БакМам

в бакуловируса Перенос генов клетки млекопитающих (BacMam) – это использование бакуловируса для доставки генов в млекопитающих . клетки ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} Бакуловирусы — это вирусы насекомых, которые обычно не способны инфицировать клетки млекопитающих; однако их можно модифицировать для экспрессии белков в млекопитающих клетках . Немодифицированные бакуловирусы способны проникать в клетки млекопитающих; однако их гены не экспрессируются, если узнаваемый промотор млекопитающих не включен перед интересующим геном. И немодифицированный бакуловирус, и его модифицированный аналог не способны реплицироваться в организме человека , что делает их неинфекционными.

Перенос генов, опосредованный бакуловирусом, был разработан доктором Фредериком М. Бойсом. ^{[ 3 ]} Он получил широкое распространение благодаря определенным преимуществам по сравнению с другими методами трансфекции . ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]}^{[ 6 ]} Было обнаружено, что BacMam обладает некоторой стабильностью и гибкостью по сравнению с другими методами клеточных линий . ^{[ 7 ]} что способствовало его принятию в качестве стандартного метода переноса генов.

Общие свойства

Технология доставки генов BacMam представляет собой систему временной экспрессии, которая облегчает экспрессию генных продуктов. Он имеет широкий спектр трансдукции, включая многие типы первичных клеток и стволовые клетки . ^{[ 8 ]} Геном бакуловируса обладает большой способностью к вставке чужеродных генов: были успешно протестированы вставки длиной до 38 т.п.н. ^{[ 9 ]} Возможна одновременная доставка нескольких генов в одну и ту же клетку. ^{[ 10 ]} Цитопатические эффекты частиц BacMam на клетки млекопитающих практически отсутствуют или практически отсутствуют. ^{[ 11 ]} Уровень экспрессии генов можно регулировать дозой вируса или химическими добавками с использованием ингибиторов деацетилазы гистонов. ^{[ 12 ]} Трансдукция клеток выполняется путем добавления только жидкости, что делает BacMam поддающимся автоматизированным методам. Вирусы стабильны при хранении при температуре 4 °C в темноте в течение длительного периода времени. ^{[ 13 ]}

Соображения биобезопасности

Бакуловирусы представляют собой агенты группы риска 1 , которые уже более 25 лет широко используются для производства белков в клетках насекомых . ^{[ 14 ]} Бакуловирусы производятся в клетках насекомых и не способны к репликации в клетках млекопитающих, и неизвестно, что они вызывают заболевания у здоровых взрослых людей. Кроме того, вирусы BacMam инактивируются человеческим комплементом, что снижает риск для исследователей. Вирусы, используемые в лаборатории, не способны размножаться в насекомых, поэтому не существует никакой экологической угрозы, если эти частицы попадут в окружающую среду. ^{[ 15 ]}^{[ 16 ]}

Вирусная запись

Исследования проникновения бакуловируса в гепатоцеллюлярной карциномы клетки человека позволяют предположить, что BacMam проникает в клетки млекопитающих посредством клатрин-опосредованного эндоцитоза и, возможно, посредством микропиноцитоза . ^{[ 17 ]} Дальнейшие исследования показали, что кавеолы участвуют в проникновении бакуловируса в клетки млекопитающих. ^{[ 18 ]}

Ответ клетки-хозяина

Чтобы быть эффективной, технология доставки генов не должна мешать нормальному функционированию клеток. Анализы цитотоксичности человека и анализы транскриптома на клеточной линии HEK (HEK293) показали, что бакуловирусная трансдукция не является цитотоксичной и не индуцирует дифференциальные транскрипционные ответы. ^{[ 19 ]} Аналогичным образом, инфицированные шванновские клетки сохраняют свой характерный морфологический и молекулярный фенотип и способны дифференцироваться in vitro и экспрессировать маркер миелинизации P0 . Используя комплементарной ДНК технологию микрочипов (кДНК) для изучения in vitro и in vivo глобальных профилей клеточной экспрессии генов в мозге крысы, культивируемых астроцитах человека и нейрональных клетках человека после вирусной трансдукции, наблюдались противовирусные реакции хозяина. ^{[ 20 ]} Родственные гены в основном связаны с врожденным иммунитетом, включая несколько генов, участвующих в сигнальном пути Toll-подобного рецептора и взаимодействии цитокинов с цитокиновыми рецепторами.

Использование

Биопроизводство

BacMam использовался для производства белков в больших количествах с использованием клеток HEK293 в системе биореактора с полыми волокнами . ^{[ 21 ]}

Высокопроизводительный скрининг

Фармакологию рецептора, связанного с G-белком, можно изучать с использованием технологии BacMam при разработке лекарств . ^{[ 22 ]}

Флуоресцентная микроскопия

Реагенты для мечения органелл представляют собой коммерчески доступные частицы BacMam для мечения органелл и других субклеточных структур. ^{[ 23 ]} Мечение одиночной митохондрии зеленым флуоресцентным белком, нацеленным на митохондрии. ^{[ 24 ]}

Активация рецепторов/анализ путей

Была проведена характеристика активации рецептора серотонина посредством слияния GFP, доставляемого BacMam, с киназным субстратом. ^{[ 25 ]}

Структурная биология

Систему BacMam можно использовать для получения растворимых и мембранных гликопротеинов для структурных исследований. ^{[ 26 ]}

См. также

бакуловирус

Ссылки

^ Хофманн, К; Штраус, М. (1998). «Перенос генов, опосредованный бакуловирусом, в присутствии сыворотки или крови человека, облегченный ингибированием системы комплемента» . Генная терапия . 5 (4): 531–536. дои : 10.1038/sj.gt.3300607 . ПМИД 9614578 .
^ Бойс, FM; Бучер, Нидерланды (1996). «Перенос генов, опосредованный бакуловирусом, в клетки млекопитающих» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (6): 2348–52. Бибкод : 1996PNAS...93.2348B . дои : 10.1073/pnas.93.6.2348 . ПМК 39799 . ПМИД 8637876 .
^ Патент США № 5871986.
^ Кост, Т; Кондри, JP (2002). «Рекомбинантные бакуловирусы как векторы доставки генов в клетки млекопитающих». Тенденции в биотехнологии . 20 (4): 173–180. дои : 10.1016/S0167-7799(01)01911-4 . ПМИД 11906750 .
^ Кост, Томас А; Кондри, Дж. Патрик; Джарвис, Дональд Л. (2005). «Бакуловирус как универсальные векторы для экспрессии белков в клетках насекомых и млекопитающих» . Природная биотехнология . 23 (5): 567–575. дои : 10.1038/nbt1095 . ПМЦ 3610534 . ПМИД 15877075 .
^ Кост, Т; Кондри, Дж; Эймс, Р; Рис, С; Романос, М (2007). «Внедрение технологии доставки генов вируса BacMam в условиях разработки лекарств». Открытие наркотиков сегодня . 12 (9–10): 396–403. дои : 10.1016/j.drudis.2007.02.017 . ПМИД 17467576 .
^ Давенпорт, Элизабет А.; Нутулаганти, Парвати; Эймс, Роберт С. (2009). «BacMam: универсальная технология доставки генов для анализов GPCR». Рецепторы, связанные с G-белком, в открытии лекарств . Методы молекулярной биологии. Том. 552. стр. 199–211. дои : 10.1007/978-1-60327-317-6_14 . ISBN 978-1-60327-316-9 . ПМИД 19513651 . S2CID 21324231 .
^ Цзэн, Цземин; Ду, Хуан; Чжао, Ин; Паланисами, Налласивам; Ван, Шу (2007). «Опосредованная бакуловирусным вектором временная и стабильная экспрессия трансгена в эмбриональных стволовых клетках человека» . Стволовые клетки . 25 (4): 1055–1061. doi : 10.1634/stemcells.2006-0616 . ПМИД 17420229 .
^ Чещенко Н; Кругляк, Н; Эйзенсмит, Р.К.; Кругляк, В.А. (2001). «Новая система для производства полностью удаленных аденовирусных векторов, не требующая аденовируса-помощника» . Генная терапия . 8 (11): 846–854. дои : 10.1038/sj.gt.3301459 . ПМИД 11423932 .
^ Эймс, Роберт; Нутулаганти, Парвати; Форнуальд, Джим; Шабон, Усман; Ван-Дер-Кейл, Харджит; Эльшурбаги, Набиль (2004). «Гетерологичная экспрессия рецепторов, связанных с G-белком, в клетках остеосаркомы U-2 OS». Рецепторы и каналы . 10 (3–4): 117–124. дои : 10.1080/10606820490515012 . ПМИД 15512846 .
^ Ченг, Т; Сюй, CY; Ван, Ю.Б.; Чен, М; Ву, Т; Чжан, Дж; Ся, Н.С. (2004). «Быстрый и эффективный метод экспрессии генов-мишеней в клетках млекопитающих с помощью бакуловируса» . Всемирный журнал гастроэнтерологии . 10 (11): 1612–8. дои : 10.3748/wjg.v10.i11.1612 . ПМЦ 4572764 . ПМИД 15162535 .
^ Пфол, Дж.Л.; Уорли Дж.Ф., 3-е место; Кондри, JP; Ан, Г; Аполито, CJ; Кост, Т.А.; Труакс, Дж. Ф. (2002). «Титрование экспрессии KATP-канала в клетках млекопитающих с использованием трансдукции рекомбинантного бакуловируса». Рецепторы и каналы . 8 (2): 99–111. дои : 10.1080/10606820212396 . ПМИД 12448791 . {{cite journal}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )
^ Хорио, Х.; Тран, Р.; Камен, А. (2006). «Стабильность бессывороточных и очищенных запасов бакуловирусов при различных условиях хранения». Биотехнологический прогресс . 22 (1): 319–325. дои : 10.1021/bp050218v . ПМИД 16454526 . S2CID 41069508 .
^ Смит, GE; Саммерс, доктор медицины; Фрейзер, MJ (1983). «Продукция бета-интерферона человека в клетках насекомых, инфицированных вектором экспрессии бакуловируса» . Молекулярная и клеточная биология . 3 (12): 2156–65. дои : 10.1128/MCB.3.12.2156 . ПМК 370086 . ПМИД 6318086 .
^ Стоимость, Т.А. и Кондри, JP 2002a. Прикладная биобезопасность 7:167–169.
^ Кост, Т.А., Кондри, Дж.П. и Микельсон, Калифорния, 2000. Бибезопасность и векторы переноса вирусных генов. Биологическая безопасность, принципы и практика, 3-е изд. Д.О. Флеминг и Д.Л. Хант (ред.), Американское общество микробиологии, Вашингтон, округ Колумбия, стр. 579–597.
^ Матилайнен, Х.; Ринне, Дж.; Гилберт, Л.; Маржомаки, В.; Реунанен, Х.; Окер-Блом, К. (2005). «Проникновение бакуловируса в клетки гепатомы человека» . Журнал вирусологии . 79 (24): 15452–15459. doi : 10.1128/JVI.79.24.15452-15459.2005 . ПМК 1316037 . ПМИД 16306616 .
^ Лонг, Г.; Пан, X.; Кормелинк, Р.; Влак, Дж. М. (2006). «Функциональное проникновение бакуловируса в клетки насекомых и млекопитающих зависит от клатрин-опосредованного эндоцитоза» . Журнал вирусологии . 80 (17): 8830–8833. дои : 10.1128/JVI.00880-06 . ПМЦ 1563848 . ПМИД 16912330 .
^ Кенутис, К.; Эфрос, Р.Ц.; Свеверс, Л.; Лавдас, А.А.; Гайтану, М.; Матсас, Р.; Ятру, К. (2006). «Доставка генов, опосредованная бакуловирусом, в клетки млекопитающих не изменяет их транскрипционный и дифференцирующий потенциал, но сопровождается ранней экспрессией вирусных генов» . Журнал вирусологии . 80 (8): 4135–4146. doi : 10.1128/JVI.80.8.4135-4146.2006 . ПМК 1440473 . ПМИД 16571829 .
^ Булер, Жером; Чжао, Ин; Ван, Шу (2009). «Профилирование экспрессии генов для определения реакции хозяина на бакуловирусную трансдукцию в головном мозге» . Журнал нейрохимии . 109 (5): 1203–1214. дои : 10.1111/j.1471-4159.2009.06015.x . ПМИД 19476540 .
^ Жарден, Б; Чжао, Ю; Сельварадж, М; Монтес, Дж; Тран, Р; Пракаш, С; Элиас, К. (2008). «Экспрессия SEAP (секретируемой щелочной фосфатазы) посредством бакуловирусной трансдукции клеток HEK 293 в системе биореактора с полыми волокнами». Журнал биотехнологии . 135 (3): 272–280. doi : 10.1016/j.jbiotec.2008.04.006 . ПМИД 18499293 .
^ Эймс, Роберт; Форнвальд, Джеймс; Нутулаганти, Парвати; Трилл, Джон; Фоли, Джеймс; Бакли, Питер; Кост, Томас; Ву, Зининг; Романос, Майкл (2004). «Рекомбинантные бакуловирусы BacMam в G-белке? Открытие лекарственного средства, связанного с рецепторами». Рецепторы и каналы . 10 (3–4): 99–107. дои : 10.1080/10606820490514969 . ПМИД 15512844 .
^ Эймс, Роберт С; Кост, Томас А; Кондри, Дж. Патрик (2007). «Технология BacMam и ее применение для открытия лекарств». Экспертное мнение о лекарствах . 2 (12): 1669–1681. дои : 10.1517/17460441.2.12.1669 . ПМИД 23488908 . S2CID 45039136 .
^ Дистельмайер, Феликс; Купман, Вернер Дж. Х.; Теста, Эпифания Р.; Де Йонг, Арьян С.; Свартс, Герман Г.; Маятепек, Эртан; Смитинк, Ян AM; Виллемс, Питер ХГМ (2008). «Количественная оценка потенциала митохондриальной мембраны живых клеток на уровне отдельной органеллы». Цитометрия Часть А. 73А (2): 129–138. doi : 10.1002/cyto.a.20503 . ПМИД 18163486 . S2CID 5147755 .
^ Хувилер, Кристин Г.; МакХлейдт, Томас; Чейз, Лукас; Хэнсон, Бонни; Роберс, Мэтью Б. (2009). «Характеристика активации рецептора серотонина 5-гидрокситриптамина-1А с использованием датчика киназы 2, регулируемого фосфо-внеклеточным сигналом». Аналитическая биохимия . 393 (1): 95–104. дои : 10.1016/j.ab.2009.06.018 . ПМИД 19539597 .
^ Дуккипати, Абхирам; Пак, Хён Хо; Вагрэй, Дипак; Фишер, Сюзанна; Гарсия, Кинан К. (2008). «Система BacMam для экспрессии высокого уровня рекомбинантных растворимых и мембранных гликопротеинов для структурных исследований» . Белковый экстракт Purif . 62 (2): 160–170. дои : 10.1016/j.pep.2008.08.004 . ПМК 2637115 . ПМИД 18782620 .

Внешние ссылки

Система БакМам

[1] Хофманн, К; Штраус, М. (1998). «Перенос генов, опосредованный бакуловирусом, в присутствии сыворотки или крови человека, облегченный ингибированием системы комплемента» . Генная терапия . 5 (4): 531–536. дои : 10.1038/sj.gt.3300607 . ПМИД 9614578 .

[2] Бойс, FM; Бучер, Нидерланды (1996). «Перенос генов, опосредованный бакуловирусом, в клетки млекопитающих» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (6): 2348–52. Бибкод : 1996PNAS...93.2348B . дои : 10.1073/pnas.93.6.2348 . ПМК 39799 . ПМИД 8637876 .

[3] Патент США № 5871986.

[Kost2002-4] Кост, Т; Кондри, JP (2002). «Рекомбинантные бакуловирусы как векторы доставки генов в клетки млекопитающих». Тенденции в биотехнологии . 20 (4): 173–180. дои : 10.1016/S0167-7799(01)01911-4 . ПМИД 11906750 .

[Kost2005-5] Кост, Томас А; Кондри, Дж. Патрик; Джарвис, Дональд Л. (2005). «Бакуловирус как универсальные векторы для экспрессии белков в клетках насекомых и млекопитающих» . Природная биотехнология . 23 (5): 567–575. дои : 10.1038/nbt1095 . ПМЦ 3610534 . ПМИД 15877075 .

[Kost2007-6] Кост, Т; Кондри, Дж; Эймс, Р; Рис, С; Романос, М (2007). «Внедрение технологии доставки генов вируса BacMam в условиях разработки лекарств». Открытие наркотиков сегодня . 12 (9–10): 396–403. дои : 10.1016/j.drudis.2007.02.017 . ПМИД 17467576 .

[7] Давенпорт, Элизабет А.; Нутулаганти, Парвати; Эймс, Роберт С. (2009). «BacMam: универсальная технология доставки генов для анализов GPCR». Рецепторы, связанные с G-белком, в открытии лекарств . Методы молекулярной биологии. Том. 552. стр. 199–211. дои : 10.1007/978-1-60327-317-6_14 . ISBN 978-1-60327-316-9 . ПМИД 19513651 . S2CID 21324231 .

[8] Цзэн, Цземин; Ду, Хуан; Чжао, Ин; Паланисами, Налласивам; Ван, Шу (2007). «Опосредованная бакуловирусным вектором временная и стабильная экспрессия трансгена в эмбриональных стволовых клетках человека» . Стволовые клетки . 25 (4): 1055–1061. doi : 10.1634/stemcells.2006-0616 . ПМИД 17420229 .

[9] Чещенко Н; Кругляк, Н; Эйзенсмит, Р.К.; Кругляк, В.А. (2001). «Новая система для производства полностью удаленных аденовирусных векторов, не требующая аденовируса-помощника» . Генная терапия . 8 (11): 846–854. дои : 10.1038/sj.gt.3301459 . ПМИД 11423932 .

[10] Эймс, Роберт; Нутулаганти, Парвати; Форнуальд, Джим; Шабон, Усман; Ван-Дер-Кейл, Харджит; Эльшурбаги, Набиль (2004). «Гетерологичная экспрессия рецепторов, связанных с G-белком, в клетках остеосаркомы U-2 OS». Рецепторы и каналы . 10 (3–4): 117–124. дои : 10.1080/10606820490515012 . ПМИД 15512846 .

[11] Ченг, Т; Сюй, CY; Ван, Ю.Б.; Чен, М; Ву, Т; Чжан, Дж; Ся, Н.С. (2004). «Быстрый и эффективный метод экспрессии генов-мишеней в клетках млекопитающих с помощью бакуловируса» . Всемирный журнал гастроэнтерологии . 10 (11): 1612–8. дои : 10.3748/wjg.v10.i11.1612 . ПМЦ 4572764 . ПМИД 15162535 .

[12] Пфол, Дж.Л.; Уорли Дж.Ф., 3-е место; Кондри, JP; Ан, Г; Аполито, CJ; Кост, Т.А.; Труакс, Дж. Ф. (2002). «Титрование экспрессии KATP-канала в клетках млекопитающих с использованием трансдукции рекомбинантного бакуловируса». Рецепторы и каналы . 8 (2): 99–111. дои : 10.1080/10606820212396 . ПМИД 12448791 . {{cite journal}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )

[13] Хорио, Х.; Тран, Р.; Камен, А. (2006). «Стабильность бессывороточных и очищенных запасов бакуловирусов при различных условиях хранения». Биотехнологический прогресс . 22 (1): 319–325. дои : 10.1021/bp050218v . ПМИД 16454526 . S2CID 41069508 .

[14] Смит, GE; Саммерс, доктор медицины; Фрейзер, MJ (1983). «Продукция бета-интерферона человека в клетках насекомых, инфицированных вектором экспрессии бакуловируса» . Молекулярная и клеточная биология . 3 (12): 2156–65. дои : 10.1128/MCB.3.12.2156 . ПМК 370086 . ПМИД 6318086 .

[15] Стоимость, Т.А. и Кондри, JP 2002a. Прикладная биобезопасность 7:167–169.

[16] Кост, Т.А., Кондри, Дж.П. и Микельсон, Калифорния, 2000. Бибезопасность и векторы переноса вирусных генов. Биологическая безопасность, принципы и практика, 3-е изд. Д.О. Флеминг и Д.Л. Хант (ред.), Американское общество микробиологии, Вашингтон, округ Колумбия, стр. 579–597.

[17] Матилайнен, Х.; Ринне, Дж.; Гилберт, Л.; Маржомаки, В.; Реунанен, Х.; Окер-Блом, К. (2005). «Проникновение бакуловируса в клетки гепатомы человека» . Журнал вирусологии . 79 (24): 15452–15459. doi : 10.1128/JVI.79.24.15452-15459.2005 . ПМК 1316037 . ПМИД 16306616 .

[18] Лонг, Г.; Пан, X.; Кормелинк, Р.; Влак, Дж. М. (2006). «Функциональное проникновение бакуловируса в клетки насекомых и млекопитающих зависит от клатрин-опосредованного эндоцитоза» . Журнал вирусологии . 80 (17): 8830–8833. дои : 10.1128/JVI.00880-06 . ПМЦ 1563848 . ПМИД 16912330 .

[19] Кенутис, К.; Эфрос, Р.Ц.; Свеверс, Л.; Лавдас, А.А.; Гайтану, М.; Матсас, Р.; Ятру, К. (2006). «Доставка генов, опосредованная бакуловирусом, в клетки млекопитающих не изменяет их транскрипционный и дифференцирующий потенциал, но сопровождается ранней экспрессией вирусных генов» . Журнал вирусологии . 80 (8): 4135–4146. doi : 10.1128/JVI.80.8.4135-4146.2006 . ПМК 1440473 . ПМИД 16571829 .

[20] Булер, Жером; Чжао, Ин; Ван, Шу (2009). «Профилирование экспрессии генов для определения реакции хозяина на бакуловирусную трансдукцию в головном мозге» . Журнал нейрохимии . 109 (5): 1203–1214. дои : 10.1111/j.1471-4159.2009.06015.x . ПМИД 19476540 .

[21] Жарден, Б; Чжао, Ю; Сельварадж, М; Монтес, Дж; Тран, Р; Пракаш, С; Элиас, К. (2008). «Экспрессия SEAP (секретируемой щелочной фосфатазы) посредством бакуловирусной трансдукции клеток HEK 293 в системе биореактора с полыми волокнами». Журнал биотехнологии . 135 (3): 272–280. doi : 10.1016/j.jbiotec.2008.04.006 . ПМИД 18499293 .

[22] Эймс, Роберт; Форнвальд, Джеймс; Нутулаганти, Парвати; Трилл, Джон; Фоли, Джеймс; Бакли, Питер; Кост, Томас; Ву, Зининг; Романос, Майкл (2004). «Рекомбинантные бакуловирусы BacMam в G-белке? Открытие лекарственного средства, связанного с рецепторами». Рецепторы и каналы . 10 (3–4): 99–107. дои : 10.1080/10606820490514969 . ПМИД 15512844 .

[23] Эймс, Роберт С; Кост, Томас А; Кондри, Дж. Патрик (2007). «Технология BacMam и ее применение для открытия лекарств». Экспертное мнение о лекарствах . 2 (12): 1669–1681. дои : 10.1517/17460441.2.12.1669 . ПМИД 23488908 . S2CID 45039136 .

[24] Дистельмайер, Феликс; Купман, Вернер Дж. Х.; Теста, Эпифания Р.; Де Йонг, Арьян С.; Свартс, Герман Г.; Маятепек, Эртан; Смитинк, Ян AM; Виллемс, Питер ХГМ (2008). «Количественная оценка потенциала митохондриальной мембраны живых клеток на уровне отдельной органеллы». Цитометрия Часть А. 73А (2): 129–138. doi : 10.1002/cyto.a.20503 . ПМИД 18163486 . S2CID 5147755 .

[25] Хувилер, Кристин Г.; МакХлейдт, Томас; Чейз, Лукас; Хэнсон, Бонни; Роберс, Мэтью Б. (2009). «Характеристика активации рецептора серотонина 5-гидрокситриптамина-1А с использованием датчика киназы 2, регулируемого фосфо-внеклеточным сигналом». Аналитическая биохимия . 393 (1): 95–104. дои : 10.1016/j.ab.2009.06.018 . ПМИД 19539597 .

[26] Дуккипати, Абхирам; Пак, Хён Хо; Вагрэй, Дипак; Фишер, Сюзанна; Гарсия, Кинан К. (2008). «Система BacMam для экспрессии высокого уровня рекомбинантных растворимых и мембранных гликопротеинов для структурных исследований» . Белковый экстракт Purif . 62 (2): 160–170. дои : 10.1016/j.pep.2008.08.004 . ПМК 2637115 . ПМИД 18782620 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

[ 18 ]

[ 19 ]

[ 20 ]

[ 21 ]

[ 22 ]

[ 23 ]

[ 24 ]

[ 25 ]

[ 26 ]