Сине-белый экран
Сине -белый экран — это метод скрининга , который позволяет быстро и удобно обнаруживать рекомбинантные бактерии в векторов на основе экспериментах по молекулярному клонированию . Этот метод скрининга обычно проводится с использованием подходящего бактериального штамма , но также можно использовать и другие организмы, например дрожжи. ДНК трансформациилигируется в вектор . Затем вектор встраивают в компетентную клетку-хозяина, жизнеспособную для трансформации, которую затем выращивают в присутствии X-gal . Клетки, трансформированные векторами, содержащими рекомбинантную ДНК, будут давать белые колонии; клетки, трансформированные нерекомбинантными плазмидами (т.е. только вектором), растут в синие колонии.
Фон
[ редактировать ]Молекулярное клонирование — одна из наиболее часто используемых процедур в молекулярной биологии . Интересующий ген может быть вставлен в плазмидный вектор посредством лигирования , а затем плазмида трансформируется в Escherichia coli клетки . Однако не все плазмиды, трансформированные в клетки, могут содержать нужную генную вставку, и проверка каждой отдельной колонии на наличие вставки требует много времени. Таким образом, метод обнаружения вставки был бы полезен для того, чтобы сделать эту процедуру менее трудоемкой и трудоемкой. Одним из первых методов, разработанных для обнаружения вставки, является сине-белый скрининг, который позволяет идентифицировать успешные продукты реакций клонирования по цвету бактериальной колонии .
Метод основан на принципе α-комплементации гена β-галактозидазы . Этот феномен α-комплементации был впервые продемонстрирован в работе, проделанной Агнес Ульманн в лаборатории Франсуа Жакоба и Жака Моно , где было показано, что функция неактивной мутантной β-галактозидазы с удаленной последовательностью восстанавливается фрагментом β-галактозидазы. в котором та же самая последовательность, α-донорский пептид, все еще не повреждена. [1] Лэнгли и др. показали, что у мутантной нефункциональной β-галактозидазы отсутствует часть N-конца с удаленными остатками 11–41, но она может быть дополнена пептидом, образованным из остатков 3–90 β-галактозидазы. [2] Нитчатый фаг М13 , содержащий последовательность, кодирующую первые 145 аминокислот, был позже сконструирован Мессингом и соавт. , а α-комплементация с использованием вектора была продемонстрирована по образованию синих бляшек, когда клетки, содержащие неактивный белок, были инфицированы фагом и затем выращивались на чашках, содержащих X-гал. [3]
Серия векторов плазмидного клонирования pUC , разработанная Виейрой и Мессингом, была разработана на основе системы M13 и стала первыми плазмидами, созданными с использованием преимуществ этого метода скрининга. [4] В этом методе ДНК, лигированная в плазмиду, разрушает α-пептид и, следовательно, процесс комплементации, и функциональная β-галактозидаза не может образоваться. Таким образом, клетки, трансформированные плазмидой, содержащей вставку, образуют белые колонии, тогда как клетки, трансформированные плазмидой без вставки, образуют синие колонии; Таким образом, результат успешного лигирования можно легко определить по белой окраске клеток, образовавшихся из неудачных синих клеток. [5]
Молекулярный механизм
[ редактировать ]
β-галактозидаза представляет собой белок, кодируемый lacZ геном lac оперона , и он существует в виде гомотетрамера в активном состоянии. Однако у мутантной β-галактозидазы, полученной из штамма M15 E. coli , N-концевые остатки 11–41 удалены, и этот мутант, ω-пептид, не способен образовывать тетрамер и неактивен. Однако эта мутантная форма белка может полностью вернуться в свое активное тетрамерное состояние в присутствии N-концевого фрагмента белка, α-пептида. Восстановление функции мутантной β-галактозидазы с помощью α-пептида называется α-комплементацией.
В этом методе скрининга штамм-хозяин E. coli несет мутант с делецией lacZ ( lacZΔM15 ), который содержит ω-пептид, тогда как используемые плазмиды несут последовательность lacZα , которая кодирует первые 59 остатков β-галактозидазы, α-пептида. . Ни один из них не является функциональным сам по себе. Однако когда два пептида экспрессируются вместе, например, когда плазмида, содержащая последовательность lacZα , трансформируется в клетки lacZΔM15 , они образуют функциональный фермент β-галактозидазу .
Метод сине-белого скрининга разрушает этот процесс α-комплементации. Плазмида несет внутри последовательности lacZα внутренний сайт множественного клонирования (MCS). Этот MCS внутри последовательности lacZα может быть разрезан ферментами рестрикции, так что чужеродная ДНК может быть вставлена в ген lacZα , тем самым разрушая ген, продуцирующий α-пептид. Следовательно, в клетках, содержащих плазмиду со вставкой, не функциональная β-галактозидаза может образовываться .
Присутствие активной β-галактозидазы можно обнаружить с помощью X-gal , бесцветного аналога лактозы, который может расщепляться β-галактозидазой с образованием 5-бром-4-хлориндоксила, который затем спонтанно димеризуется и окисляется с образованием ярко-синий нерастворимый пигмент 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго. Это приводит к характерному синему цвету клеток, содержащих функциональную β-галактозидазу. Таким образом, синие колонии показывают, что они могут содержать вектор с непрерывной lacZα (следовательно, без вставки), тогда как белые колонии, где X-gal не гидролизован, указывают на наличие вставки в lacZα , которая нарушает образование активной β-галактозидазы. .
Рекомбинантные клоны можно дополнительно проанализировать путем выделения и очистки небольших количеств плазмидной ДНК из трансформированных колоний, а ферменты рестрикции можно использовать для разрезания клона и определения наличия в нем интересующего фрагмента. [6] Если необходимо секвенировать ДНК, плазмиды из колоний необходимо будет выделить в определенный момент, разрезая их с помощью ферментов рестрикции или проводя другие анализы.
Практические соображения
[ редактировать ]Правильный тип вектора и компетентные клетки являются важными факторами при планировании сине-белого экрана. Плазмида должна содержать lacZα , примерами таких плазмид являются pUC19 и pBluescript . Клетка E. coli должна содержать мутантный ген lacZ с удаленной последовательностью (т.е. lacZΔM15 ), и некоторыми из обычно используемых клеток с таким генотипом являются JM109, DH5α и XL1-Blue. Следует также понимать, что на lac-оперон влияет присутствие глюкозы. Белок EIIA Глк , который участвует в импорте глюкозы, отключает пермеазу лактозы, когда глюкоза транспортируется в клетку. Поэтому среда, используемая в чашках с агаром, не должна содержать глюкозу.
X-гал чувствителен к свету, поэтому его раствор и планшеты, содержащие X-гал, следует хранить в темноте. Изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ), который действует как индуктор lac- оперона , может использоваться в средах для усиления экспрессии LacZ.
X-gal — дорогой материал, поэтому были разработаны другие методы скрининга бактерий. GFP был разработан как альтернатива для скрининга бактерий. Эта концепция аналогична α-комплементации, при которой вставка ДНК может нарушить кодирующую последовательность внутри вектора и, таким образом, нарушить выработку GFP, что приведет к появлению нефлуоресцирующих бактерий. [7] Бактерии, имеющие рекомбинантные векторы (вектор + вставка), будут белыми и не экспрессируют белок GFP, тогда как нерекомбинантные (вектор) будут флуоресцировать под УФ-светом. GFP обычно используется в качестве репортерного гена, с помощью которого люди могут окончательно определить, несет ли клон ген, который анализируют исследователи. Иногда среда, в которой растут колонии, может влиять на результаты скрининга и давать ложноположительные результаты. [8] X-gal на среде может иногда разлагаться с образованием синего цвета, или GFP может потерять свою флуоресценцию из-за среды и может повлиять на возможности исследователей определять колонии с желаемыми рекомбинантными и те, которые ею не обладают. [9]
Недостатки
[ редактировать ]Некоторые белые колонии могут не содержать желаемую рекомбинантную плазмиду по ряду причин. Лигированная ДНК может быть неправильной или не лигированной должным образом, и некоторые линеаризованные вектора могут быть трансформированы, их концы «восстановлены» и лигированы вместе, так что LacZα не образуется и синие колонии не могут образовываться. Мутация также может привести к тому, что α-фрагмент не будет экспрессироваться. Колония, вообще не имеющая вектора, также будет выглядеть белой и иногда может выглядеть как сателлитная колония после того, как использованный антибиотик будет исчерпан. Также возможно, что синие колонии могут содержать вставку. Это происходит, когда вставка находится «в рамке» с геном LacZα и во вставке отсутствует STOP-кодон. Это может привести к экспрессии слитого белка, имеющего функциональный LacZα, если его структура не нарушена. Правильная рекомбинантная конструкция иногда может давать более светлые голубые колонии, что может затруднить ее идентификацию.
См. также
[ редактировать ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ульманн, А.; Джейкоб, Ф.; Моно, Дж. (1967). «Характеристика с помощью комплементации in vitro пептида, соответствующего операторно-проксимальному сегменту структурного гена бета-галактозидазы Escherichia coli». Журнал молекулярной биологии . 24 (2): 339–343. дои : 10.1016/0022-2836(67)90341-5 . ПМИД 5339877 .
- ^ Лэнгли, Кентукки; Вильярехо, MR; Фаулер, А.В.; Заменгоф, П.Дж.; Забин, И. (1975). «Молекулярные основы альфа-комплементации бета-галактозидазы» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 72 (4): 1254–1257. Бибкод : 1975PNAS...72.1254L . дои : 10.1073/pnas.72.4.1254 . ПМК 432510 . ПМИД 1093175 .
- ^ Мессинг, Дж.; Гроненборн, Б.; Мюллер-Хилл, Б.; Ганс Хопшнайдер, П. (1977). «Нитчатый колифаг M13 как средство клонирования: вставка HindII-фрагмента регуляторной области lac в репликативную форму M13 in vitro» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 74 (9): 3642–3646. Бибкод : 1977PNAS...74.3642M . дои : 10.1073/pnas.74.9.3642 . ПМК 431673 . ПМИД 333444 .
- ^ Виейра, Дж.; Мессинг, Дж. (1982). «Плазмиды pUC, система, полученная из M13mp7, для инсерционного мутагенеза и секвенирования с использованием синтетических универсальных праймеров». Джин . 19 (3): 259–268. дои : 10.1016/0378-1119(82)90015-4 . ПМИД 6295879 .
- ^ Джозеф Сэмбрук, Дэвид Рассел. «Глава 1». Молекулярное клонирование. Лабораторное пособие . Том. 1 (3-е изд.). п. 1.27. ISBN 978-0-87969-577-4 .
- ^ Дж., Нинфа, Александр (1998). Фундаментальные лабораторные подходы в области биохимии и биотехнологии . Баллоу, Дэвид П. Бетесда, Мэриленд: Fitzgerald Science Press. стр. 355–356. ISBN 1891786008 . ОСЛК 38325074 .
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Спельц, Элизабет Б.; Риган, Линн (июнь 2013 г.). «Белый и зеленый скрининг с круговым клонированием полимеразным расширением для простого и надежного клонирования» . Белковая наука . 22 (6): 859–864. дои : 10.1002/pro.2268 . ПМЦ 3690724 . ПМИД 23592493 .
- ^ Банерджи, Сампали; Кумар, Джитендра; Апте-Дешпанде, Анджали; Падманабхан, Шрирам (11 мая 2010 г.). «Новый прокариотический вектор для идентификации и отбора рекомбинантов: прямое использование вектора для исследований экспрессии в E. coli» . Заводы по производству микробных клеток . 9:30 . дои : 10.1186/1475-2859-9-30 . ISSN 1475-2859 . ПМЦ 2882348 . ПМИД 20459760 .
- ^ Банерджи, Сампали; Кумар, Джитендра; Апте-Дешпанде, Анджали; Падманабхан, Шрирам (11 мая 2010 г.). «Новый прокариотический вектор для идентификации и отбора рекомбинантов: прямое использование вектора для исследований экспрессии в E. coli» . Заводы по производству микробных клеток . 9:30 . дои : 10.1186/1475-2859-9-30 . ISSN 1475-2859 . ПМЦ 2882348 . ПМИД 20459760 .