Вставка (молекулярная биология)
В молекулярной биологии вставка — это часть ДНК , которая вставляется в более крупный вектор ДНК с помощью метода рекомбинантной ДНК , такого как лигирование или рекомбинация . Это позволяет его размножать, отбирать, в дальнейшем манипулировать или экспрессировать в организме-хозяине . [1]
Вставки могут варьироваться от физических добавлений нуклеотидов с использованием технологической системы или добавления искусственных структур в молекулу с помощью мутагенных химикатов, таких как бромид этидия или кристаллы.
Вставки в геном организма обычно происходят по естественным причинам. К этим причинам относятся условия окружающей среды и внутриклеточные процессы. Экологические вставки варьируются от воздействия радиоактивного излучения, такого как ультрафиолет , мутагенных химикатов или ДНК-вирусов . Внутриклеточные вставки могут возникать вследствие наследственных изменений в родительских клетках или ошибок репликации или репарации ДНК .
Методы вставки генов могут использоваться для характерных мутаций в организме для желаемой фенотипической экспрессии генов . Изменение вставки гена может выражаться в большом количестве концов. Эти варианты могут варьироваться от потери или усиления функции белка до изменений физической структуры, то есть цвета волос или глаз. Цель изменений в экспрессии направлена на усиление функции белков по регуляции. [2] или прекращению клеточной функции для предотвращения заболевания. [3] Результаты вариаций зависят от места в геноме, в котором находится добавление или мутация. Цель состоит в том, чтобы изучить, понять и, возможно, предсказать экспрессию генетического материала в организмах с помощью физического и химического анализа. Чтобы увидеть результаты генетических мутаций или вставок, помощью таких методов, как секвенирование ДНК , гель-электрофорез , иммуноанализ или микроскопия можно наблюдать с мутацию .
История
[ редактировать ]Эта область значительно расширилась с момента публикации в 1973 году биохимиков Стэнли Н. Коэна и Герберта В. Бойера, когда они использовали бактерии E. coli , чтобы научиться разрезать фрагменты, соединять разные фрагменты и вставлять новые гены. [4] С тех пор эта область значительно расширилась с точки зрения точности и достоверности. Компьютеры и технологии технологически облегчили сокращение ошибок и расширили понимание в этой области. Компьютеры, обладающие высокой способностью обработки данных и вычислений, которые сделали осязаемой обработку больших объемов информации, то есть использование ChIP и последовательности генов .
Методы и протоколы
[ редактировать ]Репарация, направленная на гомологию (HDR), — это метод восстановления разрывов или повреждений в молекулах ДНК. Наиболее распространенным методом добавления вставок к желаемым последовательностям является использование гомологичной рекомбинации. [5] У этого метода есть особое требование: вставку можно добавлять только после того, как она была введена в ядро клетки, а в геном ее можно добавлять в основном во время фаз G2 и S клеточного цикла . [6]
Редактирование генов CRISPR
[ редактировать ]Редактирование генов CRISPR на основе кластеризованных коротких палиндромных повторов с регулярными интервалами (CRISPR). Cas9 представляет собой фермент, который использует последовательности генов. [7] чтобы помочь контролировать, расщеплять и разделять определенные последовательности ДНК, которые комплементарны последовательности CRISPR. [8] [9] Эти последовательности и ферменты первоначально были получены из бактериофагов. [10] Важность этого метода в области генной инженерии заключается в том, что он дает возможность высокоточного целевого редактирования генов, а стоимость этого метода низка по сравнению с другими инструментами. [11] [12] [13] Возможность вставлять последовательности ДНК в организм является простой и быстрой, хотя она может столкнуться с проблемами экспрессии в более сложных организмах. [14] [15]
Эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции
[ редактировать ]Эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции , TALEN, представляет собой набор ферментов рестрикции, которые создаются для вырезания желаемых последовательностей ДНК. [16] Эти ферменты чаще всего используются в сочетании с CRISPR-CAS9, нуклеазой цинковых пальцев или HDR. Основная причина этого — способность этих ферментов с точностью разрезать и разделять нужную последовательность внутри гена.
Нуклеаза цинковых пальцев
[ редактировать ]Нуклеазы с цинковыми пальцами представляют собой генно-инженерные ферменты, которые объединяют с цинковыми пальцами ДНК-связывающий домен с доменом, расщепляющим ДНК . Их также комбинируют с CRISPR-CAS9 или TALEN для получения специфического добавления или удаления в геноме более сложных клеток и организмов. [17]
Генный пистолет
[ редактировать ]Генная пушка , также известная как система доставки биолистических частиц, используется для доставки трансгенов, белков или РНК в клетку. В нем используется система доставки микроснарядов, которая с высокой скоростью выстреливает в клетки покрытые частицы типичного тяжелого металла, имеющего интересующую ДНК. Генетический материал проникнет в клетку и доставит ее содержимое на определенную территорию. Использование систем доставки микроснарядов — это метод, известный как биолистический. [18]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ «вставка — Терминология молекулярной биологии для вставки — GenScript» . www.genscript.com . Проверено 22 октября 2017 г.
- ^ Хане Дж. К., Лампис А., Валери Н. (февраль 2021 г.). «РНК-хранилище: скрытые жемчужины в регуляции РНК и белков» . Клеточные и молекулярные науки о жизни . 78 (4): 1487–1499. дои : 10.1007/s00018-020-03675-9 . ПМК 7904556 . ПМИД 33063126 .
- ^ Левин Б., Кремер Г. (январь 2019 г.). «Биологические функции генов аутофагии: взгляд на болезнь» . Клетка . 176 (1–2): 11–42. дои : 10.1016/j.cell.2018.09.048 . ПМК 6347410 . ПМИД 30633901 .
- ^ «Герберт В. Бойер и Стэнли Н. Коэн» . Институт истории науки . 01.06.2016 . Проверено 19 апреля 2021 г.
- ^ Мальзан А., Лоудер Л., Ци Ю (24 апреля 2017 г.). «Редактирование генома растений с помощью TALEN и CRISPR» . Клетка и биологические науки . 7 (1): 21. дои : 10.1186/s13578-017-0148-4 . ПМЦ 5404292 . ПМИД 28451378 .
- ^ Прилл К., Доусон Дж. Ф. (2020). «Ремонт, направленный на гомологию, у рыбок данио: колдовство и волшебство?» . Границы молекулярной биологии . 7 : 595474. doi : 10.3389/fmolb.2020.595474 . ПМЦ 7793982 . ПМИД 33425990 .
- ^ Мохика Ф.Д., Родригес-Валера Ф. (сентябрь 2016 г.). «Открытие CRISPR у архей и бактерий». Журнал ФЭБС . 283 (17): 3162–9. дои : 10.1111/февраль 13766 . hdl : 10045/57676 . ПМИД 27234458 . S2CID 42827598 .
- ^ Баррангу Р. (февраль 2015 г.). «Роль систем CRISPR-Cas в адаптивном иммунитете и не только». Современное мнение в иммунологии . 32 : 36–41. дои : 10.1016/j.coi.2014.12.008 . ПМИД 25574773 .
- ^ О, Дж. Х., ван Пейкерен Дж. П. (29 сентября 2014 г.). «Рекомбинация Lactobacillus reuteri с помощью CRISPR-Cas9» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (17): е131. дои : 10.1093/nar/gku623 . ПМК 4176153 . ПМИД 25074379 .
- ^ Ишино Ю., Крупович М., Фортер П. (апрель 2018 г.). Марголин В. (ред.). «История CRISPR-Cas от встречи с загадочной повторяющейся последовательностью до технологии редактирования генома» . Журнал бактериологии . 200 (7): e00580–17, /jb/200/7/e00580–17.atom. дои : 10.1128/JB.00580-17 . ПМЦ 5847661 . ПМИД 29358495 .
- ^ Эбрахими В., Хашеми А. (август 2020 г.). «Проблемы редактирования генома in vitro с помощью CRISPR/Cas9 и возможные решения: обзор». Джин . 753 : 144813. doi : 10.1016/j.gene.2020.144813 . ПМИД 32470504 . S2CID 219103770 .
- ^ Эйрд Э.Дж., Ловендал К.Н., Сент-Мартин А., Харрис Р.С., Гордон В.Р. (31 мая 2018 г.). «Повышение эффективности репарации, опосредованной Cas9, путем ковалентного связывания матрицы репарации ДНК» . Коммуникационная биология . 1 (1): 54. дои : 10.1038/s42003-018-0054-2 . ПМК 6123678 . ПМИД 30271937 .
- ^ Маганти Х.Б., Бейли А.Дж., Киркхэм А.М., Шорр Р., Пино Н., Аллан Д.С. (март 2021 г.). «Сохранение гена CRISPR/Cas9, отредактированного гемопоэтическими стволовыми клетками после трансплантации: систематический обзор и метаанализ доклинических исследований» . Трансляционная медицина стволовых клеток . 10 (7): 996–1007. дои : 10.1002/sctm.20-0520 . ПМЦ 8235122 . PMID 33666363 .
- ^ Би Х., Фей К., Ли Р., Лю Б., Ся Р., Чар С.Н. и др. (июль 2020 г.). «Нарушение последовательностей микроРНК с помощью TALEN и CRISPR/Cas9 индуцирует производство микроРНК разной продолжительности» . Журнал биотехнологии растений . 18 (7): 1526–1536. дои : 10.1111/pbi.13315 . ПМЦ 7292542 . ПМИД 31821678 .
- ^ Шарпантье Э., Марраффини, Лос-Анджелес (июнь 2014 г.). «Использование иммунитета CRISPR-Cas9 для генной инженерии» . Современное мнение в микробиологии . 19 : 114–119. дои : 10.1016/j.mib.2014.07.001 . ПМЦ 4155128 . ПМИД 25048165 .
- ^ Бох Дж. (февраль 2011 г.). «СКАЗКИ о нацеливании на геном». Природная биотехнология . 29 (2): 135–6. дои : 10.1038/nbt.1767 . ПМИД 21301438 . S2CID 304571 .
- ^ Мэдер М.Л., Тибодо-Беганни С., Осиак А., Райт Д.А., Энтони Р.М., Эйхтингер М. и др. (июль 2008 г.). «Быстрая разработка с открытым исходным кодом индивидуальных нуклеаз с цинковыми пальцами для высокоэффективной модификации генов» . Молекулярная клетка . 31 (2): 294–301. doi : 10.1016/j.molcel.2008.06.016 . ПМЦ 2535758 . ПМИД 18657511 .
- ^ О'Брайен Дж. А., Ламмис СК (июнь 2011 г.). «Нанобиолистика: метод биолистической трансфекции клеток и тканей с использованием генной пушки с новыми снарядами нанометрового размера» . БМК Биотехнология . 11 (1): 66. дои : 10.1186/1472-6750-11-66 . ПМК 3144454 . ПМИД 21663596 .