Tac-Промоутер
Tac -промотор (сокращенно Ptac ), или вектор tac, представляет собой синтетически полученный промотор ДНК , полученный из комбинации промоторов оперонов trp и lac . [1] Он обычно используется для производства белка в Escherichia coli . [2]
два гибридных промотора, функциональных в Escherichia coli Были сконструированы . Эти гибридные промоторы tacI и tacII были получены из последовательностей промоторов trp и lac UV5. В первом гибридном промоторе (tacI) ДНК выше положения –20 относительно сайта начала транскрипции была получена из промотора trp. ДНК после положения –20 была получена из промотора lac UV5. Во втором гибридном промоторе (tacII) ДНК выше положения –11 в сайте Hpa I внутри бокса Прибнова происходит от промотора trp. ДНК после позиции –11 представляет собой синтетический фрагмент ДНК из 46 пар оснований, который определяет часть гибридного бокса Прибнова и весь оператор lac. Он также определяет последовательность Шайна-Дальгарно, фланкированную двумя уникальными сайтами рестрикции (переносимая последовательность Шайна-Дальгарно).
Промоторы tacI и tacII соответственно направляют транскрипцию примерно в 11 и 7 раз эффективнее, чем дерепрессированный родительский промотор lac UV5, и примерно в 3 и 2 раза эффективнее, чем промотор trp в отсутствие репрессора trp. Оба гибридных промотора могут быть репрессированы lac-репрессором, и оба могут быть дерепрессированы изопропил-бета-D-тиогалактозидом. Следовательно, эти гибридные промоторы полезны для контролируемой экспрессии чужеродных генов на высоких уровнях в E. coli. В отличие от промоторов trp и lac UV5, промотор tacI имеет не только консенсусную последовательность –35, но и консенсусную последовательность Pribnow box . Это может объяснить более высокую эффективность этого гибридного промотора по отношению к любому из родительских промоторов. [1]
О
[ редактировать ]Промотор tac используется для контроля и повышения уровня экспрессии целевого гена, а также для сверхэкспрессии рекомбинантных белков . Промотор tac назван в честь двух промоторов, составляющих его последовательность: промотора « trp » и «lac » .
Бактериальные промоторы состоят из двух частей: региона «–35» и региона «–10» ( поле Прибнова ). Эти две области связывают сигма-фактор РНК -полимеразы , который затем инициирует транскрипцию нижестоящего гена. Промотор tac состоит из участка «-35» промотора trp и участка «-10» промотора lac (и отличается от родственного промотора trc на 1 п.о. [3] ). Таким образом, промотор tac индуцируется IPTG -1-тиогалактопиранозидом), в то же время обеспечивая более высокую максимальную экспрессию гена , (изопропил-β- D чем промоторы lac или trp. Это делает его пригодным для высокоэффективного производства рекомбинантного белка. [1] Сильная репрессия экспрессии в «выключенном» состоянии важна, поскольку чужеродные белки могут быть токсичными для клетки-хозяина.
Приложения
[ редактировать ]Промоутер tac находит различные применения. Промотор/оператор tac (получивший название PTAC ) является одной из наиболее широко используемых систем экспрессии. Ptac представляет собой сильный гибридный промотор, состоящий из области –35 промотора trp и области –10 промотора/оператора lacUV5. Экспрессия PTAC подавляется белком lacI. Лаки д аллель представляет собой мутацию промотора, которая увеличивает внутриклеточную концентрацию репрессора LacI, что приводит к сильной репрессии PTAC. Добавление индуктора IPTG инактивирует репрессор LacI. Таким образом, степень экспрессии PTAC пропорциональна концентрации добавленного IPTG: низкие концентрации IPTG приводят к относительно низкой экспрессии PTAC, а высокие концентрации IPTG приводят к высокой экспрессии PTAC. Варьируя концентрацию IPTG, количество генного продукта, клонированного ниже PTAC, можно варьировать на несколько порядков. [4] [ нужен лучший источник ] Например, система PTAC используется для экспрессии слитого белка в рамках экспрессии PMAL-C2X. [5] [ нужен лучший источник ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с де Бур, штат Ха; Комсток, LJ; Вассер, М. (1 января 1983 г.). «Промотор tac: функциональный гибрид, полученный из промоторов trp и lac» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 80 (1): 21–25. дои : 10.1073/pnas.80.1.21 . ISSN 0027-8424 . ПМЦ 393301 . ПМИД 6337371 .
- ^ Аманн, Эгон; Охс, Биргит; Абель, Карл-Йозеф (30 сентября 1988 г.). «Тщательно регулируемые векторы промотора tac, полезные для экспрессии неслитых и слитых белков в Escherichia coli ». Джин . 69 (2): 301–315. дои : 10.1016/0378-1119(88)90440-4 . ПМИД 3069586 .
- ^ Брозиус, Дж. (25 марта 1985 г.). «Расстояние между областями –10 и –35 в tac-промоторе. Влияние на его активность in vivo» . Журнал биологической химии . 260 (6): 3539–41. дои : 10.1016/S0021-9258(19)83655-4 . ПМИД 2579077 .
- ^ Стэнли Малой, профессор, декан Колледжа наук, заместитель директора Центра микробных наук, доктор философии. Калифорнийский университет в Ирвайне. [1]
- ^ Биолаборатории, Новая Англия. «Экспрессия мальтозосвязывающего белка | NEB» . www.neb.com . Проверено 26 февраля 2016 г.