Вектор (молекулярная биология)
При молекулярном клонировании вектором – обычно ДНК является любая частица (например, плазмиды , космиды , лямбда-фаги ), используемая в качестве носителя для искусственного переноса чужеродной нуклеиновой последовательности – в другую клетку , где она может быть реплицирована и/или экспрессирована . [1] Вектор, содержащий чужеродную ДНК, называется рекомбинантной ДНК . Четырьмя основными типами векторов являются плазмиды , вирусные векторы , космиды и искусственные хромосомы . Из них наиболее часто используемыми векторами являются плазмиды. [2] Общими для всех сконструированных векторов являются точка начала репликации , сайт мультиклонирования и селектируемый маркер .
Сам вектор обычно несет последовательность ДНК , состоящую из вставки (в данном случае трансгена ) и более крупной последовательности, которая служит «основой» вектора. Цель вектора, который передает генетическую информацию в другую клетку, обычно состоит в том, чтобы изолировать, размножить или экспрессировать вставку в клетке-мишени. Все векторы могут использоваться для клонирования и, следовательно, являются клонирующими векторами , но существуют также векторы, разработанные специально для клонирования, в то время как другие могут быть разработаны специально для других целей, таких как транскрипция и экспрессия белка. Векторы, разработанные специально для экспрессии трансгена в клетке-мишени, называются векторами экспрессии и обычно имеют промоторную последовательность, которая управляет экспрессией трансгена. Более простые векторы, называемые векторами транскрипции, способны только транскрибироваться, но не транслироваться: они могут реплицироваться в клетке-мишени, но не экспрессироваться, в отличие от векторов экспрессии. Векторы транскрипции используются для амплификации их вставки.
Манипуляции с ДНК обычно проводятся с векторами E.coli , которые содержат элементы, необходимые для их поддержания в E.coli . Однако векторы могут также содержать элементы, которые позволяют им сохраняться в другом организме, таком как дрожжи, клетки растений или млекопитающих, и эти векторы называются челночными векторами . Такие векторы содержат бактериальные или вирусные элементы, которые могут быть перенесены в небактериальный организм-хозяин, однако были разработаны и другие векторы, называемые внутригенными векторами, чтобы избежать переноса любого генетического материала от чужеродного вида. [3]
Введение вектора в клетку-мишень обычно называют трансформацией бактериальных клеток. [4] трансфекция эукариотических клеток, [5] хотя вставку вирусного вектора часто называют трансдукцией. [6]
Характеристики [ править ]
Плазмиды [ править ]
Плазмиды представляют собой двухцепочечные дополнительные хромосомные и, как правило, кольцевые последовательности ДНК, которые способны к репликации с использованием механизма репликации клетки-хозяина. [7] Плазмидные векторы минималистично состоят из точки начала репликации , которая обеспечивает полунезависимую репликацию плазмиды в хозяине. Плазмиды широко распространены у многих бактерий, например, у Escherichia coli , но также могут быть обнаружены у некоторых эукариот, например, у дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae . [8] Бактериальные плазмиды могут быть конъюгативными/трансмиссивными и неконъюгативными:
- конъюгативные - опосредуют перенос ДНК посредством конъюгации и поэтому быстро распространяются среди бактериальных клеток популяции; например, плазмида F, множество плазмид R и некоторые плазмиды col.
- неконъюгативные - не опосредуют ДНК посредством конъюгации, например, многие плазмиды R и col.
Плазмиды со специально созданными характеристиками обычно используются в лабораториях для целей клонирования . Эти плазмиды, как правило, неконъюгативны, но могут иметь множество других особенностей, в частности, « множественный сайт клонирования », где несколько сайтов расщепления ферментом рестрикции позволяют вставить трансгенную вставку. Бактерии, содержащие плазмиды, могут за часы генерировать миллионы копий вектора внутри бактерий, а амплифицированные векторы можно извлечь из бактерий для дальнейших манипуляций. Плазмиды могут использоваться конкретно в качестве векторов транскрипции, и такие плазмиды могут отсутствовать важные последовательности для экспрессии белка. Плазмиды, используемые для экспрессии белка, называемые векторами экспрессии , будут включать элементы для трансляции белка, такие как сайт связывания рибосомы , стартовые и стоп-кодоны .
Вирусные векторы [ править ]
Вирусные векторы представляют собой генно-инженерные вирусы, несущие модифицированную вирусную ДНК или РНК, которая стала неинфекционной, но все еще содержит вирусные промоторы и трансген, что позволяет транслировать трансген через вирусный промотор. Однако, поскольку вирусным векторам часто не хватает инфекционных последовательностей, для крупномасштабной трансфекции им требуются вирусы-помощники или упаковочные линии. Вирусные векторы часто конструируются так, чтобы навсегда включать вставку в геном хозяина и, таким образом, оставлять в геноме хозяина отдельные генетические маркеры после включения трансгена. Например, ретровирусы после вставки оставляют характерный образец ретровирусной интеграции , который можно обнаружить и указывает на то, что вирусный вектор включился в геном хозяина.
Искусственные хромосомы [ править ]
Искусственные хромосомы представляют собой искусственные хромосомы в контексте дрожжевых искусственных хромосом (YAC), бактериальных искусственных хромосом (BAC) или искусственных хромосом человека (HAC). Искусственная хромосома может нести гораздо больший фрагмент ДНК, чем другие векторы. [9] YAC и BAC могут нести фрагмент ДНК длиной до 300 000 нуклеотидов. Три структурные потребности искусственной хромосомы включают начало репликации, центромеру и концевые теломерные последовательности. [10]
Транскрипция [ править ]
Транскрипция клонированного гена является необходимым компонентом вектора, когда требуется экспрессия гена: один ген может быть амплифицирован посредством транскрипции для создания множества копий мРНК , матрицы, на которой белок может быть получен посредством трансляции. [11] Большее количество мРНК будет экспрессировать большее количество белка, и количество создаваемых копий мРНК зависит от промотора, используемого в векторе. [12] Экспрессия может быть конститутивной, что означает, что белок вырабатывается постоянно в фоновом режиме, или она может быть индуцируемой, при которой белок экспрессируется только при определенных условиях, например, когда добавляется химический индуктор. Эти два разных типа экспрессии зависят от типов используемых промотора и оператора .
Вирусные промоторы часто используются для конститутивной экспрессии в плазмидах и вирусных векторах, поскольку они обычно надежно обеспечивают постоянную транскрипцию во многих клеточных линиях и типах. [13] Индуцибельная экспрессия зависит от промоторов, которые реагируют на условия индукции: например, промотор вируса опухоли молочной железы мышей инициирует транскрипцию только после дексаметазона применения , а промотор теплового шока дрозофилы инициирует только после высоких температур.
Некоторые векторы предназначены только для транскрипции, например, для производства мРНК in vitro . Эти векторы называются векторами транскрипции. У них может отсутствовать последовательность, необходимая для полиаденилирования и терминации, поэтому их нельзя использовать для производства белка.
Выражение [ править ]
Векторы экспрессии производят белки посредством транскрипции вставки вектора с последующей трансляцией полученной мРНК . , поэтому для них требуется больше компонентов, чем для более простых векторов, предназначенных только для транскрипции Для экспрессии в разных организмах-хозяевах потребуются разные элементы, хотя они имеют схожие требования, например, промотор для инициации транскрипции, сайт связывания рибосом для инициации трансляции и сигналы терминации.
Вектор экспрессии прокариотов
- Промотор. Обычно используемые индуцибельные промоторы представляют собой промоторы, полученные из lac -оперона и промотора Т7 . Другие используемые сильные промоторы включают промотор Trp и Tac-Promoter , которые представляют собой гибрид промоторов Trp и Lac Operon.
- Сайт связывания рибосомы (RBS) - следует за промотором и способствует эффективной трансляции интересующего белка.
- Сайт инициации трансляции - последовательность Шайна-Дальгарно, заключенная в RBS, на 8 пар оснований выше стартового кодона AUG.
Вектор экспрессии эукариотов
Векторам экспрессии эукариот требуются последовательности, которые кодируют:
- Хвост полиаденилирования : создает хвост полиаденилирования на конце транскрибируемой пре-мРНК, который защищает мРНК от экзонуклеаз и обеспечивает терминацию транскрипции и трансляции: стабилизирует продукцию мРНК.
- Минимальная длина НТО : НТО содержат специфические характеристики, которые могут препятствовать транскрипции или трансляции, и, таким образом, самые короткие НТО или вообще не кодируются в оптимальных векторах экспрессии.
- Последовательность Козака : векторы должны кодировать последовательность Козака в мРНК, которая собирает рибосому для трансляции мРНК.
Особенности [ править ]
Современные искусственно созданные векторы содержат существенные компоненты, присутствующие во всех векторах, и могут содержать другие дополнительные функции, встречающиеся только в некоторых векторах:
- Начало репликации : необходимо для репликации и поддержания вектора в клетке-хозяине.
- Промотор : Промоторы используются для управления транскрипцией трансгена вектора, а также других генов вектора, таких как ген устойчивости к антибиотикам. Некоторым векторам клонирования не обязательно иметь промотор для клонированной вставки, но он является важным компонентом векторов экспрессии, позволяющим экспрессировать клонированный продукт.
- Сайт клонирования: это может быть сайт множественного клонирования или другие элементы, которые позволяют вставлять чужеродную ДНК в вектор посредством лигирования .
- Генетические маркеры . Генетические маркеры вирусных векторов позволяют подтвердить, что вектор интегрировался с геномной ДНК хозяина.
- Устойчивость к антибиотикам устойчивости к антибиотикам : векторы с открытыми рамками считывания позволяют выжить клеткам, которые поглотили вектор, в питательной среде, содержащей антибиотики, посредством селекции антибиотиков.
- Эпитоп : Некоторые векторы могут содержать последовательность конкретного эпитопа, который может быть включен в экспрессируемый белок. Это позволяет идентифицировать антитела к клеткам, экспрессирующим целевой белок.
- Репортерные гены . Некоторые векторы могут содержать репортерный ген, позволяющий идентифицировать плазмиду, содержащую вставленную последовательность ДНК. Примером является lacZ-α , который кодирует N-концевой фрагмент β-галактозидазы , фермента, расщепляющего галактозу . Сайт множественного клонирования расположен внутри lacZ-α , и вставка, успешно лигированная в вектор, нарушит последовательность гена, что приведет к неактивной β-галактозидазе. Клетки, содержащие вектор со вставкой, можно идентифицировать с помощью сине-белой селекции путем выращивания клеток в среде, содержащей аналог галактозы ( X-gal ). Клетки, экспрессирующие β-галактозидазу (поэтому не содержащие вставки), выглядят как синие колонии. Белые колонии будут выбраны как те, которые могут содержать вставку. Другие часто используемые репортеры включают зеленый флуоресцентный белок и люциферазу .
- Нацеливающая последовательность: векторы экспрессии могут включать кодирование нацеливающей последовательности в готовом белке, которая направляет экспрессируемый белок к определенной органелле в клетке или определенному месту, например, периплазматическом пространстве бактерий.
- Теги очистки белка . Некоторые векторы экспрессии включают белки или пептидные последовательности, что позволяет упростить очистку экспрессируемого белка. Примеры включают полигистидиновую метку , глутатион-S-трансферазу и мальтозосвязывающий белок . Некоторые из этих меток могут также обеспечивать повышенную растворимость целевого белка. Целевой белок слит с белковой меткой, но сайт расщепления протеазой, расположенный в области полипептидного линкера между белком и меткой, позволяет позднее удалить метку.
См. также [ править ]
- Плазмида
- Вирусный вектор
- Вектор клонирования
- Вектор выражения
- Гибридный вектор
- Миникруг
- Рекомбинантная ДНК
- Голая ДНК
- Вектор (эпидемиология) — организм, передающий болезнь.
- Искусственные хромосомы человека
- Дрожжевые искусственные хромосомы
- Бактериальные искусственные хромосомы
- ДНК-вакцинация
Ссылки [ править ]
- ^ «Вектор» . Genome.gov . Архивировано из оригинала 8 июля 2019 г. Проверено 16 апреля 2022 г.
- ^ Лодиш Х., Берк А., Зипурски С.Л., Мацудайра П., Балтимор Д., Дарнелл Дж. (2000). «Клонирование ДНК с помощью плазмидных векторов» . Молекулярно-клеточная биология (4-е изд.). Нью-Йорк: WH Freeman. Архивировано из оригинала 27 мая 2009 г. Проверено 11 апреля 2018 г.
- ^ Акваа Джи (16 августа 2012 г.). Основы генетики и селекции растений . John Wiley & Sons Inc. ISBN 978-1-118-31369-5 .
- ^ Джонстон С., Мартин Б., Фичант Г., Полард П., Клаверис Дж. П. (март 2014 г.). «Бактериальная трансформация: распространение, общие механизмы и дивергентный контроль». Обзоры природы. Микробиология . 12 (3): 181–96. дои : 10.1038/nrmicro3199 . ПМИД 24509783 . S2CID 23559881 .
- ^ «MeSH-браузер» . meshb.nlm.nih.gov . Архивировано из оригинала 17 апреля 2018 г. Проверено 16 апреля 2018 г.
- ^ Хартл Д.Л., Джонс Э.В. (1998). Генетика: принципы и анализ (4-е изд.). Садбери, Массачусетс: Издательство Jones and Bartlett. ISBN 978-0-7637-0489-6 . ОСЛК 45730915 .
- ^ дель Солар, Глория; Хиральдо, Рафаэль; Руис-Эчеваррия, Мария Хесус; Эспиноза, Мануэль; Диас-Орехас, Рамон (июнь 1998 г.). «Репликация и контроль кольцевых бактериальных плазмид» . Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 62 (2): 434–464. дои : 10.1128/MMBR.62.2.434-464.1998 . ISSN 1092-2172 . ПМК 98921 . ПМИД 9618448 .
- ^ Браун Т.А. (2010). «Глава 2. Векторы для клонирования генов: плазмиды и бактериофаги» . Клонирование генов и анализ ДНК: Введение (6-е изд.). Уайли-Блэквелл. ISBN 978-1-4051-8173-0 . Архивировано из оригинала 17 декабря 2022 г. Проверено 7 ноября 2016 г.
- ^ Джулин, Дуглас (2014). «Искусственные хромосомы». Молекулярные науки о жизни . Спрингер, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. стр. 1–3. дои : 10.1007/978-1-4614-6436-5_91-3 . ISBN 978-1-4614-6436-5 .
- ^ Мюррей, Эндрю; Шостак, Джек (ноябрь 1987 г.). «Искусственные хромосомы». Научный американец . 257 (5): 62–68. Бибкод : 1987SciAm.257e..62M . doi : 10.1038/scientificamerican1187-62 . ПМИД 3317814 .
- ^ Соломон Э.П., Берг Л.Р., Мартин Д.В. (2005). Биология (8-е изд.). Бельмонт, Калифорния: Обучение Брукса/Коула Томсона. ISBN 978-0-495-31714-2 . OCLC 123008833 .
- ^ Дамдиндорж Л., Карнан С., Ота А., Хоссейн Э., Кониси Ю., Хосокава Ю., Кониси Х. (29 августа 2014 г.). «Сравнительный анализ конститутивных промоторов, расположенных в аденоассоциированных вирусных векторах» . ПЛОС ОДИН . 9 (8): e106472. Бибкод : 2014PLoSO...9j6472D . дои : 10.1371/journal.pone.0106472 . ПМЦ 4149579 . ПМИД 25170953 .
- ^ Левин А., Майер М., Хусаинов Дж., Джейкоб Д., Аппель Б. (июнь 2005 г.). «Вирусные промоторы могут инициировать экспрессию генов токсинов, введенных в Escherichia coli» . БМК Биотехнология . 5:19 . дои : 10.1186/1472-6750-5-19 . ПМК 1181807 . ПМИД 15967027 .
Дальнейшее чтение [ править ]
- Фрешни И.Р. (29 июля 2005 г.). Культура клеток животных: Руководство по базовой технике . John Wiley & Sons, Inc. Хобокен, Нью-Джерси: ISBN 978-0-471-45329-1 .
Внешние ссылки [ править ]
- Введение ученых Ваксмана в векторы. Архивировано 18 января 2008 г. в Wayback Machine.
- Сравнение векторов, используемых для клинического переноса генов
- Блок транспорта генов. Архивировано 6 декабря 2007 г. в Wayback Machine.
