✖


Jump to content

Генетическая трансформация

Не следует путать с несвязанным процессом, называемым злокачественной трансформацией , который происходит при прогрессировании рака .
На этом изображении ген из одной бактериальной клетки перемещается в другую бактериальную клетку. Этот процесс поглощения новой бактериальной клеткой нового генетического материала называется трансформацией.

В молекулярной биологии и генетике возникающее трансформация — это генетическое изменение клетки , в результате прямого поглощения и включения экзогенного генетического материала из окружающей среды через клеточную мембрану (мембраны). Чтобы трансформация произошла, бактерия-реципиент должна находиться в состоянии компетентности , которое может возникнуть в природе как ограниченный по времени ответ на условия окружающей среды, такие как голод и плотность клеток, а также может быть индуцировано в лаборатории. [1]

Трансформация — это один из трех процессов, которые приводят к горизонтальному переносу генов , при котором экзогенный генетический материал переходит от одной бактерии к другой, два других — это конъюгация (перенос генетического материала между двумя бактериальными клетками при прямом контакте) и трансдукция (инъекция чужеродной ДНК). вирусом бактериофага в бактерию-хозяина). [1] При трансформации генетический материал проходит через промежуточную среду, и его усвоение полностью зависит от бактерии-реципиента. [1]

По состоянию на 2014 год было известно, что около 80 видов бактерий способны к трансформации, причем примерно поровну между грамположительными и грамотрицательными бактериями ; это число может быть завышенным, поскольку некоторые отчеты подкреплены отдельными статьями. [1]

«Трансформация» также может использоваться для описания внедрения нового генетического материала в небактериальные клетки, включая клетки животных и растений; однако, поскольку « трансформация » имеет особое значение по отношению к клеткам животных, указывая на переход в раковое состояние, этот процесс обычно называют « трансфекцией ». [2]

История

[ редактировать ]

Трансформация бактерий была впервые продемонстрирована в 1928 году британским бактериологом Фредериком Гриффитом . [3] Гриффита интересовало, можно ли использовать инъекции убитых нагреванием бактерий для вакцинации мышей против пневмонии. Однако он обнаружил, что невирулентный штамм Streptococcus pneumoniae может стать вирулентным после воздействия вирулентных штаммов, убитых нагреванием. Гриффит предположил, что некий « принцип трансформации » штамма, убитого нагреванием, сделал безвредный штамм вирулентным. определили этот «преобразующий принцип» как генетический В 1944 году Освальд Эйвери , Колин Маклауд и Маклин Маккарти . Они выделили ДНК из вирулентного штамма S. pneumoniae и, используя только эту ДНК, смогли сделать безвредный штамм вирулентным. Они назвали это поглощение и включение ДНК бактериями «трансформацией» (см. эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти ). [4] Результаты экспериментов Эйвери и др. поначалу были скептически восприняты научным сообществом, и так продолжалось до разработки генетических маркеров и открытия других методов генетического переноса ( конъюгации в 1947 году и трансдукции в 1953 году) Джошуа Ледербергом. что эксперименты Эйвери были приняты. [5]

Первоначально считалось, что Escherichia coli , широко используемый лабораторный организм, устойчива к трансформации. Однако в 1970 году Мортон Мандель и Акико Хига показали, что можно заставить E. coli поглощать ДНК бактериофага λ без использования фага-хелпера . после обработки раствором хлорида кальция [6] Два года спустя, в 1972 году, Стэнли Норман Коэн , Энни Чанг и Лесли Сюй показали, что CaCl
Обработка 2 также эффективна для трансформации плазмидной ДНК. [7] Метод трансформации Манделя и Хиги позже был усовершенствован Дугласом Ханаханом . [8] Открытие искусственно индуцированной компетентности у E. coli создало эффективную и удобную процедуру трансформации бактерий, которая позволяет использовать более простые методы молекулярного клонирования в биотехнологиях и исследованиях , и теперь это обычно используемая лабораторная процедура.

Трансформация с помощью электропорации была разработана в конце 1980-х годов, что повысило эффективность трансформации in vitro и увеличило количество бактериальных штаммов , которые можно было трансформировать. [9] Трансформация клеток животных и растений также была исследована: первая трансгенная мышь была создана путем инъекции гена гормона роста крысы в ​​эмбрион мыши в 1982 году. [10] В 1897 году была открыта бактерия, вызывающая опухоли растений, Agrobacterium tumefaciens , а в начале 1970-х годов было обнаружено, что агент, вызывающий опухоли, представляет собой ДНК- плазмиду, названную Ti-плазмидой . [11] Удалив из плазмиды гены, вызвавшие опухоль, и добавив новые гены, исследователи смогли заразить растения A. tumefaciens и позволить бактериям встроить выбранную ими ДНК в геномы растений. [12] Не все растительные клетки восприимчивы к заражению A. tumefaciens , поэтому были разработаны другие методы, включая электропорацию и микроинъекцию . [13] Бомбардировка частицами стала возможной благодаря изобретению в 1980-х годах системы доставки биолистических частиц (генной пушки) Джоном Сэнфордом . [14] [15] [16]

Определения

[ редактировать ]

Трансформация — это одна из трех форм горизонтального переноса генов , которые происходят в природе среди бактерий, при которой ДНК, кодирующая признак, передается от одной бактерии к другой и интегрируется в геном реципиента путем гомологичной рекомбинации ; два других — это трансдукция , осуществляемая с помощью бактериофага , и конъюгация , при которой ген передается при прямом контакте между бактериями. [1] При трансформации генетический материал проходит через промежуточную среду, и его усвоение полностью зависит от бактерии-реципиента. [1]

Компетенция относится к временному состоянию способности поглощать экзогенную ДНК из окружающей среды; его можно вызвать в лаборатории. [1]

Похоже, это древний процесс, унаследованный от общего прокариотического предка, который является полезной адаптацией, способствующей рекомбинационной репарации повреждений ДНК, особенно повреждений, полученных в стрессовых условиях. Естественная генетическая трансформация, по-видимому, представляет собой адаптацию к восстановлению повреждений ДНК, которая также создает генетическое разнообразие . [1] [17]

Трансформация изучалась у важных с медицинской точки зрения видов грамотрицательных бактерий , таких как Helicobacter pylori , Legionella pneumophila , Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae и Vibrio cholerae . [18] Он также был изучен на грамотрицательных видах, обнаруженных в почве, таких как Pseudomonas stutzeri , Acinetobacter baylyi , и на грамотрицательных патогенах растений, таких как Ralstonia solanacearum и Xylella fastidiosa . [18] Трансформация грамположительных бактерий изучалась у важных с медицинской точки зрения видов, таких как Streptococcus pneumoniae , Streptococcus mutans , Staphylococcus aureus и Streptococcus sanguinis , а также у грамположительных почвенных бактерий Bacillus subtilis . [17] Об этом также сообщалось как минимум у 30 видов Pseudomonadota, относящихся к нескольким различным классам. [19] Наиболее изученными Pseudomonadota в отношении трансформации являются важные с медицинской точки зрения возбудители человека Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae и Helicobacter pylori . [17]

«Трансформация» также может использоваться для описания внедрения нового генетического материала в небактериальные клетки, включая клетки животных и растений; однако, поскольку « трансформация » имеет особое значение по отношению к клеткам животных, указывая на переход в раковое состояние, этот процесс обычно называют « трансфекцией ». [2]

Естественная компетентность и трансформация

[ редактировать ]
Основная статья: Естественная компетентность

Естественно компетентные бактерии несут наборы генов, которые обеспечивают белковый механизм для переноса ДНК через клеточную мембрану(ы). Для транспорта экзогенной ДНК в клетки могут потребоваться белки, которые участвуют в сборке пилей типа IV и системы секреции типа II , а также комплекс ДНК- транслоказы на цитоплазматической мембране. [20]

Из-за различий в строении клеточной оболочки грамположительных и грамотрицательных бактерий существуют некоторые различия в механизмах поглощения ДНК этими клетками, однако большинство из них имеют общие черты, связанные с участием родственных белков. ДНК сначала связывается с поверхностью компетентных клеток на ДНК-рецепторе и проходит через цитоплазматическую мембрану посредством ДНК-транслоказы. [21] Через него может пройти только одноцепочечная ДНК, при этом другая цепь разрушается нуклеазами. Транслоцированная одноцепочечная ДНК затем может быть интегрирована в бактериальные хромосомы посредством RecA -зависимого процесса. В грамотрицательных клетках из-за наличия дополнительной мембраны ДНК требует наличия канала, образованного секретинами на внешней мембране. Пилин может потребоваться для компетентности, но его роль неопределенна. [22] Поглощение ДНК обычно неспецифично для последовательности, хотя у некоторых видов наличие специфических последовательностей поглощения ДНК может способствовать эффективному поглощению ДНК. [23]

Естественная трансформация

[ редактировать ]

Естественная трансформация — это бактериальная адаптация к переносу ДНК, которая зависит от экспрессии многочисленных бактериальных генов, продукты которых, по-видимому, ответственны за этот процесс. [20] [19] В целом трансформация – сложный, энергозатратный процесс развития. Для того чтобы бактерия связала, забрала и рекомбинировала экзогенную ДНК в свою хромосому, она должна стать компетентной, т. е. войти в особое физиологическое состояние. Развитие компетентности Bacillus subtilis требует экспрессии около 40 генов. [24] ДНК, интегрированная в хромосому хозяина, обычно (но за редкими исключениями) происходит от другой бактерии того же вида и, таким образом, гомологична резидентной хромосоме.

У B. subtilis длина перенесенной ДНК превышает 1271 т.п.н. (более 1 млн оснований). [25] Передаваемая длина, вероятно, представляет собой двухцепочечную ДНК и часто составляет более трети общей длины хромосомы, равной 4215 т.п.н. [26] Похоже, что около 7-9% клеток-реципиентов занимают всю хромосому. [27]

Способность к естественной трансформации, по-видимому, присутствует у ряда прокариот, и на данный момент известно, что 67 видов прокариот (в семи различных типах) подвергаются этому процессу. [19]

Способность к трансформации обычно индуцируется высокой плотностью клеток и/или ограничением питания, т.е. условиями, связанными со стационарной фазой бактериального роста. Трансформация Haemophilus influenzae происходит наиболее эффективно в конце экспоненциального роста, когда рост бактерий приближается к стационарной фазе. [28] Трансформация у Streptococcus mutans , как и у многих других стрептококков, происходит при высокой плотности клеток и связана с образованием биопленок . [29] Компетентность B. subtilis индуцируется ближе к концу логарифмического роста, особенно в условиях ограничения аминокислот. [30] Аналогичным образом, у Micrococcus luteus (представителя менее изученного типа Actinomycetota ) компетентность развивается во время средне-поздней фазы экспоненциального роста и также запускается аминокислотным голоданием. [31] [32]

, высвобождая неповрежденную ДНК хозяина и плазмиды, Считается, что некоторые бактериофаги способствуют трансформации. [33]

Трансформация как адаптация к репарации ДНК

[ редактировать ]

Компетентность конкретно индуцируется условиями, повреждающими ДНК. трансформация индуцируется Например, у Streptococcus pneumoniae агентами, повреждающими ДНК, митомицином С (агент, сшивающий ДНК) и фторхинолоном (ингибитор топоизомеразы, вызывающий двухцепочечные разрывы). [34] У B. subtilis трансформация усиливается под действием УФ-света, агента, повреждающего ДНК. [35] У Helicobacter pylori ципрофлоксацин, который взаимодействует с ДНК-гиразой и вызывает двухцепочечные разрывы, индуцирует экспрессию генов компетентности, тем самым увеличивая частоту трансформации. [36] Используя Legionella pneumophila , Charpentier et al. [37] протестировали 64 токсичные молекулы, чтобы определить, какие из них вызывают компетентность. Из них только шесть агентов, повреждающих ДНК, вызвали сильную индукцию. Этими агентами, повреждающими ДНК, были митомицин С (который вызывает межцепочечные сшивки ДНК), норфлоксацин, офлоксацин и налидиксовая кислота (ингибиторы ДНК-гиразы, вызывающие двухцепочечные разрывы). [38] ), бицикломицин (вызывает одно- и двухцепочечные разрывы [39] ) и гидроксимочевина (индуцирует окисление оснований ДНК [40] ). УФ-свет также индуцировал компетентность L. pneumophila . Шарпантье и др. [37] предположил, что способность к трансформации, вероятно, развилась как реакция на повреждение ДНК.

Логарифмически растущие бактерии отличаются от бактерий, находящихся в стационарной фазе, количеством копий генома, присутствующих в клетке, и это влияет на способность осуществлять важный процесс репарации ДНК . Во время логарифмического роста в бактериальной клетке могут присутствовать две или более копии любого конкретного участка хромосомы, поскольку деление клетки не совсем точно соответствует репликации хромосомы. Процесс гомологичной рекомбинационной репарации (HRR) является ключевым процессом репарации ДНК, который особенно эффективен для восстановления двухцепочечных повреждений, таких как двухцепочечные разрывы. Этот процесс зависит от наличия второй гомологичной хромосомы в дополнение к поврежденной хромосоме. Во время логарифмического роста повреждение ДНК в одной хромосоме может быть восстановлено с помощью HRR, используя информацию о последовательности из другой гомологичной хромосомы. Однако когда клетки достигают стационарной фазы, они обычно имеют только одну копию хромосомы, и HRR требует ввода гомологичной матрицы извне клетки путем трансформации. [41]

Чтобы проверить, является ли адаптивная функция трансформации репарацией повреждений ДНК, была проведена серия экспериментов с использованием B. subtilis , облученной УФ-светом, в качестве повреждающего агента (обзор Michod et al. [42] и Бернштейн и др. [41] Результаты этих экспериментов показали, что трансформация ДНК способствует восстановлению потенциально смертельных повреждений ДНК, вызванных УФ-светом в ДНК-реципиенте. Конкретным процессом, ответственным за ремонт, скорее всего, был HRR. Трансформацию у бактерий можно рассматривать как примитивный половой процесс, поскольку он включает взаимодействие гомологичной ДНК двух особей с образованием рекомбинантной ДНК, которая передается последующим поколениям. Бактериальная трансформация у прокариот, возможно, была наследственным процессом, который привел к мейотическому половому размножению у эукариот (см. Эволюция полового размножения ; Мейоз ).

Методы и механизмы трансформации в лаборатории

[ редактировать ]
Схема бактериальной трансформации, для которой сначала необходимо вызвать искусственную компетентность

Бактериальный

[ редактировать ]

Искусственную компетентность можно вызвать с помощью лабораторных процедур, которые включают в себя создание пассивной проницаемости клетки для ДНК путем воздействия на нее условий, которые обычно не встречаются в природе. [43] Обычно клетки инкубируют в растворе, содержащем двухвалентные катионы (часто хлорид кальция ) в холодных условиях, а затем подвергают воздействию теплового импульса (теплового шока). Хлорид кальция частично разрушает клеточную мембрану, что позволяет рекомбинантной ДНК проникнуть в клетку-хозяина. Клетки, способные усваивать ДНК, называются компетентными клетками.

Установлено, что рост грамотрицательных бактерий в 20 мМ Mg снижает количество связей белок- липополисахарид за счет увеличения соотношения ионных и ковалентных связей, что увеличивает текучесть мембран, облегчая трансформацию. [44] Роль липополисахаридов здесь подтверждается наблюдением, что более короткие О-боковые цепи трансформируются более эффективно – возможно, из-за улучшения доступности ДНК.

Поверхность бактерий, таких как E. coli, заряжена отрицательно из-за фосфолипидов и липополисахаридов на поверхности клеток, а ДНК также заряжена отрицательно. Таким образом, одной из функций двухвалентного катиона будет экранирование зарядов путем координации фосфатных групп и других отрицательных зарядов, тем самым позволяя молекуле ДНК прилипать к поверхности клетки.

Вход ДНК в клетки E. coli осуществляется через каналы, известные как зоны адгезии или соединение Байера, при этом типичная клетка несет до 400 таких зон. Их роль была установлена, когда было обнаружено, что кобаламин (который также использует эти каналы) конкурентно ингибирует поглощение ДНК. Другой тип каналов, участвующих в захвате ДНК, состоит из поли (HB): поли P: Ca. Предполагается, что в этом случае поли (HB) обертывается вокруг ДНК (которая сама по себе является полифосфатом) и удерживается в щите, образованном ионами Са. [44]

Предполагается, что воздействие на клетки двухвалентными катионами в холодном состоянии также может изменить или ослабить структуру клеточной поверхности, делая ее более проницаемой для ДНК. Считается, что тепловой импульс создает тепловой дисбаланс в клеточной мембране, который заставляет ДНК проникать в клетки либо через клеточные поры, либо через поврежденную клеточную стенку.

Электропорация - еще один метод повышения компетентности. В этом методе клетки кратковременно подвергают электрическому полю напряженностью 10-20 кВ /см, которое, как полагают, создает отверстия в клеточной мембране, через которые может проникнуть плазмидная ДНК. После удара электрическим током отверстия быстро закрываются механизмами восстановления клеточной мембраны.

Дрожжи

[ редактировать ]

Большинство видов дрожжей , включая Saccharomyces cerevisiae , могут быть трансформированы экзогенной ДНК из окружающей среды. Было разработано несколько методов, облегчающих это преобразование с высокой частотой в лаборатории. [45]

  • Дрожжевые клетки можно обрабатывать ферментами, которые разрушают их клеточные стенки с образованием сферопластов . Эти клетки очень хрупкие, но быстро поглощают чужеродную ДНК. [46]
  • Воздействие интактных дрожжевых клеток на щелочные катионы, такие как катионы цезия или лития, позволяет клеткам поглощать плазмидную ДНК. [47] Более поздние протоколы адаптировали этот метод трансформации с использованием ацетата лития , полиэтиленгликоля и одноцепочечной ДНК. [48] В этих протоколах одноцепочечная ДНК преимущественно связывается со стенкой дрожжевой клетки, предотвращая это действие плазмидной ДНК и оставляя ее доступной для трансформации. [49]
  • Электропорация : образование временных отверстий в клеточных мембранах с помощью электрического шока; это позволяет ДНК проникать, как описано выше для бактерий. [50]
  • Ферментативное пищеварение [51] или перемешивание стеклянными бусинами [52] также может быть использован для трансформации дрожжевых клеток.

Эффективность . Различные роды и виды дрожжей поглощают чужеродную ДНК с разной эффективностью. [53] Кроме того, большинство протоколов трансформации было разработано для пекарских дрожжей S. cerevisiae и, следовательно, может быть неоптимальным для других видов. Даже внутри одного вида разные штаммы имеют разную эффективность трансформации, иногда на три порядка. Например, когда штаммы S. cerevisiae были трансформированы 10 мкг плазмиды YEp13, штамм DKD-5D-H давал от 550 до 3115 колоний, тогда как штамм OS1 давал менее пяти колоний. [54]

Растения

[ редактировать ]

Существует ряд методов переноса ДНК в растительные клетки. Некоторые векторно -опосредованные методы:

  • Трансформация, опосредованная агробактериями, является самой легкой и простой трансформацией растений. Растительные ткани (часто листья) нарезают на небольшие кусочки, например 10х10 мм, и вымачивают на десять минут в жидкости, содержащей суспендированные агробактерии . Бактерии прикрепляются ко многим растительным клеткам, обнаженным в результате разреза. Растительные клетки секретируют связанные с ранами фенольные соединения, которые, в свою очередь, активируют оперон вирулентности агробактерий. Оперон вирулентности включает множество генов, которые кодируют белки, являющиеся частью системы секреции типа IV, которая экспортирует из бактериальных белков и ДНК (очерченную специфическими мотивами узнавания, называемыми пограничными последовательностями и вырезаемыми в виде одной цепи из плазмиды вирулентности) в растение. клетку через структуру, называемую пилусом. Перенесенная ДНК (так называемая Т-ДНК) направляется в ядро ​​растительной клетки с помощью сигналов ядерной локализации, присутствующих в белке VirD2 Agrobacterium, который ковалентно прикреплен к концу Т-ДНК на правой границе (RB). То, как именно Т-ДНК интегрируется в геномную ДНК растения-хозяина, является активной областью исследований биологии растений. Если предположить, что маркер селекции (такой как ген устойчивости к антибиотику) включен в Т-ДНК, трансформированную растительную ткань можно культивировать на селективной среде для получения побегов. Затем побеги переносят в другую среду, чтобы способствовать образованию корней. Как только из трансгенного побега начнут расти корни, растения можно перенести в почву для завершения нормального жизненного цикла (получения семян). Семена этого первого растения (называемого Т1, что означает первое трансгенное поколение) можно высевать на селективную (содержащую антибиотик) или, если ген устойчивости к гербицидам , альтернативно его можно было посадить в почву, а затем обработать гербицидом для уничтожения сегрегантов дикого типа. Некоторые виды растений, такие как Arabidopsis thaliana, можно трансформировать путем погружения цветков или всего растения в суспензию Agrobacterium tumefaciens , обычно штамма C58 (C = Cherry, 58 = 1958, год, в котором этот конкретный штамм A. tumefaciens был выделен из вишневого дерева в саду Корнелльского университета в Итаке, Нью-Йорк). Хотя многие растения по-прежнему не поддаются трансформации с помощью этого метода, продолжаются исследования, которые продолжают пополнять список видов, которые были успешно модифицированы таким способом.
  • Вирусная трансформация ( трансдукция ): упакуйте желаемый генетический материал в подходящий растительный вирус и позвольте этому модифицированному вирусу заразить растение. Если генетический материал представляет собой ДНК, он может рекомбинировать с хромосомами с образованием клеток-трансформантов. Однако геномы большинства вирусов растений состоят из одноцепочечной РНК , которая реплицируется в цитоплазме инфицированной клетки. Для таких геномов этот метод является формой трансфекции , а не настоящей трансформацией, поскольку вставленные гены никогда не достигают ядра клетки и не интегрируются в геном хозяина. Потомство зараженных растений не содержит вирусов, а также встроенного гена.

Некоторые безвекторные методы включают в себя:

  • Генная пушка : также называется бомбардировкой частицами, бомбардировкой микроснарядами или биолистикой. Частицы золота или вольфрама покрывают ДНК и затем выстреливают в молодые растительные клетки или эмбрионы растений. Некоторое количество генетического материала останется в клетках и трансформирует их. Этот метод также позволяет трансформировать растительные пластиды. Эффективность трансформации ниже, чем при трансформации, опосредованной Agrobacterium , но большинство растений можно трансформировать этим методом.
  • Электропорация : образование временных отверстий в клеточных мембранах с использованием электрических импульсов высокой напряженности поля; это позволяет ДНК проникать, как описано выше для бактерий. [55]

Грибы

[ редактировать ]

Существует несколько методов получения трансгенных грибов , большинство из которых аналогичны тем, которые используются для растений. Однако к грибам следует относиться по-разному из-за некоторых их микроскопических и биохимических особенностей:

  • Серьезной проблемой является дикариотическое состояние , в котором находятся части некоторых грибов; дикариотические клетки содержат два гаплоидных ядра, по одному от каждого родительского гриба. Если трансформируется только одно из них, что является правилом, процент трансформированных ядер уменьшается после каждого спорообразования . [56]
  • Стенки грибковых клеток довольно толстые, что затрудняет поглощение ДНК, поэтому часто требуется (частичное) удаление; [57] полная деградация, которая иногда необходима, [56] дает протопласты .
  • Мицелиальные грибы состоят из нитевидных гиф , которые, если вообще разделены внутренними клеточными стенками, прерываемыми порами, достаточно большими, чтобы питательные вещества и органеллы, иногда даже ядра, могли проходить через каждую гифу. В результате отдельные клетки обычно не могут быть разделены. Это проблематично, поскольку соседние трансформированные клетки могут сделать нетрансформированные клетки невосприимчивыми к селекционным обработкам, например, путем доставки питательных веществ или белков для устойчивости к антибиотикам. [56]
  • Кроме того, рост (и, следовательно, митоз) этих грибов происходит исключительно на кончиках гиф, что также может вызывать проблемы. [56]

Как говорилось ранее, ряд методов, используемых для трансформации растений, также работает и с грибами:

  • Агробактерии способны инфицировать не только растения, но и грибы, однако, в отличие от растений, грибы не выделяют фенольные соединения, необходимые для запуска агробактерий, поэтому их приходится добавлять, например, в форме ацетосирингона . [56]
  • Благодаря разработке системы экспрессии малых РНК у грибов стало возможным внедрение CRISPR/CAS9-системы в клетки грибов. [56] В 2016 году Министерство сельского хозяйства США заявило, что не будет регулировать штамм белых шампиньонов, отредактированный с помощью CRISPR/CAS9, чтобы предотвратить потемнение плодового тела, что вызвало широкую дискуссию о размещении на рынке культур, отредактированных с помощью CRISPR/CAS9. [58]
  • К грибам также применимы физические методы, такие как электропорация, биолистика («генная пушка»), сонопорация , использующая кавитацию пузырьков газа, создаваемых ультразвуком, для проникновения через клеточную мембрану и т. д. [59]

Животные

[ редактировать ]

Введение ДНК в клетки животных обычно называют трансфекцией и обсуждается в соответствующей статье.

Практические аспекты трансформации в молекулярной биологии

[ редактировать ]
Дополнительная информация: Эффективность трансформации.

Открытие искусственно индуцированной компетентности бактерий позволяет такие бактерии, как Escherichia coli, использовать в качестве удобного хозяина для манипуляций с ДНК, а также для экспрессии белков. Обычно плазмиды используют для трансформации в E.coli . Чтобы стабильно сохраняться в клетке, молекула плазмидной ДНК должна содержать точку начала репликации , позволяющую ей реплицироваться в клетке независимо от репликации собственной хромосомы клетки.

Эффективность, с которой компетентная культура может поглощать экзогенную ДНК и экспрессировать ее гены, известна как эффективность трансформации и измеряется в колониеобразующих единицах (КОЕ) на мкг использованной ДНК. Эффективность преобразования 1×10 8 КОЕ/мкг для небольшой плазмиды, такой как pUC19, примерно эквивалентно 1 из 2000 молекул используемой трансформируемой плазмиды.

При трансформации хлорида кальция клетки готовят путем охлаждения клеток в присутствии Ca. 2+
(в CaCl
2 раствор), благодаря чему клетка становится проницаемой для плазмидной ДНК . Клетки инкубируют с ДНК на льду, а затем подвергают кратковременному тепловому шоку (например, при 42°C в течение 30–120 секунд). Этот метод очень хорошо работает для кольцевой плазмидной ДНК. Некоммерческие препараты обычно должны давать 10 6 до 10 7 трансформанты на микрограмм плазмиды; плохая подготовка будет около 10 4 /мкг или меньше, но хороший препарат компетентных клеток может дать до ~10 8 колоний на микрограмм плазмиды. [60] Однако существуют протоколы создания суперкомпетентных клеток, которые могут обеспечить эффективность трансформации более 10 9 . [61] Однако химический метод обычно не работает для линейной ДНК, такой как фрагменты хромосомной ДНК, вероятно, потому, что нативные ферменты экзонуклеазы клетки быстро разрушают линейную ДНК. Напротив, клетки, обладающие природной компетентностью, обычно более эффективно трансформируются линейной ДНК, чем плазмидной ДНК.

Эффективность трансформации с использованием CaCl
2 уменьшается с увеличением размера плазмиды, и поэтому электропорация может быть более эффективным методом поглощения большой плазмидной ДНК. [62] Клетки, используемые для электропорации, следует сначала подготовить путем промывания в холодной бидистиллированной воде для удаления заряженных частиц, которые могут создавать искры во время процесса электропорации.

Селекция и скрининг при плазмидной трансформации

[ редактировать ]

Поскольку трансформация обычно приводит к смеси относительно небольшого количества трансформированных клеток и большого количества нетрансформированных клеток, необходим метод отбора клеток, которые приобрели плазмиду. [63] Поэтому плазмида требует селектируемого маркера , чтобы клетки без плазмиды могли быть убиты или их рост был остановлен. Устойчивость к антибиотикам является наиболее часто используемым маркером прокариот. Трансформирующая плазмида содержит ген, придающий устойчивость к антибиотику, к которому в противном случае бактерии чувствительны. Смесь обработанных клеток культивируют на средах, содержащих антибиотик, так что только трансформированные клетки могут расти. Другой метод отбора — использование определенных ауксотрофных маркеров, которые могут компенсировать неспособность метаболизировать определенные аминокислоты, нуклеотиды или сахара. Этот метод требует использования соответствующим образом мутированных штаммов, у которых отсутствует синтез или полезность конкретной биомолекулы, а трансформированные клетки культивируют в среде, которая позволяет расти только клеткам, содержащим плазмиду.

В эксперименте по клонированию ген может быть вставлен в плазмиду, используемую для трансформации. Однако в таком эксперименте не все плазмиды могут содержать успешно вставленный ген. Поэтому можно дополнительно использовать дополнительные методы для скрининга трансформированных клеток, содержащих плазмиду со вставкой. Репортерные гены могут использоваться в качестве маркеров , например ген lacZ , который кодирует β-галактозидазу, используемую в сине-белом скрининге . Этот метод скрининга основан на принципе α- комплементации , при котором фрагмент гена lacZ ( lacZα ) в плазмиде может комплементировать другой мутантный lacZ ген ( lacZΔM15 ) в клетке. Оба гена сами по себе продуцируют нефункциональные пептиды, однако при совместной экспрессии, например, когда плазмида, содержащая lacZ-α , трансформируется в клетки lacZΔM15 , они образуют функциональную β-галактозидазу. Присутствие активной β-галактозидазы можно обнаружить при выращивании клеток на чашках, содержащих X-gal , с образованием характерных синих колоний. Однако сайт множественного клонирования , где интересующий ген может быть лигирован в плазмидный вектор , расположен внутри гена lacZα . Таким образом, успешное лигирование разрушает ген lacZα , и функциональная β-галактозидаза не может образовываться, что приводит к образованию белых колоний. Клетки, содержащие успешно лигированную вставку, можно легко отличить по белому цвету от неудачно лигированных синих.

Другими часто используемыми репортерными генами являются зеленый флуоресцентный белок (GFP), который производит клетки, светящиеся зеленым под синим светом, и фермент люцифераза , который катализирует реакцию с люциферином для излучения света. Рекомбинантную ДНК также можно обнаружить с помощью других методов, таких как гибридизация нуклеиновой кислоты с радиоактивным зондом РНК, тогда как клетки, экспрессирующие желаемый белок из плазмиды, также можно обнаружить с помощью иммунологических методов.

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Jump up to: а б с д и ж г час Джонстон С., Мартин Б., Фичант Г., Полард П., Клаверис Дж. П. (март 2014 г.). «Бактериальная трансформация: распространение, общие механизмы и дивергентный контроль». Обзоры природы. Микробиология . 12 (3): 181–96. дои : 10.1038/nrmicro3199 . ПМИД   24509783 . S2CID   23559881 .
  2. ^ Jump up to: а б Альбертс Б. , Джонсон А., Льюис Дж., Рафф М., Робертс К., Уолтер П. (2002). Молекулярная биология клетки . Нью-Йорк: Garland Science. п. Г:35. ISBN  978-0-8153-4072-0 .
  3. ^ Гриффит Ф (1928). «Значение типов пневмококков» . Журнал гигиены . 27 (2): 113–59. дои : 10.1017/s0022172400031879 . ПМК   2167760 . ПМИД   20474956 .
  4. ^ Кейс, Кристина; Функе, Берделл; Тортора, Джерард. Микробиология. Введение (десятое издание)
  5. ^ Ледерберг, Джошуа (1994). «Трансформация генетики с помощью ДНК: празднование годовщины ЭВЕРИ, МАКЛЕОДА и МАККАРТИ (1944) в анекдотических, исторических и критических комментариях по генетике » . Генетика . 136 (2): 423–6. дои : 10.1093/генетика/136.2.423 . ПМЦ   1205797 . ПМИД   8150273 .
  6. ^ Мандель М., Хига А. (октябрь 1970 г.). «Кальций-зависимая ДНК-инфекция бактериофага». Журнал молекулярной биологии . 53 (1): 159–62. дои : 10.1016/0022-2836(70)90051-3 . ПМИД   4922220 .
  7. ^ Коэн С.Н. , Чанг А.С., Сюй Л (август 1972 г.). «Нехромосомная устойчивость бактерий к антибиотикам: генетическая трансформация Escherichia coli с помощью ДНК R-фактора» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 69 (8): 2110–4. Бибкод : 1972PNAS...69.2110C . дои : 10.1073/pnas.69.8.2110 . ПМК   426879 . ПМИД   4559594 .
  8. ^ Ханахан Д. (июнь 1983 г.). «Исследования по трансформации Escherichia coli плазмидами». Журнал молекулярной биологии . 166 (4): 557–80. CiteSeerX   10.1.1.460.2021 . дои : 10.1016/S0022-2836(83)80284-8 . ПМИД   6345791 .
  9. ^ Вирт Р., Фризенеггер А., Фидлер С. (март 1989 г.). «Трансформация различных видов грамотрицательных бактерий, принадлежащих к 11 различным родам, методом электропорации». Молекулярная и общая генетика . 216 (1): 175–7. дои : 10.1007/BF00332248 . ПМИД   2659971 . S2CID   25214157 .
  10. ^ Пальмитер Р.Д., Бринстер Р.Л., Хаммер Р.Э., Трумбауэр М.Е., Розенфельд М.Г., Бирнберг Н.К., Эванс Р.М. (декабрь 1982 г.). «Резкий рост мышей, которые развиваются из яиц, которым микроинъецировали слитые гены металлотионеина и гормона роста» . Природа . 300 (5893): 611–5. Бибкод : 1982Natur.300..611P . дои : 10.1038/300611a0 . ПМЦ   4881848 . ПМИД   6958982 .
  11. ^ Нестер, Евгений. «Агробактерия: природный генный инженер (100 лет спустя)» . АПС . Американское фитопатологическое общество . Проверено 14 января 2011 г.
  12. ^ Замбриски П., Йоос Х., Дженетелло С., Лиманс Дж., Монтегю М.В., Шелл Дж. (1983). «Ти-плазмидный вектор для введения ДНК в растительные клетки без изменения их нормальной регенерационной способности» . Журнал ЭМБО . 2 (12): 2143–50. дои : 10.1002/j.1460-2075.1983.tb01715.x . ПМК   555426 . ПМИД   16453482 .
  13. ^ Питерс, Памела. «Растения-трансформеры – основные методы генной инженерии» . Доступ к совершенству . Проверено 28 января 2010 г.
  14. ^ «Биологи изобретают пистолет для стрельбы по клеткам ДНК» (PDF) . Корнеллские хроники . 14 мая 1987 г. с. 3.
  15. ^ Сэнфорд Дж.К., Кляйн Т.М., Вольф Э.Д., Аллен Н. (1987). «Доставка веществ в клетки и ткани с помощью процесса бомбардировки частиц». Журнал науки и технологий твердых частиц . 5 : 27–37. дои : 10.1080/02726358708904533 .
  16. ^ Кляйн Р.М., Вольф Э.Д., Ву Р., Сэнфорд Дж.К. (1992). «Высокоскоростные микроснаряды для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки. 1987». Биотехнология (Ридинг, Массачусетс) . 24 : 384–6. ПМИД   1422046 .
  17. ^ Jump up to: а б с Мишод Р.Э., Бернштейн Х., Недельку А.М. (май 2008 г.). «Адаптационное значение пола у микробных патогенов». Инфекция, генетика и эволюция . 8 (3): 267–85. Бибкод : 2008InfGE...8..267M . дои : 10.1016/j.meegid.2008.01.002 . ПМИД   18295550 .
  18. ^ Jump up to: а б Зейтц П., Блокеш М. (май 2013 г.). «Символы и регуляторные пути, участвующие в естественной компетентности и трансформации патогенных и экологических грамотрицательных бактерий» (PDF) . Обзоры микробиологии FEMS . 37 (3): 336–63. дои : 10.1111/j.1574-6976.2012.00353.x . ПМИД   22928673 .
  19. ^ Jump up to: а б с Джонсборг О., Эльдхольм В., Ховарштайн Л.С. (декабрь 2007 г.). «Естественная генетическая трансформация: распространенность, механизмы и функции» . Исследования в области микробиологии . 158 (10): 767–78. дои : 10.1016/j.resmic.2007.09.004 . ПМИД   17997281 .
  20. ^ Jump up to: а б Чен И, Дубнау Д (март 2004 г.). «Поглощение ДНК во время бактериальной трансформации». Обзоры природы. Микробиология . 2 (3): 241–9. дои : 10.1038/nrmicro844 . ПМИД   15083159 . S2CID   205499369 .
  21. ^ Лакс С., Гринберг Б., Нойбергер М. (июнь 1974 г.). «Роль дезоксирибонуклеазы в генетической трансформации Diplococcus pneumoniae» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 71 (6): 2305–9. Бибкод : 1974PNAS...71.2305L . дои : 10.1073/pnas.71.6.2305 . ПМЦ   388441 . ПМИД   4152205 .
  22. ^ Длинный компакт-диск, Тобиасон Д.М., Лацио, член парламента, Клайн К.А., Зайферт Х.С. (ноябрь 2003 г.). «Низкий уровень экспрессии пилина обеспечивает значительную способность к трансформации ДНК у Neisseria gonorrhoeae» . Инфекция и иммунитет . 71 (11): 6279–91. дои : 10.1128/iai.71.11.6279-6291.2003 . ПМК   219589 . ПМИД   14573647 .
  23. ^ Сиско К.Л., Смит Х.О. (февраль 1979 г.). «Поглощение последовательности ДНК при трансформации Haemophilus» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 76 (2): 972–6. Бибкод : 1979ПНАС...76..972С . дои : 10.1073/pnas.76.2.972 . ПМК   383110 . ПМИД   311478 .
  24. ^ Соломон Дж. М., Гроссман А. Д. (апрель 1996 г.). «Кто компетентен и когда: регулирование естественной генетической компетентности бактерий». Тенденции в генетике . 12 (4): 150–5. дои : 10.1016/0168-9525(96)10014-7 . ПМИД   8901420 .
  25. ^ Сайто Ю., Тагучи Х., Акамацу Т. (март 2006 г.). «Судьба трансформации бактериального генома после включения в компетентные клетки Bacillus subtilis: непрерывная длина включенной ДНК». Журнал бионауки и биоинженерии . 101 (3): 257–62. дои : 10.1263/jbb.101.257 . ПМИД   16716928 .
  26. ^ Сайто Ю., Тагучи Х., Акамацу Т. (апрель 2006 г.). «ДНК, попадающая в компетентные клетки Bacillus subtilis путем трансформации лизированных протопластов, представляет собой не оцДНК, а дцДНК». Журнал бионауки и биоинженерии . 101 (4): 334–9. дои : 10.1263/jbb.101.334 . ПМИД   16716942 .
  27. ^ Акамацу Т., Тагучи Х. (апрель 2001 г.). «Включение всей хромосомной ДНК в лизаты протопластов в компетентные клетки Bacillus subtilis» . Бионауки, биотехнологии и биохимия . 65 (4): 823–9. дои : 10.1271/bbb.65.823 . ПМИД   11388459 . S2CID   30118947 .
  28. ^ Гудгал С.Х., Херриотт Р.М. (июль 1961 г.). «Исследования по трансформации Hemophilus influenzae. I. Компетенция» . Журнал общей физиологии . 44 (6): 1201–27. дои : 10.1085/jgp.44.6.1201 . ПМК   2195138 . ПМИД   13707010 .
  29. ^ Аспирас М.Б., Эллен Р.П., Цвиткович Д.Г. (сентябрь 2004 г.). «ComX-активность Streptococcus mutans, растущих в биопленках». Письма FEMS по микробиологии . 238 (1): 167–74. doi : 10.1016/j.femsle.2004.07.032 (неактивен 19 февраля 2024 г.). ПМИД   15336418 . {{cite journal}}: CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на февраль 2024 г. ( ссылка )
  30. ^ Анагностопулос С., Спизизен Дж. (май 1961 г.). «Требования к трансформации в Bacillus Subtilis» . Журнал бактериологии . 81 (5): 741–6. дои : 10.1128/JB.81.5.741-746.1961 . ПМК   279084 . ПМИД   16561900 .
  31. ^ Ангелов, Ангел; Берген, Пол; Надлер, Флориан; Хорнбург, Филипп; Личев, Антони; Обелакер, Мария; Пахл, Фиона; Кастер, Бернхард; Либль, Вольфганг (10 февраля 2015 г.). «Новая естественная трансформация, зависящая от биогенеза Flp pilus» . Границы микробиологии . 6 : 84. дои : 10.3389/fmicb.2015.00084 . ПМЦ   4322843 . ПМИД   25713572 .
  32. ^ Личев, Антони; Ангелов, Ангел; Кукурулл, Иниго; Либль, Вольфганг (30 июля 2019 г.). «Аминокислоты как питательные факторы и (p)ppGpp как сигнал строгой реакции регулируют естественную трансформацию Micrococcus luteus» . Научные отчеты . 9 (1): 11030. Бибкод : 2019NatSR...911030L . дои : 10.1038/s41598-019-47423-x . ПМК   6667448 . ПМИД   31363120 .
  33. ^ Кин Э.К., Блисковский В.В., Малагон Ф., Бейкер Дж.Д., Принс Дж.С., Клаус Дж.С., Адья С.Л. (январь 2017 г.). «Новые бактериофаги-суперраспространители способствуют горизонтальному переносу генов путем трансформации» . мБио . 8 (1): e02115–16. дои : 10.1128/mBio.02115-16 . ПМК   5241400 . ПМИД   28096488 .
  34. ^ Клаверис Дж. П., Прюдом М., Мартин Б. (2006). «Индукция компетентных регулонов как общий ответ на стресс у грамположительных бактерий». Ежегодный обзор микробиологии . 60 : 451–75. дои : 10.1146/annurev.micro.60.080805.142139 . ПМИД   16771651 .
  35. ^ Мишод Р.Э., Войцеховский М.Ф., Хельцер М.А. (январь 1988 г.). «Репарация ДНК и эволюция трансформации бактерии Bacillus subtilis» . Генетика . 118 (1): 31–9. дои : 10.1093/генетика/118.1.31 . ПМЦ   1203263 . ПМИД   8608929 .
  36. ^ Дорер М.С., Феро Дж., Салама Н.Р. (июль 2010 г.). Бланке С.Р. (ред.). «Повреждение ДНК запускает генетический обмен у Helicobacter pylori» . ПЛОС Патогены . 6 (7): e1001026. дои : 10.1371/journal.ppat.1001026 . ПМЦ   2912397 . ПМИД   20686662 .
  37. ^ Jump up to: а б Шарпантье X, Кей Э, Шнайдер Д, Шуман ХА (март 2011 г.). «Антибиотики и УФ-излучение вызывают способность к естественной трансформации Legionella pneumophila» . Журнал бактериологии . 193 (5): 1114–21. дои : 10.1128/JB.01146-10 . ПМК   3067580 . ПМИД   21169481 .
  38. ^ Альбертини С., Четела А.А., Миллер Б., Мустер В., Пухадас Э., Штробель Р., Гокке Э. (июль 1995 г.). «Генотоксичность 17 гиразных и четырех ядов топоизомеразы II млекопитающих в прокариотических и эукариотических тест-системах». Мутагенез . 10 (4): 343–51. дои : 10.1093/mutage/10.4.343 . ПМИД   7476271 .
  39. ^ Уошберн Р.С., Готтесман М.Э. (январь 2011 г.). «Терминация транскрипции поддерживает целостность хромосом» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 108 (2): 792–7. Бибкод : 2011PNAS..108..792W . дои : 10.1073/pnas.1009564108 . ПМК   3021005 . ПМИД   21183718 .
  40. ^ Сакано К., Оикава С., Хасегава К., Каваниси С. (ноябрь 2001 г.). «Гидроксимочевина вызывает сайт-специфическое повреждение ДНК посредством образования перекиси водорода и оксида азота» . Японский журнал исследований рака . 92 (11): 1166–74. дои : 10.1111/j.1349-7006.2001.tb02136.x . ПМЦ   5926660 . ПМИД   11714440 .
  41. ^ Jump up to: а б Бернштейн Х., Бернштейн С., Мишод Р.Э. (2012). «Глава 1: Репарация ДНК как основная адаптивная функция пола у бактерий и эукариот» . Кимура С., Симидзу С. (ред.). Восстановление ДНК: новые исследования . Новая наука. Publ., Хауппож, Нью-Йорк, стр. 1–49. ISBN  978-1-62100-808-8 .
  42. ^ Мишод Р.Э., Бернштейн Х., Недельку А.М. (май 2008 г.). «Адаптивное значение пола у микробных патогенов» (PDF) . Инфекция, генетика и эволюция . 8 (3): 267–85. Бибкод : 2008InfGE...8..267M . дои : 10.1016/j.meegid.2008.01.002 . ПМИД   18295550 .
  43. ^ Донахью Р.А., Блум Ф.Р. (июль 1998 г.). «Трансформация большого объема с использованием химически компетентных клеток с высокой пропускной способностью» (PDF) . Фокус . Том. 20, нет. 2. С. 54–56. OCLC   12352630 . Архивировано из оригинала (PDF) 6 марта 2013 г. - через Invitrogen. [ ненадежный источник? ]
  44. ^ Jump up to: а б Шривастава С (2013). Генетика бактерий (PDF) . Индия: Спрингер-Верлаг . дои : 10.1007/978-81-322-1090-0 . ISBN  978-81-322-1089-4 . S2CID   35917467 .
  45. ^ Каваи С., Хашимото В., Мурата К. (1 ноября 2010 г.). «Трансформация Saccharomyces cerevisiae и других грибов: методы и возможный механизм» . Биоинженерные ошибки . 1 (6): 395–403. дои : 10.4161/bbug.1.6.13257 . ПМК   3056089 . ПМИД   21468206 .
  46. ^ Хиннен А., Хикс Дж. Б., Финк Г. Р. (апрель 1978 г.). «Превращение дрожжей» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 75 (4): 1929–33. Бибкод : 1978PNAS...75.1929H . дои : 10.1073/pnas.75.4.1929 . ПМЦ   392455 . ПМИД   347451 .
  47. ^ Ито Х., Фукуда Ю., Мурата К., Кимура А. (январь 1983 г.). «Трансформация интактных дрожжевых клеток, обработанных катионами щелочных металлов» . Журнал бактериологии . 153 (1): 163–8. дои : 10.1128/JB.153.1.163-168.1983 . ПМК   217353 . ПМИД   6336730 .
  48. ^ Гитц Р.Д., Вудс Р.А. (2002). «Трансформация дрожжей методом ацетата лития/одноцепочечной ДНК-носителя/полиэтиленгликоля». Руководство по генетике дрожжей, молекулярной и клеточной биологии - Часть B. Методы энзимологии. Том. 350. стр. 87–96. дои : 10.1016/S0076-6879(02)50957-5 . ISBN  9780121822538 . ПМИД   12073338 .
  49. ^ Гитц Р.Д., Шистл Р.Х., Виллемс А.Р., Вудс Р.А. (апрель 1995 г.). «Исследования по трансформации интактных дрожжевых клеток с помощью процедуры LiAc/SS-ДНК/ПЭГ». Дрожжи . 11 (4): 355–60. дои : 10.1002/да.320110408 . ПМИД   7785336 . S2CID   22611810 .
  50. ^ Шистль, Роберт Х.; Манивасакам, П.; Вудс, Робин А.; Гитцт, Р. Дэниел (1 августа 1993 г.). «Введение ДНК в дрожжи путем трансформации». Методы . 5 (2): 79–85. дои : 10.1006/meth.1993.1011 .
  51. ^ Спенсер, Ф.; Кетнер, Г.; Коннелли, К.; Хитер, П. (1 августа 1993 г.). «Целевое клонирование на основе рекомбинации и манипулирование большими сегментами ДНК дрожжей». Методы . 5 (2): 161–175. дои : 10.1006/meth.1993.1021 .
  52. ^ Костанцо MC, Fox TD (ноябрь 1988 г.). «Превращение дрожжей при перемешивании стеклянными шариками» . Генетика . 120 (3): 667–70. дои : 10.1093/генетика/120.3.667 . ПМК   1203545 . ПМИД   3066683 .
  53. ^ Домен Р.Дж., Штрассер А.В., Хёнер CB, Холленберг CP (октябрь 1991 г.). «Эффективная процедура трансформации, позволяющая долгосрочное хранение компетентных клеток различных родов дрожжей». Дрожжи . 7 (7): 691–2. дои : 10.1002/да.320070704 . ПМИД   1776359 . S2CID   7108750 .
  54. ^ Хаяма Ю., Фукуда Ю., Каваи С., Хашимото В., Мурата К. (2002). «Чрезвычайно простой, быстрый и высокоэффективный метод трансформации дрожжей Saccharomyces cerevisiae с использованием глутатиона и клеток ранней логарифмической фазы». Журнал бионауки и биоинженерии . 94 (2): 166–71. дои : 10.1016/s1389-1723(02)80138-4 . ПМИД   16233287 .
  55. ^ В.Сингх и Д.К.Джейн (2014). «Применение рекомбинантной ДНК». МКЦ БИОЛОГИЯ . Нагин Пракашан. п. 840.
  56. ^ Jump up to: а б с д и ж Поединок, Нидерланды; Блюм, Я. Б. (март 2018 г.). «Достижения, проблемы и перспективы генетической трансформации грибов». Цитология и генетика . 52 (2): 139–154. дои : 10.3103/S009545271802007X . ISSN   0095-4527 . S2CID   4561837 .
  57. ^ Чен, Чивэнь; Хэ, Я; Си, Лиян (2017 , ) Хэ Лия, Цзяо ; . 6–7): 375–381 doi : 10.1387 ijdb.160026lh ISSN   0214-6282 . /   . (
  58. ^ Вальс, Эмили (апрель 2016 г.). «Гриб CRISPR с отредактированным геном избегает регулирования США» . Природа . 532 (7599): 293. Бибкод : 2016Natur.532..293W . дои : 10.1038/nature.2016.19754 . ISSN   0028-0836 . ПМИД   27111611 .
  59. ^ Ривера, Ана Леонор; Маганья-Ортис, Денис; Гомес-Лим, Мигель; Фернандес, Франциско; Лоске, Ахим М. (июнь 2014 г.). «Физические методы генетической трансформации грибов и дрожжей». Обзоры физики жизни . 11 (2): 184–203. Бибкод : 2014PhLRv..11..184R . дои : 10.1016/j.plrev.2014.01.007 . ПМИД   24507729 .
  60. ^ Бактериальная трансформация. Архивировано 10 июня 2010 г. в Wayback Machine.
  61. ^ Иноуэ Х., Нодзима Х., Окаяма Х. (ноябрь 1990 г.). «Высокоэффективная трансформация Escherichia coli плазмидами». Джин . 96 (1): 23–8. дои : 10.1016/0378-1119(90)90336-П . ПМИД   2265755 .
  62. ^ Донахью Р.А., Блум Ф.Р. (сентябрь 1998 г.). «Эффективность трансформации E. coli , подвергнутой электропорации большой плазмидной ДНК» (PDF) . Фокус . 20 (3): 77–78. Архивировано из оригинала 3 сентября 2011 года. {{cite journal}}: CS1 maint: неподходящий URL ( ссылка )
  63. ^ Бирнбойм Х.К., Доли Дж. (ноябрь 1979 г.). «Процедура быстрой щелочной экстракции для скрининга рекомбинантной плазмидной ДНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 7 (6): 1513–23. дои : 10.1093/нар/7.6.1513 . ПМК   342324 . ПМИД   388356 .
[ редактировать ]
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Genetic_transformation&oldid=1230322463"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: f6967a043a29d0d9f75e9e8dc1319676__1719010560
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/f6/76/f6967a043a29d0d9f75e9e8dc1319676.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Genetic transformation - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)