pUC19
pUC19 — один из серии векторов для клонирования плазмид, разработанных Йоахимом Мессингом и его коллегами. [1] Обозначение «pUC» происходит от классического префикса «p» (обозначающего « плазмиду ») и аббревиатуры Калифорнийского университета , где проводились ранние работы по серии плазмид. [2] Все плазмиды pUC представляют собой кольцевую двухцепочечную ДНК длиной около 2700 пар оснований. [3] Плазмиды pUC являются одними из наиболее широко используемых векторов клонирования. [3] Частично это связано с тем, что клетки, которые были успешно трансформированы, можно легко отличить от тех, которые не были трансформированы, на основании цветовых различий колоний. [3] pUC18 похож на pUC19, но область MCS перевернута.
Функции
[ редактировать ]pUC19 кодирует N-концевой фрагмент гена β-галактозидазы ( lacZ ) E. coli , также называемый α-пептидом. [4] [3] Сайт множественного клонирования (MCS), который содержит множество сайтов рестрикции , разделен на кодоны 6–7 гена lacZ. [4] Это позволяет проводить сине-белый скрининг при использовании штаммов-хозяев, таких как E. coli JM109, который продуцирует только С-концевую часть lacZ , также известную как β-полипептид. [3] Если pUC19 вставить в E. coli JM109 и вырастить на агаровой среде с добавлением IPTG и X-gal , то колонии станут синими, поскольку плазмида кодирует α-пептид, необходимый для создания функциональной формы β-галактозидазы. Однако если фрагмент ДНК вставить в MCS pUC19, колонии будут выглядеть белыми, поскольку плазмида не сможет продуцировать α-пептид. [3]
Помимо β-галактозидазы, pUC19 также кодирует ген устойчивости к ампициллину ( amp Р ), посредством фермента β-лактамазы, который расщепляет ампициллин и снижает его токсичность для хозяина. [5] Клетки, которые были успешно трансформированы с помощью pUC19, можно отличить от клеток, которые этого не сделали, выращивая их на среде с ампициллином. Только клетки с плазмидой, содержащей amp Р выживет.
Начало репликации ( ori ) происходит от плазмиды pMB1. [6] [1] pUC19 представляет собой плазмиду с высоким числом копий . [3] Высокое число копий является результатом отсутствия гена rop и единственной точечной мутации в ori pMB1. [7] [8]
Механизм
[ редактировать ]
Фрагмент lacZ , синтез которого может индуцироваться IPTG, способен к внутриаллельной комплементации дефектной формой фермента β-галактозидазы, кодируемой хромосомой хозяина (мутация lacZDM15 в E. coli JM109, DH5α и XL1-Blue). штаммах [4] В присутствии ИПТГ в питательной среде бактерии синтезируют оба фрагмента фермента. Оба фрагмента способны вместе гидролизовать X-гал (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид) и образовывать синие колонии при выращивании на средах с его добавками.
Вставка чужеродной ДНК в MCS, расположенный внутри lacZ, вызывает инсерционную инактивацию этого гена на N-концевом фрагменте бета-галактозидазы и отменяет внутриаллельную комплементацию. Таким образом, бактерии, несущие рекомбинантные плазмиды в MCS, не могут гидролизовать X-gal, образуя белые колонии, которые можно отличить на культуральной среде от нерекомбинантных клеток, которые имеют синий цвет. [9]
Использование в исследованиях
[ редактировать ]Из-за широкого использования в качестве вектора клонирования в исследованиях и промышленности pUC19 часто используется в исследованиях в качестве модельной плазмиды. [10] Например, биофизические исследования его естественного сверхспирального состояния определили, что его радиус вращения составляет 65,6 нм, а радиус Стокса - 43,6 нм.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Яниш-Перрон, Селеста; Виейра, Джеффри; Мессинг, Иоахим (1985). «Улучшенные векторы для клонирования фага M13 и штаммы-хозяева: нуклеотидные последовательности векторов M13mp18 и pUC19». Джин . 33 (1): 103–119. дои : 10.1016/0378-1119(85)90120-9 . ПМИД 2985470 .
- ^ Виейра, Джеффри; Мессинг, Иоахим (1982). «Плазмиды pUC, система, полученная из M13mp7, для инсерционного мутагенеза и секвенирования с использованием синтетических универсальных праймеров». Джин . 19 (3): 259–268. дои : 10.1016/0378-1119(82)90015-4 . ПМИД 6295879 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г Хенкин, Тина М .; Питерс, Джозеф Э. (2020). «Плазмиды». Молекулярная генетика бактерий Снайдера и Чампнесса (Пятое изд.). Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons, Inc., стр. 208–209. ISBN 9781555819750 .
- ^ Jump up to: а б с Луро, Рикардо О.; Крайтон, Роберт Р. (2013). Практические подходы к биологической неорганической химии . Амстердам, Оксфорд: Elsevier . п. 279. ИСБН 9780444563590 . Проверено 7 апреля 2014 г.
- ^ Ван, Нам Сун. «Краткая информация о сайтах pUC19» . Кафедра химической и биомолекулярной инженерии Университета Мэриленда . Проверено 27 января 2017 г.
- ^ Хелински, Дональд Р. (15 декабря 2022 г.). «Краткая история плазмид». ЭкоСал Плюс . 10 (1). doi : 10.1128/ecosalplus.esp-0028-2021 .
- ^ О'Хэнлон Корт, Карен (26 ноября 2014 г.). «pUC18 – вероятно, лучшая высококопийная плазмида в мире!» . BiteSize Био .
- ^ Саха, Арджун; Харалалка, Шрути; Бхадра, Рупак К. (ноябрь 2004 г.). «Естественная точечная мутация в 13-мерном R-повторе влияет на функцию oriC большой хромосомы классического биотипа Vibrio cholerae O1». Архив микробиологии . 182 (5): 421–427. Бибкод : 2004ArMic.182..421S . дои : 10.1007/s00203-004-0708-y . ПМИД 15375645 . S2CID 28286917 .
- ^ Пастернак, Джек Дж. (2005). Введение в молекулярную генетику человека (2-е изд.). Уайли . п. 117. ИСБН 978-0-471-71917-5 .
- ^ Стеркле, Доминик (5 сентября 2007 г.). «Комплексное образование ДНК с противоположно заряженными полиэлектролитами различной топологии цепи: цилиндрические щетки и дендримеры». Макромолекулы . 40 (22): 7998–8006. Бибкод : 2007МаМол..40.7998S . дои : 10.1021/ma0711689 .
