Лигирование (молекулярная биология)
Лигирование – это соединение двух фрагментов нуклеиновой кислоты под действием фермента. Это важная лабораторная процедура молекулярного клонирования ДНК, при которой фрагменты ДНК соединяются для создания рекомбинантных молекул ДНК (например, когда чужеродный фрагмент ДНК вставляется в плазмиду ). Концы фрагментов ДНК соединяются путем образования фосфодиэфирных связей между 3'-гидроксилом одного конца ДНК и 5'-фосфорилом другого. РНК также может быть лигирована аналогичным образом. В реакции обычно участвует кофактор, обычно это АТФ или НАД. + . Лигазы эукариотических клеток относятся к АТФ-типу, а НАД+-зависимые обнаружены у бактерий (например, E.coli ). [1]
Открытие ДНК-лигазы датируется 1967 годом и является важным событием в области молекулярной биологии . [1] Лигирование в лаборатории обычно выполняется с использованием Т4 ДНК-лигазы . Он широко используется in vitro в качестве инструмента исследования молекулярной биологии из-за его способности соединять как липкие, так и тупые концы ДНК. [2] Однако популярны также процедуры лигирования без использования стандартной ДНК-лигазы. Аномалии ДНК-лигаз человека связаны с патологическими расстройствами, характеризующимися иммунодефицитом, чувствительностью к радиации и проблемами развития. [3]
Реакция лигирования
[ редактировать ]Механизм реакции лигирования впервые был выяснен в лаборатории И. Роберта Лемана. [4] [5] Два фрагмента ДНК могут быть соединены ДНК-лигазой , которая катализирует образование фосфодиэфирной связи между 3'-гидроксильной группой (-OH) на одном конце цепи ДНК и 5'-фосфатной группой (-PO4) другого. . У животных и в бактериофагов АТФ качестве источника энергии для лигирования используется , тогда как у бактерий НАД + используется. [6]
ДНК-лигаза сначала реагирует с АТФ или НАД. + , образуя промежуточное соединение лигаза-АМФ, где АМФ связан с ε-аминогруппой лизина в активном центре лигазы посредством фосфорамидной связи. Эта аденилильная группа затем переносится на фосфатную группу на 5'-конце цепи ДНК, образуя комплекс ДНК-аденилат. Наконец, фосфодиэфирная связь между двумя концами ДНК образуется в результате нуклеофильной атаки 3'-гидроксила на конце цепи ДНК на активированную 5'-фосфорильную группу другой цепи. [4]
Разрыв в ДНК (т.е. разрыв одной цепи двухцепочечной ДНК) может быть очень эффективно восстановлен с помощью лигазы. Однако при лигировании двух отдельных концов ДНК возникает осложняющая особенность лигирования, поскольку для того, чтобы могла продолжиться реакция лигирования, два конца должны соединиться вместе. При лигировании ДНК с липкими или слипшимися концами выступающие нити ДНК уже могут быть отожжены вместе, поэтому это относительно эффективный процесс, поскольку он эквивалентен восстановлению двух разрывов в ДНК. Однако при лигировании тупых концов , у которых отсутствуют выступающие концы для отжига ДНК, этот процесс зависит от случайного столкновения, чтобы концы выровнялись вместе, прежде чем их можно будет связать, и, следовательно, это гораздо менее эффективный процесс. [7] ДНК-лигаза E. coli не может лигировать ДНК с тупыми концами, за исключением условий молекулярной скученности, и поэтому ее обычно не используют для лигирования в лаборатории. Вместо этого используется ДНК-лигаза фага Т4 , поскольку она может лигировать ДНК с тупыми концами, а также одноцепочечную ДНК. [8] [6]
Факторы, влияющие на перевязку
[ редактировать ]Факторы, которые влияют на химическую реакцию, опосредованную ферментом, естественным образом влияют на реакцию лигирования, например, концентрация фермента и реагентов, а также температура реакции и продолжительность инкубации. Лигирование осложняется тем фактом, что желаемые продукты лигирования для большинства реакций лигирования должны находиться между двумя разными молекулами ДНК, а реакция включает как меж-, так и внутримолекулярные реакции, и что для эффективного лигирования необходим дополнительный этап отжига.
Тремя этапами образования новой фосфодиэфирной связи во время лигирования являются: ферментативное аденилирование, перенос аденилила в ДНК и запечатывание разрывов. Mg(2+) является кофактором катализа, поэтому при высокой концентрации Mg(2+) эффективность лигирования высока. Если концентрация Mg(2+) ограничена, никелирование является лимитирующей реакцией процесса, и аденилированный интермедиат ДНК остается в растворе. Такое аденилирование фермента ограничивает повторное связывание с промежуточным соединением аденилированной ДНК ахиллесовой пяты LIG1 и представляет риск, если они не зафиксированы. [9]
концентрация ДНК
[ редактировать ]Концентрация ДНК может влиять на скорость лигирования, а также на то, является ли лигирование межмолекулярной или внутримолекулярной реакцией. Лигирование предполагает соединение концов ДНК с другими концами, однако каждый фрагмент ДНК имеет два конца, и если концы совместимы, молекула ДНК может образовывать кольцевую структуру, соединяя свои собственные концы. При высокой концентрации ДНК существует большая вероятность того, что один конец молекулы ДНК встретится с концом другой ДНК, тем самым образуя межмолекулярное лигирование. При более низкой концентрации ДНК вероятность того, что один конец молекулы ДНК встретится с другим концом той же молекулы, увеличивается, поэтому более вероятна внутримолекулярная реакция , вызывающая циркуляризацию ДНК. Эффективность трансформации линейной ДНК также намного ниже, чем кольцевой ДНК, и для того, чтобы ДНК превратилась в циркулярную, концентрация ДНК не должна быть слишком высокой. Как правило, общая концентрация ДНК должна быть менее 10 мкг/мл. [10]
Относительная концентрация фрагментов ДНК, их длина, а также условия буфера также являются факторами, которые могут влиять на то, будут ли предпочтительны межмолекулярные или внутримолекулярные реакции.
Концентрацию ДНК можно искусственно увеличить путем добавления конденсирующих агентов, таких как гексамин кобальта и биогенных полиаминов, таких как спермидин , или путем использования агентов, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), которые также увеличивают эффективную концентрацию ферментов. [11] [12] Однако обратите внимание, что такие добавки, как гексамин кобальта, могут вызывать исключительно межмолекулярную реакцию. [11] в результате чего образуются линейные конкатемеры, а не кольцевая ДНК, более подходящие для трансформации плазмидной ДНК и, следовательно, нежелательные для лигирования плазмид. Если необходимо использовать добавки при лигировании плазмид, использование ПЭГ является предпочтительным, поскольку он может способствовать как внутримолекулярному, так и межмолекулярному лигированию. [13]
Концентрация лигазы
[ редактировать ]Чем выше концентрация лигазы, тем быстрее скорость лигирования. Лигирование тупых концов гораздо менее эффективно, чем лигирование липких концов, поэтому при лигировании тупых концов используется более высокая концентрация лигазы. Высокая концентрация ДНК-лигазы может использоваться в сочетании с ПЭГ для более быстрого лигирования, и эти компоненты часто встречаются в коммерческих наборах, предназначенных для быстрого лигирования. [14] [15]
Температура
[ редактировать ]При рассмотрении температуры реакции лигирования возникают две проблемы. Во-первых, оптимальная температура активности ДНК-лигазы составляет 37°С. ° C, и, во-вторых, температура плавления (T m ) концов ДНК, подлежащих лигированию. Температура плавления зависит от длины и основного состава выступа ДНК — чем больше количество G и C, тем выше T m, поскольку между парой оснований GC образуются три водородные связи по сравнению с двумя для пары оснований AT — с некоторым вклад от укладки оснований между фрагментами. Чтобы реакция лигирования протекала эффективно, концы должны быть стабильно отожжены, а в экспериментах по лигированию Т m концов ДНК обычно намного ниже 37 ° C. Таким образом, оптимальная температура для лигирования слипшихся концов представляет собой компромисс между лучшей температурой для активности ДНК-лигазы и температурой T m, при которой концы могут связываться. [16] Однако разные рестриктазы образуют разные концы, и базовый состав концов, продуцируемых этими ферментами, также может различаться, температура плавления и, следовательно, оптимальная температура могут широко варьироваться в зависимости от используемых рестриктаз, а оптимальная температура для лигирования может составлять между 4-15 ° С в зависимости от концов. [17] [18] Лигирование также часто предполагает лигирование концов, образующихся из разных рестриктаз в одной и той же реакционной смеси, поэтому выбор оптимальной температуры для конкретной реакции лигирования может быть непрактичным, и в большинстве протоколов просто выбирают 12-16 ° C, комнатная температура или 4 ° С.
Буферный состав
[ редактировать ]Ионная сила используемого буфера может повлиять на лигирование. На реакцию лигирования также может влиять тип присутствия катионов, например, избыточное количество Na. + может привести к тому, что ДНК станет более жесткой и увеличит вероятность межмолекулярного лигирования. При высокой концентрации одновалентного катиона (>200 мМ) лигирование также может практически полностью ингибироваться. [19] Стандартный буфер, используемый для лигирования, предназначен для минимизации ионных эффектов. [20]
Лигирование липкого конца
[ редактировать ]Рестрикционные ферменты могут создавать самые разнообразные концы в ДНК, которую они расщепляют, но в экспериментах по клонированию наиболее часто используемые рестрикционные ферменты образуют одноцепочечный выступ из 4 оснований, называемый липким или когезивным концом (исключения включают Nde I , который генерирует 2-цепочечный конец). выступ основания и те, которые создают тупые концы). Эти липкие концы могут отжигаться с другими совместимыми концами и перевязываться в липкий (или когезивный) конец. Eco RI, например, создает конец AATT, и поскольку A и T имеют более низкую температуру плавления, чем C и G, их температура плавления T m низкая и составляет около 6°С. ° С. [21] Для большинства ферментов рестрикции образующиеся выступы имеют T m около 15. ° С. [20] В практических целях перевязку липких концов проводят на 12-16 ° C, или при комнатной температуре, или альтернативно при 4 ° С на более длительный период.
Для вставки фрагмента ДНК в плазмидный вектор предпочтительно использовать два разных фермента рестрикции для расщепления ДНК с образованием разных концов. Два разных конца могут предотвратить повторное лигирование вектора без какой-либо вставки, а также позволяют вставить фрагмент направленным образом.
Когда невозможно использовать два разных сайта, векторную ДНК может потребоваться дефосфорилировать, чтобы избежать высокого фона рециркуляризованной векторной ДНК без вставки. Без фосфатной группы на концах вектор не может лигироваться сам с собой, но может быть лигирован со вставкой с фосфатной группой. Дефосфорилирование обычно осуществляется с использованием щелочной фосфатазы из кишечника теленка (CIAP), которая удаляет фосфатную группу с 5'-конца переваренной ДНК, но обратите внимание, что CIAP нелегко инактивировать и он может мешать лигированию без дополнительного этапа удаления CIAP. что приводит к неудаче лигирования. CIAP не следует использовать в чрезмерных количествах, его следует использовать только при необходимости. креветок Щелочная фосфатаза (SAP) или антарктическая фосфатаза (AP) являются подходящей альтернативой, поскольку их можно легко инактивировать.
Лигирование тупого конца
[ редактировать ]Лигирование тупых концов не предполагает спаривание оснований выступающих концов, поэтому любой тупой конец можно лигировать с другим тупым концом. Тупые концы могут образовываться ферментами рестрикции, такими как Sma I и Eco RV . Основным преимуществом клонирования с тупыми концами является то, что желаемая вставка не требует каких-либо сайтов рестрикции в своей последовательности, поскольку тупые концы обычно генерируются в ПЦР , а полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК с тупыми концами может затем быть лигирован в тупой конец. конечный вектор, сгенерированный из рестрикционного дайджеста.
Однако лигирование тупых концов гораздо менее эффективно, чем лигирование липких концов, обычно реакция в 100 раз медленнее, чем лигирование липких концов. Поскольку тупой конец не имеет выступающих концов, реакция лигирования зависит от случайных столкновений между тупыми концами и, следовательно, гораздо менее эффективна. Чтобы компенсировать более низкую эффективность, концентрация используемой лигазы выше, чем при лигировании липких концов (в 10 раз или более). Концентрация ДНК, используемая при лигировании тупых концов, также выше, чтобы увеличить вероятность столкновений между концами, а для лигирования тупых концов также можно использовать более длительное время инкубации.
Если оба конца, которые необходимо лигировать в вектор, имеют тупые концы, то вектор необходимо дефосфорилировать, чтобы минимизировать самолигирование. Это можно сделать с помощью CIAP, но, как отмечалось ранее, при его использовании необходима осторожность. Поскольку вектор дефосфорилирован и для лигирования требуется присутствие 5'-фосфата, вставку необходимо фосфорилировать. В продукте ПЦР с тупыми концами обычно отсутствует 5'-фосфат, поэтому его необходимо фосфорилировать путем обработки полинуклеотидкиназой Т4 . [22]
Лигирование тупых концов также обратимо ингибируется высокой концентрацией АТФ. [23]
ПЦР обычно генерирует продукты ПЦР с тупыми концами, но учтите, что ПЦР с использованием Taq- полимеразы может добавить дополнительный аденин (А) к 3'-концу продукта ПЦР. Это свойство можно использовать при клонировании ТА , когда концы продукта ПЦР могут отжигаться с Т-концом вектора. Таким образом, лигирование ТА представляет собой форму лигирования липких концов. Векторы с тупыми концами можно превратить в вектор для лигирования ТА с дидезокситимидинтрифосфатом (ddTTP) с использованием терминальной трансферазы.
Общие рекомендации
[ редактировать ]Для клонирования вставки в кольцевую плазмиду:
- Общая используемая концентрация ДНК должна быть менее 10 мкг/мл, поскольку плазмиде требуется рециркуляция.
- Молярное соотношение вставки к вектору обычно используется примерно 3:1. Очень высокое соотношение может привести к появлению нескольких вставок. Соотношение можно регулировать в зависимости от размера вставки, также можно использовать другие соотношения, например 1:1.
Поиск неисправностей
[ редактировать ]Иногда в результате лигирования не удается получить желаемые лигированные продукты, и некоторые из возможных причин могут быть следующими:
- Поврежденная ДНК. Чрезмерное воздействие УФ-излучения во время подготовки ДНК к лигированию может повредить ДНК и значительно снизить эффективность трансформации . УФ-излучение с более высокой длиной волны (365 нм), вызывающее меньшее повреждение ДНК, следует использовать, если необходимо работать с ДНК на УФ-трансиллюминаторе в течение длительного периода времени. Однако добавление цитидина или гуанозина к буферу для электрофореза в концентрации 1 мМ может защитить ДНК от повреждения. [24]
- Неправильное использование CIAP или его неэффективная инактивация или удаление.
- Использовано слишком много ДНК.
- Неполный перевар ДНК . Неполностью переваренная векторная ДНК приведет к высокому фону, и это можно проверить, выполнив лигирование без вставки в качестве контроля. Вставка, которая не полностью переварена, также не будет правильно лигироваться и циркулировать. При расщеплении продукта ПЦР убедитесь, что к 5'-концам олигонуклеотидов, используемых для ПЦР, добавлено достаточное количество дополнительных оснований, поскольку многим ферментам рестрикции для эффективного расщепления требуется минимальное количество дополнительных пар оснований. Информацию о минимальной необходимой паре оснований можно получить у поставщиков ферментов рестрикции, например, в каталоге New England Biolabs . [25]
- Неполное лигирование. ДНК с тупыми концами (например, Sma I ) и некоторые ДНК с липкими концами (например, Nde I ), имеющие низкую температуру плавления, требуют большего количества лигазы и более длительного времени инкубации. [26]
- Белок, экспрессируемый из лигированной генной вставки, токсичен для клеток.
- Гомологичная последовательность вставки с последовательностью в плазмидной ДНК, приводящая к делеции.
- Высокая концентрация ЭДТА или солей, действующих как ингибиторы. [27]
Другие методы лигирования ДНК
[ редактировать ]В ряде коммерчески доступных наборов для клонирования ДНК используются другие методы лигирования, не требующие использования обычных ДНК-лигаз. Эти методы позволяют выполнять клонирование гораздо быстрее, а также упрощают перенос клонированной вставки ДНК в разные векторы . Однако эти методы требуют использования специально разработанных векторов и компонентов и могут не обладать гибкостью.
Лигирование, опосредованное топоизомеразой
[ редактировать ]Для лигирования вместо лигазы можно использовать топоизомеразу , и клонирование можно проводить быстрее без необходимости рестрикционного расщепления вектора или вставки. В этом методе клонирования TOPO линеаризованный вектор активируется путем присоединения топоизомеразы I к его концам, и этот «TOPO-активированный» вектор может затем принять продукт ПЦР путем лигирования с обоими 5'-концами продукта ПЦР, топоизомераза высвобождается. и при этом формируется круговой вектор. [28]
Гомологичная рекомбинация
[ редактировать ]Другим методом клонирования без использования лигазы является рекомбинация ДНК , например, как это используется в системе клонирования Gateway . [29] [30] Ген, однажды клонированный в клонирующий вектор (в этом методе называемый входным клоном), может быть удобно введен в различные векторы экспрессии путем рекомбинации. [31]
Примеры и применение ДНК-лигаз
[ редактировать ]В изученных организмах обнаружены разные типы лигаз. Например, никотинамидадениндинуклеотид (НАД+)-зависимая лигаза была обнаружена и выделена из бактериального организма, известного как E. coli , во второй трети 20 века. С тех пор эта модель широко использовалась для изучения семейства ДНК-лигаз. Более того, он содержится во всех бактериях. Примерами генов, присутствующих в E. coli , являются LigA, который выполняет важные функции, влияющие на рост бактерий, и LigB. [32]
У млекопитающих, в том числе у человека, выявлено 3 гена: Lig1, Lig3, Lig4. Все эукариоты содержат несколько типов ДНК-лигаз, кодируемых генами Lig. [33] Самая маленькая из известных эукариотических лигаз — ДНК-лигаза вируса хлореллы (ChVLig). Он содержит всего 298 аминокислот. Когда ChVLig является единственным источником лигазы в клетке, он может продолжать поддерживать митотическое развитие и негомологическое соединение концов у почкующихся дрожжей. [34] Нарушения регуляции семейства убиквитинлигаз E3 изучаются и, как и некоторые другие лигазы, они связаны с раком, аутоиммунными заболеваниями и другими расстройствами. [35] [36] Убиквитинлигазы E3, такие как Hdm2, могут быть дополнительно изучены, охарактеризованы и использованы в качестве практических биомаркеров рака, поскольку они сверхэкспрессируются при ряде типов рака у людей, которые имеют отрицательный прогноз с точки зрения выживаемости пациентов. [37] [38] ДНК-лигаза I (Lig1) отвечает за лигирование фрагментов Оказаки. Он состоит из 919 аминокислот. В сложном процессе репликации ДНК ДНК-лигаза I привлекается к механизму репликации посредством белковых взаимодействий. Lig1 играет роль в делении клеток растений и дрожжей. Нокаут гена Lig1 летален для дрожжей и проростков некоторых растений. Тем не менее исследования эмбриогенеза мышей показали, что до середины процесса роста эмбрион развивается без ДНК-лигазы I. [39]
Ферментативное лигирование использовалось в различных исследованиях, связанных с наноструктурами ДНК, и приводило к повышению эффективности и стабильности. Одним из методов является запечатывание ковалентных связей ДНК, а именно фосфодиэфирных связей и разрывов. Реконструкцию этих структур осуществляют с помощью лигирования. Например, ДНК-лигаза Т4 служит катализатором запечатывания разрыва между 3-м и 5-м прайм-концами ДНК для образования прочной фосфодиэфирной связи. Лигированные структуры имеют более высокие значения термостабильности. [40] ДНК-лигаза Т4 обладает многими ценными свойствами, такими как уже упомянутые каталитические, но она также отвечает за закрытие промежутков между цепями ДНК, активность по закрытию разрывов, восстановление повреждений ДНК и т. д. [2]
В архитектуре наноструктур, исследованиях в области молекулярной биологии оцДНК является важной прикладной моделью. ДНК-лигаза Т4 используется для циклизации коротких фрагментов оцДНК, но процесс осложняется образованием вторичных структур. С другой стороны, ДНК-лигаза Taq представляет собой термостабильный фермент, который можно применять при более высоких температурах (45, 55 и 65 °C соответственно). Поскольку в этом диапазоне температур вторичные структуры менее стабильны, это повышает эффективность циклизации олигонуклеотидов. На кинетические, биологические и другие параметры наноструктур влияет наличие вторичных структур в кольцах ДНК. Однако лигирование Taq ДНК происходит только тогда, когда две комплементарные цепи ДНК идеально спарены и не имеют промежутков между ними. [41]
Анализ активности, мутаций и недостатков лигаз, широко используемых в разработке лекарств и биологических исследованиях для изучения заболеваний, развития патологий и связанных с ними редких приобретенных или наследственных синдромов (например, синдрома ДНК-лигазы IV). [42] [43] [44] [45]
Процедура лигирования широко распространена в методах клонирования в молекулярной биологии и применяется для определения и характеристики конкретных нуклеотидных последовательностей в геноме с использованием амплификации лигированных зондов на основе лигазной цепной реакции (LCR) или полимеразной цепной реакции (ПЦР). [46]
Анализ
[ редактировать ]Лигирование также может служить методом анализа ДНК . [47] Некоторые методы используют усиление по принципу катящегося круга . [47] Наиболее примечательный из них описан Смолиной и др. , 2007 & Смолина и др. , 2008 с использованием флуоресцентной гибридизации in situ и пептидно-нуклеиновых кислот . [47] Они разработали и применили этот метод для анализа бактериальных хромосом. [47]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б Шуман С (июнь 2009 г.). «ДНК-лигазы: прогресс и перспективы» . Журнал биологической химии . 284 (26): 17365–17369. дои : 10.1074/jbc.R900017200 . ПМК 2719376 . ПМИД 19329793 .
- ^ Перейти обратно: а б Су Т, Лю Ф, Чанг Ю, Го Ц, Ван Дж, Ван Ц, Ци Ц (июнь 2019 г.). «ДНК-лигаза фага Т4 опосредует восстановление DSB бактериальных хромосом в виде однокомпонентного негомологичного соединения концов» . Синтетическая и системная биотехнология . 4 (2): 107–112. дои : 10.1016/j.synbio.2019.04.001 . ПМК 6525309 . ПМИД 31193309 .
- ^ Томкинсон А.Э., Наила Т., Кхаттри Бхандари С. (февраль 2020 г.). «Измененная активность ДНК-лигазы при заболеваниях человека» . Мутагенез . 35 (1): 51–60. дои : 10.1093/mutage/gez026 . ПМК 7317150 . ПМИД 31630206 .
- ^ Перейти обратно: а б Кресге Н., Симони Р.Д., Хилл Р.Л. (январь 2007 г.). «Взгляд на соединение ДНК: I. Работа Роберта Лемана над ДНК-лигазой» . Журнал биологической химии . 282 (2): е1–е3. дои : 10.1016/S0021-9258(20)73504-0 .
- ^ Модорич П., Lehman IR (ноябрь 1973 г.). «Лигаза дезоксирибонуклеиновой кислоты. Стационарный кинетический анализ реакции, катализируемой ферментом Escherichia coli» (PDF) . Журнал биологической химии . 248 (21): 7502–7511. ПМИД 4355585 .
- ^ Перейти обратно: а б Страйер Л. (2007). Биохимия (3-е изд.). Фриман. стр. 658–659 . ISBN 9780716787242 .
- ^ Сондерс, В.А. (6 декабря 2012 г.). Микробная генетика в применении к биотехнологии :: Принципы и методы переноса генов и манипуляций . Спрингер. ISBN 9781461597964 .
- ^ Старый RW, Primrose SB (27 сентября 1994 г.). Принцип манипуляции генами - Введение в генную инженерию (5-е изд.). Блэквелл Сайентифик. п. 37 . ISBN 9780632037124 .
- ^ Тейлор М.Р., Конрад Дж.А., Уол Д., О'Брайен П.Дж. (июль 2011 г.). «Кинетический механизм ДНК-лигазы I человека обнаруживает магний-зависимые изменения на этапе ограничения скорости, которые ставят под угрозу эффективность лигирования» . Журнал биологической химии . 286 (26): 23054–23062. дои : 10.1074/jbc.m111.248831 . ПМК 3123073 . ПМИД 21561855 .
- ^ Сэмбрук Дж., Рассел Д. «Глава 1: Плазмиды и их полезность в молекулярном клонировании». Молекулярное клонирование. Лабораторное пособие . Том. 1 (3-е изд.). стр. 1.20–1.21. ISBN 978-0-87969-577-4 .
- ^ Перейти обратно: а б Руше-младший, Ховард-Фландерс П. (март 1985 г.). «Гексамин-кобальт хлорид способствует межмолекулярному лигированию фрагментов ДНК с тупыми концами с помощью ДНК-лигазы Т4» . Исследования нуклеиновых кислот . 13 (6): 1997–2008. дои : 10.1093/нар/13.6.1997 . ПМК 341130 . ПМИД 4000951 .
- ^ Циммерман С.Б., Файффер Б.Х. (октябрь 1983 г.). «Макромолекулярная скученность позволяет осуществлять лигирование тупых концов ДНК-лигазами из печени крысы или Escherichia coli» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 80 (19): 5852–5856. Бибкод : 1983PNAS...80.5852Z . дои : 10.1073/pnas.80.19.5852 . ПМК 390173 . ПМИД 6351067 .
- ^ Хаяси К., Наказава М., Ишизаки Ю., Хираока Н., Обаяши А. (октябрь 1986 г.). «Регуляция меж- и внутримолекулярного лигирования ДНК-лигазой Т4 в присутствии полиэтиленгликоля» . Исследования нуклеиновых кислот . 14 (19): 7617–7631. дои : 10.1093/нар/14.19.7617 . ПМК 311784 . ПМИД 3022231 .
- ^ "ЧАСТО ЗАДАВАЕМЫЕ ВОПРОСЫ" . НЭБ .
- ^ «Набор для быстрого перевязки» . НЭБ .
- ^ Старый RW, Primrose SB (27 сентября 1994 г.). Принцип манипуляции генами - Введение в генную инженерию (5-е изд.). Блэквелл Сайентифик. п. 36 . ISBN 9780632037124 .
- ^ Ферретти Л., Сгарамелла В. (январь 1981 г.). «Температурная зависимость соединения ДНК-лигазой Т4 концов, продуцируемых эндонуклеазами рестрикции II типа» . Исследования нуклеиновых кислот . 9 (1): 85–93. дои : 10.1093/нар/9.1.85 . ПМК 326670 . ПМИД 6259621 .
- ^ Дугайчик А., Бойер Х.В., Гудман Х.М. (июль 1975 г.). «Лигирование фрагментов ДНК, генерируемых эндонуклеазой EcoRI, в линейные и кольцевые структуры». Журнал молекулярной биологии . 96 (1): 171–184. дои : 10.1016/0022-2836(75)90189-8 . ПМИД 169355 .
- ^ Рааэ А.Дж., Клеппе Р.К., Клеппе К. (декабрь 1975 г.). «Кинетика и влияние солей и полиаминов на полинуклеотидлигазу Т4» . Европейский журнал биохимии . 60 (2): 437–443. дои : 10.1111/j.1432-1033.1975.tb21021.x . ПМИД 173544 .
- ^ Перейти обратно: а б Люкотт Дж., Бэнейкс Ф. (1993). Введение в методы молекулярного клонирования . Уайли-Блэквелл. п. 156. ИСБН 978-0471188490 .
- ^ Мерц Дж. Э., Дэвис Р. В. (ноябрь 1972 г.). «Расщепление ДНК эндонуклеазой рестрикции R 1 приводит к образованию слипшихся концов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 69 (11): 3370–3374. Бибкод : 1972PNAS...69.3370M . дои : 10.1073/pnas.69.11.3370 . ПМЦ 389773 . ПМИД 4343968 .
- ^ «Руководство по клонированию» . Биолаборатории Новой Англии, Inc.
- ^ Ферретти Л., Сгарамелла В. (август 1981 г.). «Специфическое и обратимое ингибирование активности соединения тупых концов ДНК-лигазы Т4» . Исследования нуклеиновых кислот . 9 (15): 3695–3705. дои : 10.1093/нар/9.15.3695 . ПМК 327385 . ПМИД 6269089 .
- ^ Грюндеманн Д., Шёмиг Э. (ноябрь 1996 г.). «Защита ДНК во время препаративного электрофореза в агарозном геле от повреждений, вызванных ультрафиолетовым светом» (PDF) . БиоТехники . 21 (5): 898–903. дои : 10.2144/96215rr02 . ПМИД 8922632 .
- ^ «Расщепление фрагментов ДНК близко к концу» . Биолаборатории Новой Англии, Inc.
- ^ Чанг Э.Л., Ге Б., Ли М.А., Со М.А., Ван ВЕ (2005). «Исследование эффективности лигирования фрагментов, переваренных NdeI» (PDF) . Журнал экспериментальной микробиологии и иммунологии . 7 :68–72 . Проверено 29 октября 2012 г. (Обратите внимание, что в этой статье есть ошибка, описывающая Nde I как четырехосновную фрезу.)
- ^ «Оптимизируйте лигирование ДНК с помощью 7 обязательных советов — США» . www.thermofisher.com . Проверено 10 января 2023 г.
- ^ «Технология клонирования TOPO®» . Инвитроген .
- ^ Эспозито Д., Гарви Л.А., Чакиат К.С. (2009). «Клонирование шлюзов для экспрессии белков» . Высокопроизводительная экспрессия и очистка белков . Методы молекулярной биологии. Том. 498. стр. 31–54 . дои : 10.1007/978-1-59745-196-3_3 . ISBN 978-1-58829-879-9 . ПМИД 18988017 .
- ^ «Методы клонирования. Системы рекомбинационного клонирования» . ЭМБЛ .
- ^ «Технология рекомбинационного клонирования Gateway®» . Инвитроген .
- ^ Шрисканда В., Шуман С. (декабрь 2001 г.). «Вторая НАД(+)-зависимая ДНК-лигаза (LigB) в Escherichia coli» . Исследования нуклеиновых кислот . 29 (24): 4930–4934. дои : 10.1093/нар/29.24.4930 . ПМК 97608 . ПМИД 11812821 .
- ^ Сунь Л, Лю X, Сун С, Фэн Л, Ши С, Сунь Z и др. (12.11.2021). «Идентификация LIG1 и LIG3 как прогностических биомаркеров при раке молочной железы» . Открытая медицина . 16 (1): 1705–1717. дои : 10.1515/med-2021-0388 . ПМК 8590111 . ПМИД 34825062 .
- ^ Самай П., Шуман С. (апрель 2011 г.). «Функциональное рассечение интерфейса ДНК нуклеотидилтрансферазного домена ДНК-лигазы вируса хлореллы» . Журнал биологической химии . 286 (15): 13314–13326. дои : 10.1074/jbc.M111.226191 . ПМК 3075678 . ПМИД 21335605 .
- ^ Буетов Л., Хуан Д.Т. (октябрь 2016 г.). «Структурные данные о катализе и регуляции убиквитинлигазы E3» . Обзоры природы. Молекулярно-клеточная биология . 17 (10): 626–642. дои : 10.1038/номер.2016.91 . ПМК 6211636 . ПМИД 27485899 .
- ^ Кобашигава Ю., Томитака А., Кумета Х., Нода Н.Н., Ямагути М., Инагаки Ф. (декабрь 2011 г.). «Механизмы активации аутоингибирования и фосфорилирования рака человека и белка E3 Cbl-b, связанного с аутоиммунными заболеваниями» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 108 (51): 20579–20584. Бибкод : 2011PNAS..10820579K . дои : 10.1073/pnas.1110712108 . ПМЦ 3251137 . ПМИД 22158902 .
- ^ Сунь Ю (август 2006 г.). «Убиквитинлигазы Е3 как мишени рака и биомаркеры» . Неоплазия . 8 (8): 645–654. дои : 10.1593/neo.06376 . ПМК 1601942 . ПМИД 16925947 .
- ^ Бай Дж., Ву К., Цао М.Х., Ян Ю., Пан Ю., Лю Х. и др. (июнь 2019 г.). «СКФ FBXO22 нацелен на деградацию HDM2 и модулирует инвазию и метастазирование клеток рака молочной железы» . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 116 (24): 11754–11763. Bibcode : 2019PNAS..11611754B . doi : 10.1073/pnas. 1820990116 . ПМЦ 6575577 .
- ^ Уотерворт В.М., Козак Дж., Провост К.М., Брей К.М., Анджелис К.Дж., West CE (июнь 2009 г.). «Растения с дефицитом ДНК-лигазы 1 демонстрируют серьезные дефекты роста и задержку восстановления как одно-, так и двухцепочечных разрывов ДНК» . Биология растений BMC . 9 (1): 79. дои : 10.1186/1471-2229-9-79 . ПМК 2708163 . ПМИД 19558640 .
- ^ Бай Т., Чжан Дж., Хуан К., Ван В., Чен Б., Ли Ю. и др. (август 2022 г.). «Реконфигурация наноструктур ДНК, вызванная обработкой ферментативным лигированием» . Исследования нуклеиновых кислот . 50 (14): 8392–8398. дои : 10.1093/nar/gkac606 . ПМЦ 9371897 . ПМИД 35880584 .
- ^ Лей С., Ли С.Ю., Лю Дж.К., Чжэн X, Чжао Г.П., Ван Дж. (май 2017 г.). «Метод CCTL (разрезание с помощью Cpf1 и лигирование с помощью Taq ДНК-лигазы) для эффективного редактирования больших конструкций ДНК in vitro» . Исследования нуклеиновых кислот . 45 (9): е74. дои : 10.1093/нар/gkx018 . ПМК 5436000 . ПМИД 28115632 .
- ^ Хуан М., Дун Г., Лу С., Сяо Ф., Чжоу Ц., Чжан С. (октябрь 2022 г.). «Дефицит ДНК-лигазы IV с повышенным уровнем IgG в сыворотке крови, предположительно миелодиспластический синдром: отчет о случае» . БМК Педиатрия . 22 (1): 588. doi : 10.1186/s12887-022-03655-x . ПМЦ 9552496 . ПМИД 36221079 .
- ^ Альтманн Т., Дженнери А.Р. (октябрь 2016 г.). «Синдром ДНК-лигазы IV; обзор» . Сиротский журнал редких заболеваний . 11 (1): 137. дои : 10.1186/s13023-016-0520-1 . ПМК 5055698 . ПМИД 27717373 .
- ^ Чен X, Чжун С, Чжу X, Дзигелевска Б, Элленбергер Т, Уилсон ГМ и др. (май 2008 г.). «Рациональный дизайн ингибиторов ДНК-лигазы человека, нацеленных на репликацию и восстановление клеточной ДНК» . Исследования рака . 68 (9): 3169–3177. дои : 10.1158/0008-5472.can-07-6636 . ПМЦ 2734474 . ПМИД 18451142 .
- ^ Эндерс А., Фиш П., Шварц К., Даффнер У., Паннике У., Николопулос Э. и др. (апрель 2006 г.). «Тяжелая форма комбинированного иммунодефицита человека вследствие мутаций ДНК-лигазы IV». Журнал иммунологии . 176 (8): 5060–5068. дои : 10.4049/jimmunol.176.8.5060 . hdl : 1885/25570 . ПМИД 16585603 . S2CID 1342869 .
- ^ Ломан Г.Дж., Чжан Ю., Желковский А.М., Кантор Э.Дж., Эванс Т.К. (февраль 2014 г.). «Эффективное лигирование ДНК в гибридных спиралях ДНК-РНК с помощью ДНК-лигазы вируса хлореллы» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (3): 1831–1844. дои : 10.1093/нар/gkt1032 . ПМЦ 3919565 . ПМИД 24203707 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Конзе Т., Шетье А., Танака Ю., Гу Дж., Ларссон С., Йоранссон Дж. и др. (19 июля 2009 г.). «Анализ генов, транскриптов и белков посредством лигирования ДНК». Ежегодный обзор аналитической химии . 2 (1). Годовые обзоры : 215–239. Бибкод : 2009ARAC....2..215C . doi : 10.1146/annurev-anchem-060908-155239 . ПМИД 20636060 .