✖


Jump to content

Эффективность трансформации

    Add links

    Эффективность трансформации относится к способности клетки поглощать и включать экзогенную ДНК, например плазмиды , во время процесса, называемого трансформацией . Эффективность трансформации обычно измеряется как количество трансформантов (клеток, поглотивших экзогенную ДНК ) на микрограмм ДНК, добавленной к клеткам. Более высокая эффективность трансформации означает, что больше клеток способны поглощать ДНК, а более низкая эффективность означает, что меньше клеток способны это сделать.

    В молекулярной биологии эффективность трансформации является важнейшим параметром, она используется для оценки способности различных методов внедрять плазмидную ДНК в клетки и для сравнения эффективности различных плазмид , векторов и клеток-хозяев. На эту эффективность может влиять ряд факторов, включая метод, используемый для введения ДНК, тип используемых клеток и плазмиды, а также условия, в которых проводится трансформация. Таким образом, измерение и оптимизация эффективности трансформации является важным шагом во многих приложениях молекулярной биологии, включая генную инженерию , генную терапию и биотехнологию .

    Измерение

    [ редактировать ]

    Измеряя эффективность трансформации, мы можем использовать информацию нашего эксперимента, чтобы оценить, насколько эффективно прошла наша трансформация. Это количественная оценка того, сколько клеток было изменено 1 мкг плазмидной ДНК. По сути, это признак того, что эксперимент по трансформации удался. [1] Его следует определять в условиях избытка клеток. [2]

    Эффективность трансформации обычно измеряют как количество трансформированных клеток на общее количество клеток. Его можно представить в процентах или в виде колониеобразующих единиц (КОЕ) на микрограмм ДНК.

    Одним из наиболее распространенных способов измерения эффективности трансформации является проведение анализа колониеобразования . Вот пример того, как рассчитать эффективность трансформации с использованием колониеобразующих единиц (КОЕ): [3]

    1. Высейте известное количество клеток на чашки с агаром, содержащим соответствующие антибиотики.
    2. Инкубируйте планшеты в течение определенного периода времени (обычно в течение ночи) при соответствующей температуре и условиях для клеток.
    3. Подсчитайте количество колоний, растущих на чашках. Это представляет собой количество клеток, которые приняли и экспрессировали плазмидную ДНК.
    4. Чтобы рассчитать эффективность трансформации, разделите количество колоний на количество посеянных клеток и умножьте на 100. Результатом будет эффективность трансформации в процентах.

    Например, если вы поставите тарелку 1x 10 7 клеток и подсчитать 1000 колоний, эффективность трансформации составит: (1000/1x 10 7 ) х 100 = 0,1%

    Альтернативно, можно указать КОЕ на микрограмм ДНК, использованной для трансформации. Это можно рассчитать, умножив количество колоний на объем высеянной культуры и разделив на количество использованной ДНК.

    Количественная ПЦР (кПЦР). В этом методе используется тот факт, что плазмидная ДНК будет иметь определенный ген или последовательность, которой нет в геноме клетки-хозяина, и поэтому ее можно использовать в качестве мишени для кПЦР. Количественно оценивая количество копий этого конкретного гена или последовательности в трансформированных клетках, можно определить количество плазмидной ДНК, присутствующей в клетке, и, следовательно, эффективность трансформации. [4]

    Флуоресцентный анализ . Этот метод основан на использовании плазмиды, содержащей флуоресцентный белок или репортерный ген. Трансформированные клетки затем анализируются с помощью проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии для определения количества клеток, экспрессирующих флуоресцентный белок . Затем эффективность трансформации рассчитывают как процент клеток, экспрессирующих флуоресцентный белок. [5]

    Количество жизнеспособных клеток в препарате для реакции трансформации может составлять от 2×10. 8 до 10 11 ; Наиболее распространенные методы получения E. coli дают около 10 10 жизнеспособных клеток на реакцию. Стандартными плазмидами, используемыми для определения эффективности трансформации в Escherichia coli, являются pBR322 или другие векторы аналогичного размера или меньшего размера, такие как серия векторов pUC. Однако для определения эффективности их трансформации можно использовать разные векторы. Для трансформации можно использовать 10–100 пг ДНК, для низкоэффективной трансформации может потребоваться больше ДНК (обычно уровень насыщения достигается при концентрации более 10 нг). [6]

    После трансформации 1% и 10% клеток высевают отдельно, клетки можно разбавлять в среде по мере необходимости для облегчения высева. Дальнейшее разбавление может быть использовано для высокоэффективной трансформации.

    Эффективность преобразования 1×10 8 КОЕ/мкг для небольшой плазмиды, такой как pUC19, примерно эквивалентно 1 из 2000 молекул используемой плазмиды, вводимых в клетки. В E. coli теоретический предел эффективности трансформации для наиболее часто используемых плазмид будет превышать 1×10. 11 КОЕ/мкг. На практике наилучший достижимый результат может составлять около 2–4×10. 10 КОЕ/мкг для небольших плазмид, таких как pUC19, и значительно ниже для крупных плазмид.

    Факторы, влияющие на эффективность трансформации

    [ редактировать ]

    Отдельные клетки способны поглощать множество молекул ДНК, но наличие нескольких плазмид существенно не влияет на возникновение успешных событий трансформации. [7] На эффективность трансформации может повлиять ряд факторов: [2]

    Размер плазмиды . Исследование, проведенное на E. coli, показало, что эффективность трансформации линейно снижается с увеличением размера плазмиды , т.е. более крупные плазмиды трансформируются хуже, чем меньшие плазмиды. [7] [8] [9]

    Формы ДНК . Суперспиральные плазмиды имеют немного лучшую эффективность трансформации, чем расслабленные плазмиды. Релаксированные плазмиды трансформируются примерно с 75% эффективностью сверхспиральных. [7] Однако линейная и одноцепочечная ДНК имеют гораздо меньшую эффективность трансформации. Одноцепочечные ДНК трансформируются в 10 4 эффективность ниже, чем у двухцепочечных.

    Состав средств массовой информации . Состав средств массовой информации, используемых в процессе преобразования, может повлиять на эффективность. Например, некоторые добавки к средам могут повысить естественную компетентность клеток. [10]

    Генотип клеток . Клонирующие штаммы могут содержать мутации, повышающие эффективность трансформации клеток. Например, штаммы E. coli K12 с мутацией deoR , которая, как первоначально было обнаружено, придает клеткам способность расти в минимальной среде с использованием инозина в качестве единственного источника углерода, имеют в 4-5 раз большую эффективность трансформации, чем аналогичные штаммы без инозина. Для линейной ДНК, которая плохо трансформируется в E. coli , мутация RecBC или RecD может значительно повысить эффективность ее трансформации. [11]

    Условия культивирования . Клетки E. coli более склонны к повышению компетентности, когда они быстро растут, поэтому при приготовлении компетентных клеток клетки обычно собирают на ранней логарифмической фазе клеточного роста. Оптимальная оптическая плотность для сбора клеток обычно составляет около 0,4, хотя она может варьироваться в зависимости от штамма клеток. Было также обнаружено, что более высокое значение 0,94–0,95 дает хороший выход компетентных клеток, но это может быть непрактично, когда рост клеток быстрый. [12]

    Присутствие антибиотиков . Присутствие антибиотиков может повысить эффективность трансформации за счет ингибирования роста нетрансформированных клеток и отбора трансформированных клеток, устойчивых к антибиотику. Например, было показано, что использование β-лактамных антибиотиков повышает эффективность трансформации бактерий, продуцирующих глутамат. [13] [14] [15]

    Плазмидный источник репликации . Источник репликации плазмиды, используемой в процессе трансформации, может влиять на эффективность несколькими способами. Количество копий плазмиды в клетке, активность начала репликации в клетках-хозяевах и экспрессия генов на плазмиде - все это может влиять на эффективность. Плазмида с началом репликации с высоким числом копий обычно будет иметь более высокую эффективность трансфекции, чем плазмида с началом репликации с низким числом копий. Использование плазмиды с началом репликации, активным в клетке-хозяине, может привести к более высокой эффективности трансфекции. [16]

    трансформации Условия . Метод приготовления компетентных клеток, продолжительность теплового шока , температура теплового шока, время инкубации после теплового шока, используемая питательная среда, pH и различные добавки — все это может повлиять на эффективность трансформации клеток. Присутствие примесей, а также лигазы в лигирующей смеси может снизить эффективность трансформации при электропорации . [17] и инактивация лигазы или экстракция ДНК хлороформом могут быть необходимы для электропорации, в качестве альтернативы используйте только десятую часть смеси для лигирования, чтобы уменьшить количество примесей. Обычный препарат компетентных клеток может обеспечить эффективность трансформации от 10 6 до 10 8 КОЕ/мкг ДНК. Однако существуют протоколы химического метода создания сверхкомпетентных клеток, эффективность трансформации которых может превышать 1 x 10. 9 . [18]

    Повреждение ДНК . Воздействие на ДНК УФ-излучения в стандартной процедуре препаративного электрофореза в агарозном геле в течение всего лишь 45 секунд может повредить ДНК, и это может значительно снизить эффективность трансформации. [19] Однако добавление цитидина или гуанозина в буфер для электрофореза в концентрации 1 мМ может защитить ДНК от повреждения. УФ-излучение с более высокой длиной волны (365 нм), вызывающее меньшее повреждение ДНК, следует использовать, если необходимо работать с ДНК на УФ-трансиллюминаторе в течение длительного периода времени. Этот более длинноволновый УФ-излучение вызывает более слабую флуоресценцию с бромистым этидием, интеркалированным в ДНК, поэтому, если необходимо получить изображения полос ДНК, можно использовать УФ-излучение с более короткой длиной волны (302 или 312 нм). Однако такое воздействие должно быть ограничено очень коротким периодом времени, если ДНК необходимо впоследствии извлечь для лигирования и трансформации.

    Эффективность методов трансформации

    [ редактировать ]

    Метод, используемый для введения ДНК, оказывает существенное влияние на эффективность трансформации. [20]

    Электропорация

    [ редактировать ]

    Электропорация, как правило, более эффективна, чем химические методы, и может применяться к широкому кругу видов и штаммам, которые ранее были устойчивы и не поддавались методам трансформации. [21] [22]

    Было обнаружено, что электропорация имеет средний выход обычно между 10 4 - 10 8 КОЕ/мкг. Однако эффективность преобразования достигает 0,5-5 x 10 10 Колониеобразующие единицы (КОЕ) на микрограмм ДНК E. coli . Для образцов, с которыми трудно работать, таких как библиотеки кДНК , гДНК и плазмиды размером более 30 т.п.н., предлагается использовать электрокомпетентные клетки, эффективность трансформации которых превышает 1 x 10. 10 КОЕ/мкг. Это обеспечит высокую успешность внедрения ДНК и формирования большого количества колоний. [23] Важно отрегулировать и оптимизировать буфер для электропорации (увеличение концентрации буфера для электропорации может привести к повышению эффективности трансформации), а также форму, силу, количество и количество импульсов. Эти электрические параметры играют ключевую роль в эффективности трансформации. [24]

    Химическая трансформация

    [ редактировать ]

    Химическую трансформацию или тепловой шок можно провести в простой лабораторной установке, что обычно дает эффективность трансформации, достаточную для приложений клонирования и субклонирования, примерно 10 6 КОЕ/мкг. Одним из первых используемых методов была комбинация CaCl 2 и MgCl 2 для лечения клеток. Однако эти методы привели к повышению эффективности преобразования максимум до 10 5 - 10 6 Колониеобразующие единицы (КОЕ) на микрограмм плазмидной ДНК. [23] Более поздние исследования показали, что некоторые катионы, такие как Mn 2+ , Как 2+ , Нет 2+ , сэр 2+ и мг 2+ может оказать положительное влияние на эффективность трансформации, при этом Mn 2+ показывая наибольший эффект. [25]

    Ограничительные барьеры на пути эффективной трансформации

    [ редактировать ]

    Некоторые бактериальные клетки имеют системы рестрикции-модификации, которые могут разрушать экзогенные плазмиды, чужеродные для клетки-хозяина. Это может значительно снизить эффективность трансформации. [26] [20] Это связано с системами рестрикции в клетках-реципиентах, которые нацеливаются и разрушают экзогенную ДНК. Эти системы распознают экзогенную ДНК на основе различий в характере метилирования. Для решения этой проблемы были применены такие стратегии, как изменение метилирования экзогенной ДНК с использованием коммерческих метилаз или снижение рестрикционной активности в клетках-реципиентах. [27] [28] Например, использование мутантов с отрицательным метилированием или временная инактивация системы рестрикции нагреванием может снизить способность клетки-реципиента налагать ограничения на экзогенную ДНК. [29]

    См. также

    [ редактировать ]

    Ссылки

    [ редактировать ]
    1. ^ «как рассчитать эффективность трансформации» . www.edvotek.com . Проверено 5 января 2023 г.
    2. ^ Перейти обратно: а б Ханахан Д., Джесси Дж., Блум Ф.Р. (1991). «[4] Плазмидная трансформация Escherichia coli и других бактерий». Плазмидная трансформация Escherichia coli и других бактерий . Методы энзимологии. Том. 204. стр. 63–113. дои : 10.1016/0076-6879(91)04006-а . ISBN  9780121821050 . ПМИД   1943786 .
    3. ^ Сьювертс С., де Бок Ф.А., Молс Э., де вос В.М., Влиг Дж.Э. (октябрь 2008 г.). «Простой и быстрый метод определения колониеобразующих единиц». Письма по прикладной микробиологии . 47 (4): 275–278. дои : 10.1111/j.1472-765X.2008.02417.x . ПМИД   18778376 . S2CID   205628268 .
    4. ^ Сунь С, Кан XP, Син XJ, Сюй XY, Ченг Дж, Чжэн СВ, Син ГМ (03 сентября 2015 г.). «Агробактериальная трансформация томата (Lycopersicon esculentum L. cv. Hezuo 908) с повышенной эффективностью» . Биотехнология и биотехнологическое оборудование . 29 (5): 861–868. дои : 10.1080/13102818.2015.1056753 . ISSN   1310-2818 . S2CID   84120044 .
    5. ^ Расала Б.А., Баррера Д.Дж., Нг Дж., Плуцинак Т.М., Розенберг Дж.Н., Уикс Д.П. и др. (май 2013 г.). «Расширение спектральной палитры флуоресцентных белков зеленой микроводоросли Chlamydomonas Reinhardtii». Заводской журнал . 74 (4): 545–556. дои : 10.1111/tpj.12165 . ПМИД   23521393 .
    6. ^ «Расчет эффективности трансформации» . Сигма-Олдрич .
    7. ^ Перейти обратно: а б с Ханахан Д. (июнь 1983 г.). «Исследования по трансформации Escherichia coli плазмидами». Журнал молекулярной биологии . 166 (4): 557–580. дои : 10.1016/S0022-2836(83)80284-8 . ПМИД   6345791 .
    8. ^ Шэн Ю, Манчино В, Биррен Б (июнь 1995 г.). «Трансформация Escherichia coli большими молекулами ДНК методом электропорации» . Исследования нуклеиновых кислот . 23 (11): 1990–1996. дои : 10.1093/нар/23.11.1990 . ПМК   306974 . ПМИД   7596828 .
    9. ^ Наката Ю, Тан Х, Ёкояма К.К. (1996). «Подготовка компетентных клеток для высокоэффективной плазмидной трансформации Escherichia coli». Протоколы библиотеки кДНК . Методы молекулярной биологии. Том. 69. Нью-Джерси: Humana Press. стр. 129–137. дои : 10.1385/0-89603-383-x:129 . ISBN  0-89603-383-Х . ПМИД   9116846 .
    10. ^ Ян Л, Сюй Р, Чжоу Ю, Гун Ю, Дай С, Лю Х, Бянь Ю (июнь 2019 г.). «Влияние состава среды и генетического фона на эффективность агробактериальной трансформации Lentinula edodes » . Гены . 10 (6): 467. doi : 10.3390/genes10060467 . ПМК   6627104 . ПМИД   31248134 .
    11. ^ Мерфи КС (апрель 1998 г.). «Использование функций рекомбинации бактериофага лямбда для содействия замене генов в Escherichia coli» . Журнал бактериологии . 180 (8): 2063–2071. дои : 10.1128/JB.180.8.2063-2071.1998 . ПМК   107131 . ПМИД   9555887 .
    12. ^ Тан X, Наката Ю, Ли Хо, Чжан М, Гао Х, Фудзита А и др. (июль 1994 г.). «Оптимизация препаратов компетентных клеток для трансформации кишечной палочки» . Исследования нуклеиновых кислот . 22 (14): 2857–2858. дои : 10.1093/нар/22.14.2857 . ПМК   308259 . ПМИД   8052542 .
    13. ^ Кацумата Р., Одзаки А., Ока Т., Фуруя А. (июль 1984 г.). «Трансформация протопластов бактерий, продуцирующих глутамат, плазмидной ДНК» . Журнал бактериологии . 159 (1): 306–311. дои : 10.1128/jb.159.1.306-311.1984 . ПМК   215630 . ПМИД   6145700 .
    14. ^ Шарпантье X, Кей Э, Шнайдер Д, Шуман ХА (март 2011 г.). «Антибиотики и УФ-излучение вызывают способность к естественной трансформации Legionella pneumophila» . Журнал бактериологии . 193 (5): 1114–1121. дои : 10.1128/JB.01146-10 . ПМК   3067580 . ПМИД   21169481 .
    15. ^ Лопаткин А.Ю., Сысоева Т.А., Ю Л (декабрь 2016). «Анализ влияния антибиотиков на горизонтальный перенос генов: анализ предполагает решающую роль динамики отбора» . Биоэссе . 38 (12): 1283–1292. doi : 10.1002/bies.201600133 . ПМК   6541220 . ПМИД   27699821 .
    16. ^ «Плазмиды – обзор !Темы» . www.sciencedirect.com . Проверено 25 января 2023 г.
    17. ^ Имер С. (декабрь 1991 г.). «Тепловая инактивация ДНК-лигазы перед электропорацией повышает эффективность трансформации» . Исследования нуклеиновых кислот . 19 (24): 6960. doi : 10.1093/nar/19.24.6960 . ПМК   329344 . ПМИД   1762931 .
    18. ^ Иноуэ Х., Нодзима Х., Окаяма Х. (ноябрь 1990 г.). «Высокоэффективная трансформация Escherichia coli плазмидами». Джин . 96 (1): 23–28. дои : 10.1016/0378-1119(90)90336-П . ПМИД   2265755 .
    19. ^ Грюндеманн Д., Шёмиг Э. (ноябрь 1996 г.). «Защита ДНК при препаративном электрофорезе в агарозном геле от повреждений, вызванных ультрафиолетовым светом» . БиоТехники . 21 (5): 898–903. дои : 10.2144/96215rr02 . ПМИД   8922632 .
    20. ^ Перейти обратно: а б Ауне Т.Е., Аахманн, Флорида (февраль 2010 г.). «Методы повышения эффективности трансформации и количества бактерий, которые можно трансформировать». Прикладная микробиология и биотехнология . 85 (5): 1301–1313. дои : 10.1007/s00253-009-2349-1 . ПМИД   19946685 . S2CID   29812996 .
    21. ^ Ромеро Д., Перес-Гарсиа А., Венинг Дж.В., де Висенте А., Кейперс О.П. (сентябрь 2006 г.). «Трансформация неодомашненных штаммов Bacillus subtilis путем электропорации протопластов» . Журнал микробиологических методов . 66 (3): 556–559. дои : 10.1016/j.mimet.2006.01.005 . ПМИД   16503058 .
    22. ^ Ри М.С., Ким Дж.В., Цянь Ю, Ингрэм Л.О., Шанмугам К.Т. (июль 2007 г.). «Разработка плазмидного вектора и условий электропорации для переноса генов в спорогенных молочнокислых бактериях Bacillus coagulans». Плазмида . 58 (1): 13–22. doi : 10.1016/j.plasmid.2006.11.006 . ПМИД   17215040 .
    23. ^ Перейти обратно: а б «Компетентный выбор клеток – 6 общих соображений - США» . www.thermofisher.com . Проверено 27 января 2023 г.
    24. ^ Дауэр В.Дж., Миллер Дж.Ф., Рэгсдейл К.В. (июль 1988 г.). «Высокоэффективная трансформация E. coli методом электропорации под высоким напряжением» . Исследования нуклеиновых кислот . 16 (13): 6127–6145. дои : 10.1093/нар/16.13.6127 . ПМК   336852 . ПМИД   3041370 .
    25. ^ «Таблица 1: Однонуклеотидные полиморфизмы в белке катепсина B, полученные из литературы (PMID: 16492714)» . дои : 10.7717/peerj.7425/таблица-1 . {{cite journal}}: Для цитирования журнала требуется |journal= ( помощь )
    26. ^ Кослой С.Д., Оиси М. (январь 1973 г.). «Генетическая трансформация Escherichia coli K12» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 70 (1): 84–87. Бибкод : 1973ПНАС...70...84С . дои : 10.1073/pnas.70.1.84 . ПМЦ   433189 . ПМИД   4630612 .
    27. ^ Лоуренц М.Б., Кавабата Х., Персер Дж.Э., Норрис С.Дж. (сентябрь 2002 г.). «Снижение эффективности электропорации у Borrelia burgdorferi, содержащих линейные плазмиды lp25 и lp56: влияние на трансформацию инфекционного B. burgdorferi» . Инфекция и иммунитет . 70 (9): 4798–4804. дои : 10.1128/IAI.70.9.4798-4804.2002 . ПМК   128261 . ПМИД   12183522 .
    28. ^ Мизуно Т., Муто Н., Панасенко С.М., Имаэ Ю. (март 1986 г.). «Приобретение хемотаксиса мальтозы у Salmonella typhimurium путем введения гена хемосенсорного преобразователя Escherichia coli» . Журнал бактериологии . 165 (3): 890–895. дои : 10.1128/jb.165.3.890-895.1986 . ПМК   214512 . ПМИД   3512528 .
    29. ^ Эдвардс Р.А., Хелм Р.А., Малой С.Р. (май 1999 г.). «Повышение эффективности переноса ДНК за счет временной инактивации ограничения хозяина» . БиоТехники . 26 (5): 892–4, 896, 898 пассим. дои : 10.2144/99265st02 . ПМИД   10337482 .
    [ редактировать ]
    Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Transformation_efficiency&oldid=1224589535"
    Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
    Arc.Ask3.Ru
    Номер скриншота №: 2fea08d5760bb4c319918a0f3dfac71d__1716094020
    URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/2f/1d/2fea08d5760bb4c319918a0f3dfac71d.html
    Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
    Transformation efficiency - Wikipedia
    Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)