7 : 100759. doi : 10.1016/j.mex.2019.12.001 . ISSN 2215-0161 . ПМК 6992990 . ПМИД 32021819 .
