✖


Jump to content

Производство белка

Эта статья о биотехнологическом методе. Информацию о естественных процессах в клетках см. в разделе « Экспрессия генов» .
Центральная догма, изображающая транскрипцию кода ДНК в код РНК и белков на втором этапе, охватывающем производство белка.
Центральная догма, изображающая транскрипцию кода ДНК в РНК код и белков на втором этапе, охватывающем производство белка.

Производство белка — это биотехнологический процесс создания определенного белка . Обычно этого достигают путем манипулирования экспрессией генов в организме таким образом, чтобы он экспрессировал большое количество рекомбинантного гена . Это включает транскрипцию рекомбинантной ДНК в информационную РНК ( мРНК ), трансляцию мРНК в полипептидные цепи, которые в конечном итоге сворачиваются в функциональные белки и могут быть направлены в определенные субклеточные или внеклеточные места. [1]

Системы производства белка (также известные как системы экспрессии ) используются в науках о жизни , биотехнологии и медицине . В исследованиях молекулярной биологии используются многочисленные белки и ферменты, многие из которых происходят из систем экспрессии; в частности, ДНК-полимераза для ПЦР , обратная транскриптаза для анализа РНК, эндонуклеазы рестрикции для клонирования и для создания белков, которые проверяются при поиске лекарств в качестве биологических мишеней или самих потенциальных лекарств. Существуют также важные применения систем экспрессии в промышленной ферментации , в частности, в производстве биофармацевтических препаратов, таких как человеческий инсулин , для лечения диабета и производства ферментов .

Системы производства белка

[ редактировать ]

Обычно используемые системы производства белка включают те, которые получены из бактерий , [2] [3] дрожжи , [4] [5] бакуловирус / насекомое , [6] млекопитающих , клетки [7] [8] и в последнее время нитчатые грибы, такие как Myceliophthora thermophila . [9] Когда биофармацевтические препараты производятся с использованием одной из этих систем, связанные с процессом примеси, называемые белками клеток-хозяев, также попадают в конечный продукт в следовых количествах. [10]

Клеточные системы

[ редактировать ]

Самые старые и наиболее широко используемые системы экспрессии основаны на клетках и могут быть определены как « комбинация вектора экспрессии , его клонированной ДНК и хозяина для вектора, которая обеспечивает контекст, позволяющий функционировать чужеродному гену в клетке-хозяине, что то есть производить белки на высоком уровне ». [11] [12] Сверхэкспрессия — это аномально и чрезмерно высокий уровень экспрессии генов , связанному с геном , который приводит к выраженному фенотипу . [13] [14] [ нужны разъяснения ]

Существует множество способов введения чужеродной ДНК в клетку для экспрессии, и для экспрессии можно использовать множество различных клеток-хозяев — каждая система экспрессии имеет определенные преимущества и недостатки. Системы экспрессии обычно обозначаются хозяином и источником ДНК или механизмом доставки генетического материала. Например, обычными хозяевами являются бактерии (такие как E. coli , B. subtilis ), дрожжи (такие как S. cerevisiae). [5] ) или эукариотические клеточные линии . Обычными источниками ДНК и механизмами доставки являются вирусы (такие как бакуловирус , ретровирус , аденовирус ), плазмиды , искусственные хромосомы и бактериофаги (такие как лямбда ). Лучшая система экспрессии зависит от задействованного гена , например, Saccharomyces cerevisiae часто предпочтительнее для белков, требующих значительной посттрансляционной модификации . Линии клеток насекомых или млекопитающих используются, когда требуется сплайсинг мРНК, подобный человеческому. Тем не менее, бактериальная экспрессия имеет то преимущество, что позволяет легко производить большие количества белка, что необходимо для рентгеновской кристаллографии или экспериментов по ядерному магнитному резонансу для определения структуры.

Поскольку бактерии являются прокариотами , они не оснащены полным ферментативным механизмом для выполнения необходимых посттрансляционных модификаций или молекулярного сворачивания. Следовательно, мультидоменные эукариотические белки, экспрессируемые в бактериях, часто нефункциональны. Кроме того, многие белки становятся нерастворимыми в виде телец включения, которые трудно восстановить без жестких денатураторов и последующего трудоемкого рефолдинга белков.

Чтобы решить эти проблемы, были разработаны системы экспрессии с использованием нескольких эукариотических клеток для приложений, требующих, чтобы белки были конформированы, как в эукариотических организмах, или близки к ним: клетки растений (например, табака), насекомых или млекопитающих (например, крупного рогатого скота) трансфицируются генами и культивируют в суспензии и даже в виде тканей или целых организмов для получения полностью свернутых белков. у млекопитающих Однако системы экспрессии in vivo имеют низкий выход и другие ограничения (затраты времени, токсичность для клеток-хозяев и т. д.). Чтобы объединить высокую урожайность/продуктивность и масштабируемые белковые свойства бактерий и дрожжей, а также передовые эпигенетические особенности систем растений, насекомых и млекопитающих, разрабатываются другие системы производства белка с использованием одноклеточных эукариотов (т.е. непатогенных клеток Leishmania ).

Бактериальные системы

[ редактировать ]
кишечная палочка
[ редактировать ]
E. coli , один из самых популярных хозяев для искусственной экспрессии генов.

E. coli является одним из наиболее широко используемых хозяев экспрессии, и ДНК обычно вводят в плазмидный вектор экспрессии. Методы сверхэкспрессии в E. coli хорошо разработаны и работают за счет увеличения количества копий гена или увеличения силы связывания промоторной области, что способствует транскрипции. [3]

Например, последовательность ДНК интересующего белка может быть клонирована или субклонирована в плазмиду с высоким числом копий, содержащую промотор lac (часто LacUV5 ), которая затем трансформируется в бактерию E. coli . Добавление IPTG ( аналога лактозы ) активирует lac-промотор и заставляет бактерии экспрессировать интересующий белок. [2]

Штаммы E. coli BL21 и BL21(DE3) — это два штамма, обычно используемые для производства белка. Как представители линии B, у них отсутствуют протеазы lon и OmpT , защищающие продуцируемые белки от деградации. Профаг DE3, обнаруженный в BL21(DE3), обеспечивает РНК-полимеразу T7 (управляемую промотором LacUV5), что позволяет вместо этого использовать векторы с промотором T7. [15]

Коринебактерия
[ редактировать ]

Непатогенные виды грамположительных коринебактерий используются для коммерческого производства различных аминокислот. Вид C. Glutacumum широко используется для производства глутамата и лизина . [16] компоненты продуктов питания человека, кормов для животных и фармацевтических продуктов.

Экспрессия функционально активного эпидермального фактора роста человека была достигнута у C. glutamicum . [17] тем самым демонстрируя потенциал для промышленного производства человеческих белков. Экспрессированные белки могут быть нацелены на секрецию либо по общему секреторному пути (Sec), либо по пути транслокации двойного аргинина (Tat). [18]

В отличие от грамотрицательных бактерий , грамположительные Corynebacterium лишены липополисахаридов , которые действуют как антигенные эндотоксины у человека. [ нужна ссылка ]

Псевдомонада флюоресценс
[ редактировать ]

Непатогенные и грамотрицательные бактерии Pseudomonas fluorescens используются для получения высокого уровня рекомбинантных белков; обычно для разработки биотерапевтических препаратов и вакцин. P. fluorescens представляет собой метаболически универсальный организм, позволяющий проводить высокопроизводительный скрининг и быструю разработку сложных белков. P. fluorescens наиболее известен своей способностью быстро и успешно производить высокие титры активного растворимого белка. [19]

Эукариотические системы

[ редактировать ]
Дрожжи
[ редактировать ]

Системы экспрессии с использованием S. cerevisiae или Pichia Pastoris обеспечивают стабильное и длительное производство белков, которые обрабатываются аналогично клеткам млекопитающих, с высоким выходом в химически определенной среде белков. [4] [5]

Нитчатые грибы
[ редактировать ]

Нитчатые грибы, особенно Aspergillus и Trichoderma , издавна используются для получения разнообразных промышленных ферментов из собственных геномов («нативные», «гомологичные») и из рекомбинантной ДНК («гетерологичные»). [9]

Совсем недавно Myceliophthora thermophila C1 была разработана в качестве платформы экспрессии для скрининга и производства нативных и гетерологичных белков. Система экспрессии C1 демонстрирует морфологию низкой вязкости в погруженной культуре, что позволяет использовать сложные среды для выращивания и продукции. C1 также не «гипергликозилирует» гетерологичные белки, как это Aspergillus и Trichoderma . обычно делают [9]

бакуловирусом Клетки, инфицированные
[ редактировать ]
См. также: БакМам

бакуловирусом Клетки насекомых, инфицированные [20] ( Sf9 , Sf21 , High Five ) или клетки млекопитающих. штаммы [21] ( HeLa , HEK 293 ) позволяют производить гликозилированные или мембранные белки, которые невозможно получить с помощью грибковых или бактериальных систем. [20] [6] Это полезно для производства белков в больших количествах. Гены не экспрессируются непрерывно, поскольку инфицированные клетки-хозяева в конечном итоге лизуются и умирают во время каждого цикла заражения. [22]

Нелитическая экспрессия клеток насекомых
[ редактировать ]

Нелитическая экспрессия клеток насекомых является альтернативой литической системе экспрессии бакуловируса. При нелитической экспрессии векторы временно или стабильно трансфицируются в хромосомную ДНК клеток насекомых для последующей экспрессии генов. [23] [24] За этим следует отбор и скрининг рекомбинантных клонов. [25] Нелитическая система использовалась для обеспечения более высокого выхода белка и более быстрой экспрессии рекомбинантных генов по сравнению с экспрессией клеток, инфицированных бакуловирусом. [24] Клеточные линии, используемые для этой системы, включают: Sf9 , Sf21 из клеток Spodoptera frugiperda , Hi-5 из клеток Trichoplusia ni , а также клетки Шнайдера 2 и клетки Шнайдера 3 из клеток Drosophila melanogaster . [23] [25] При использовании этой системы клетки не лизируются и можно использовать несколько режимов культивирования. [23] Кроме того, циклы производства белка воспроизводимы. [23] [24] Эта система дает однородный продукт. [24] Недостатком этой системы является необходимость проведения дополнительного этапа скрининга для отбора жизнеспособных клонов . [25]

Раскопки
[ редактировать ]

Системы экспрессии Leishmania tarentolae (не могут инфицировать млекопитающих) обеспечивают стабильное и длительное производство белков с высоким выходом в химически определенных средах. Продуцируемые белки демонстрируют полностью эукариотические посттрансляционные модификации, включая гликозилирование и образование дисульфидных связей. [ нужна ссылка ]

Системы млекопитающих
[ редактировать ]

Наиболее распространенными системами экспрессии у млекопитающих являются китайского хомячка клетки яичника (CHO) и клетки эмбриональной почки человека (HEK). [26] [27] [28]

Бесклеточные системы

[ редактировать ]

Бесклеточное производство белков осуществляется in vitro с использованием очищенной РНК-полимеразы, рибосом, тРНК и рибонуклеотидов. Эти реагенты могут быть получены экстракцией из клеток или из клеточной системы экспрессии. Из-за низкого уровня экспрессии и высокой стоимости бесклеточных систем более широко используются клеточные системы. [29]

См. также

[ редактировать ]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Грэслунд С., Нордлунд П., Вайгельт Дж., Холлберг Б.М., Брэй Дж., Гилеади О. и др. (февраль 2008 г.). «Производство и очистка белков» . Природные методы . 5 (2): 135–46. дои : 10.1038/nmeth.f.202 . ПМК   3178102 . ПМИД   18235434 .
  2. ^ Перейти обратно: а б Бэнейкс Ф (октябрь 1999 г.). «Экспрессия рекомбинантного белка в Escherichia coli». Современное мнение в области биотехнологии . 10 (5): 411–21. дои : 10.1016/s0958-1669(99)00003-8 . ПМИД   10508629 .
  3. ^ Перейти обратно: а б Розано, Герман; Чеккарелли, Эдуардо (17 апреля 2014 г.). «Экспрессия рекомбинантного белка в Escherichia coli: достижения и проблемы» . Границы микробиологии . 5 : 172. дои : 10.3389/fmicb.2014.00172 . ПМК   4029002 . ПМИД   24860555 .
  4. ^ Перейти обратно: а б Крегг Дж. М., Черегино Дж. Л., Ши Дж., Хиггинс Д. Р. (сентябрь 2000 г.). «Экспрессия рекомбинантного белка у Pichia Pastoris» . Молекулярная биотехнология . 16 (1): 23–52. дои : 10.1385/МБ:16:1:23 . ПМИД   11098467 . S2CID   35874864 .
  5. ^ Перейти обратно: а б с Малис Н., Уишарт Дж.А., Оливер С.Г., Маккарти Дж.Э. (2011). «Продуцирование белка в Saccharomyces cerevisiae для исследований системной биологии». Методы системной биологии . Методы энзимологии. Том. 500. стр. 197–212. дои : 10.1016/B978-0-12-385118-5.00011-6 . ISBN  9780123851185 . ПМИД   21943899 .
  6. ^ Перейти обратно: а б Кост Т.А., Кондри Дж.П., Джарвис Д.Л. (май 2005 г.). «Бакуловирус как универсальные векторы для экспрессии белков в клетках насекомых и млекопитающих» . Природная биотехнология . 23 (5): 567–75. дои : 10.1038/nbt1095 . ПМЦ   3610534 . ПМИД   15877075 .
  7. ^ Россер М.П., ​​Ся В., Хартселл С., Маккаман М., Чжу Ю., Ван С., Харви С., Брингманн П., Кобб Р.Р. (апрель 2005 г.). «Транзиторная трансфекция CHO-K1-S с использованием бессывороточной среды в суспензии: система быстрой экспрессии белков млекопитающих». Экспрессия и очистка белков . 40 (2): 237–43. дои : 10.1016/j.pep.2004.07.015 . ПМИД   15766864 .
  8. ^ Лакнер А., Гента К., Коппенштайнер Х., Хербачек И., Хольцманн К., Шпигл-Крейнекер С., Бергер В., Груш М. (сентябрь 2008 г.). «Бицистронный бакуловирусный вектор для временной и стабильной экспрессии белка в клетках млекопитающих». Аналитическая биохимия . 380 (1): 146–8. дои : 10.1016/j.ab.2008.05.020 . ПМИД   18541133 .
  9. ^ Перейти обратно: а б с Виссер Х., Йоостен В., Пунт П.Дж., Гусаков А.В., Олсон П.Т., Йостен Р. и др. (июнь 2011 г.). «Разработка зрелой грибковой технологии и платформы для производства промышленных ферментов на основе изолята Myceliophthora thermophila, ранее известного как Chrysosporium Lucnowense C1». Промышленная биотехнология . 7 (3): 214–223. дои : 10.1089/инд.2011.7.214 . Aspergillus и Trichoderma в настоящее время являются основными родами грибов, используемых для производства промышленных ферментов.
  10. ^ Ван, Син; Хантер, Алан К.; Мозье, Нед М. (15 июня 2009 г.). «Белки клеток-хозяев в разработке биологических препаратов: идентификация, количественный анализ и оценка риска» . Биотехнология и биоинженерия . 103 (3): 446–458. дои : 10.1002/бит.22304 . ISSN   0006-3592 . ПМИД   19388135 . S2CID   22707536 .
  11. ^ «Определение: система выражения» . Интернет-медицинский словарь . Центр онкологического образования, Университет Ньюкасла-апон-Тайн: Cancerweb. 13 ноября 1997 г. Проверено 10 июня 2008 г.
  12. ^ «Система выражения – определение» . Биология онлайн . Биология-Online.org. 03.10.2005 . Проверено 10 июня 2008 г.
  13. ^ «чрезмерная экспрессия» . Оксфордский живой словарь . Издательство Оксфордского университета. 2017. Архивировано из оригинала 10 февраля 2018 года . Проверено 18 мая 2017 г. Производство аномально большого количества вещества, кодируемого определенным геном или группой генов; появление в фенотипе в аномально высокой степени признака или эффекта, приписываемого определенному гену.
  14. ^ «сверхэкспрессировать» . Словарь терминов, посвященных раку, NCI . Национальный институт рака при Национальных институтах здравоохранения. 2 февраля 2011 г. Проверено 18 мая 2017 г. сверхэкспрессировать
    В биологии — создание слишком большого количества копий белка или другого вещества. Сверхэкспрессия определенных белков или других веществ может играть роль в развитии рака.
  15. ^ Чон, Х; Барбе, В; Ли, Швейцария; Валлене, Д; Ю, Д.С.; Чой, С.Х.; Кулу, А; Ли, Юго-Запад; Юн, Ш.; Каттолико, Л; Хур, КГ; Парк, HS; Сегуранс, Б; Ким, Южная Каролина; О, ТК; Ленский, Р.Э.; Стьюдер, ФРВ; Дэгелен, П; Ким, Дж. Ф. (11 декабря 2009 г.). «Последовательности генома штаммов Escherichia coli B REL606 и BL21 (DE3)». Журнал молекулярной биологии . 394 (4): 644–52. дои : 10.1016/j.jmb.2009.09.052 . ПМИД   19786035 .
  16. ^ Бринкрольф К., Шредер Дж., Пюлер А., Таух А. (сентябрь 2010 г.). «Регуляторный репертуар транскрипции Corynebacterium Glutamicum: реконструкция сети, контролирующей пути, участвующие в производстве лизина и глутамата». Журнал биотехнологии . 149 (3): 173–82. doi : 10.1016/j.jbiotec.2009.12.004 . ПМИД   19963020 .
  17. ^ Датэ М, Итая Х, Мацуи Х, Кикучи Ю (январь 2006 г.). «Секреция человеческого эпидермального фактора роста Corynebacterium glutamicum» . Письма по прикладной микробиологии . 42 (1): 66–70. дои : 10.1111/j.1472-765x.2005.01802.x . ПМИД   16411922 .
  18. ^ Мейснер Д., Фоллстедт А., ван Дийл Дж. М., Фрейдл Р. (сентябрь 2007 г.). «Сравнительный анализ твин-аргинин (Tat)-зависимой секреции белка гетерологичного модельного белка (GFP) у трех различных грамположительных бактерий». Прикладная микробиология и биотехнология . 76 (3): 633–42. дои : 10.1007/s00253-007-0934-8 . ПМИД   17453196 . S2CID   6238466 .
  19. ^ Реталлак Д.М., Джин Х., Чу Л. (февраль 2012 г.). «Надежное производство белка в системе экспрессии Pseudomonas fluorescens». Экспрессия и очистка белков . 81 (2): 157–65. дои : 10.1016/j.pep.2011.09.010 . ПМИД   21968453 .
  20. ^ Перейти обратно: а б Альтманн Ф., Штаудахер Э., Уилсон И.Б., Мерц Л. (февраль 1999 г.). «Клетки насекомых как хозяева для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов». Гликоконъюгатный журнал . 16 (2): 109–23. дои : 10.1023/А:1026488408951 . ПМИД   10612411 . S2CID   34863069 .
  21. ^ Кост Т.А., Кондри Дж.П. (октябрь 1999 г.). «Рекомбинантные бакуловирусы как векторы экспрессии для клеток насекомых и млекопитающих». Современное мнение в области биотехнологии . 10 (5): 428–33. дои : 10.1016/S0958-1669(99)00005-1 . ПМИД   10508635 .
  22. ^ Инь Дж., Ли Дж., Рен Х., Херрлер Дж. (январь 2007 г.). «Выберите то, что вам нужно: сравнительная оценка преимуществ и ограничений часто используемых систем экспрессии чужеродных генов». Журнал биотехнологии . 127 (3): 335–47. doi : 10.1016/j.jbiotec.2006.07.012 . ПМИД   16959350 .
  23. ^ Перейти обратно: а б с д Дайринг, Шарлотта (2011). «Оптимизация системы экспрессии S2 дрозофилы для производства терапевтических вакцин». Журнал биообработки . 10 (2): 28–35. doi : 10.12665/j102.dyring .
  24. ^ Перейти обратно: а б с д Ольчак М., Ольчак Т. (декабрь 2006 г.). «Сравнение различных сигнальных пептидов для секреции белков в нелитической системе клеток насекомых». Аналитическая биохимия . 359 (1): 45–53. дои : 10.1016/j.ab.2006.09.003 . ПМИД   17046707 .
  25. ^ Перейти обратно: а б с МакКэрролл Л., Кинг Лос-Анджелес (октябрь 1997 г.). «Стабильные культуры клеток насекомых для производства рекомбинантных белков». Современное мнение в области биотехнологии . 8 (5): 590–4. дои : 10.1016/s0958-1669(97)80034-1 . ПМИД   9353223 .
  26. ^ Перейти обратно: а б Чжу Дж (01 сентября 2012 г.). «Экспрессия белков клеток млекопитающих для биофармацевтического производства». Достижения биотехнологии . 30 (5): 1158–70. doi : 10.1016/j.biotechadv.2011.08.022 . ПМИД   21968146 .
  27. ^ Перейти обратно: а б с д Almo SC, Love JD (июнь 2014 г.). «Лучше и быстрее: улучшения и оптимизация производства рекомбинантных белков млекопитающих» . Современное мнение в области структурной биологии . Новые конструкции и экспрессия белков / Последовательности и топология. 26 : 39–43. дои : 10.1016/j.sbi.2014.03.006 . ПМЦ   4766836 . ПМИД   24721463 .
  28. ^ Хакер Д.Л., Баласубраманян С. (июнь 2016 г.). «Производство рекомбинантного белка из стабильных линий и пулов клеток млекопитающих». Современное мнение в области структурной биологии . Новые конструкции и экспрессия белков • Последовательности и топология. 38 : 129–36. дои : 10.1016/j.sbi.2016.06.005 . ПМИД   27322762 .
  29. ^ Розенблюм Г., Куперман Б.С. (январь 2014 г.). «Двигатель вне шасси: бесклеточный синтез белка и его применение» . Письма ФЭБС . 588 (2): 261–8. дои : 10.1016/j.febslet.2013.10.016 . ПМК   4133780 . ПМИД   24161673 .

Дальнейшее чтение

[ редактировать ]
[ редактировать ]
Ресурсы библиотеки о
Производство белка
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Protein_production&oldid=1238078601"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: d4284d4e0ea61f360af0049449e5a280__1722548040
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/d4/80/d4284d4e0ea61f360af0049449e5a280.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Protein production - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)