Темнопольная микроскопия

Эритроциты, видимые с помощью темнопольной микроскопии, х 1000.

Принцип действия темнопольной и фазоконтрастной микроскопии.

Микроскопия темного поля (также называемая микроскопией темного поля ) описывает микроскопии методы , как в световой , так и в электронной микроскопии , которые исключают нерассеянный луч из изображения. Следовательно, поле вокруг образца (т. е. там, где нет образца, рассеивающего луч), как правило, темное.

В оптических микроскопах необходимо использовать темнопольную конденсорную линзу, которая направляет конус света от объектива. Чтобы максимизировать светосилу объектива, собирающего рассеянный свет, используется масляная иммерсия, а числовая апертура (ЧА) объектива должна быть меньше 1,0. Объективы с более высокой числовой апертурой можно использовать, но только в том случае, если они имеют регулируемую диафрагму, которая уменьшает числовую апертуру. Зачастую числовая апертура этих объективов варьируется от 0,7 до 1,25.

световой

В оптической микроскопии тёмное поле описывает метод освещения, используемый для усиления контраста в неокрашенных образцах . Он работает путем освещения образца светом, который не улавливается линзой объектива и, следовательно, не образует часть изображения. Это создает классический вид темного, почти черного фона с яркими объектами на нем.

Путь света

Этапы показаны на рисунке, где инвертированный микроскоп используется .

Схема, показывающая путь света через темнопольный микроскоп.

1. Свет попадает в микроскоп для освещения образца.
2. Диск специального размера, патч-стоп (см. рисунок), блокирует часть света от источника света, оставляя внешнее кольцо освещения. Широкое фазовое кольцо также можно разумно заменить при малом увеличении.
3. Конденсаторная линза фокусирует свет на образец.
4. Свет попадает на образец. Большая часть передается напрямую, а часть рассеивается из выборки.
5. попадает Рассеянный свет в объектив, а прямо проходящий свет просто не попадает в объектив и не собирается благодаря блоку прямого освещения (см. рисунок).
6. Только рассеянный свет создает изображение, тогда как прямо проходящий свет отсутствует.

Преимущества и недостатки

Микроскопия темного поля дает изображение на темном фоне.

Темнопольная микроскопия — очень простой, но эффективный метод, хорошо подходящий для использования живых и неокрашенных биологических образцов, таких как мазки тканевой культуры или отдельных одноклеточных организмов, переносимых водой. Учитывая простоту установки, качество изображений, полученных с помощью этого метода, впечатляет.

Одним из ограничений темнопольной микроскопии является низкий уровень освещенности, видимый на конечном изображении. Это означает, что образец должен быть очень сильно освещен, что может привести к его повреждению.

Методы темнопольной микроскопии почти полностью лишены артефактов в виде ореолов или рельефов, типичных для дифференциально-интерференционной контрастной микроскопии . Это происходит за счет чувствительности к фазовой информации.

Интерпретацию темнопольных изображений следует выполнять с большой осторожностью, поскольку общие темные особенности изображений, полученных при микроскопии светлого поля, могут быть невидимыми, и наоборот. В целом, в изображении в темном поле отсутствуют низкие пространственные частоты, присущие изображению в светлом поле, что делает изображение высокочастотной версией базовой структуры.

Хотя изображение в темном поле может сначала показаться негативом изображения в светлом поле, в каждом из них видны разные эффекты. При микроскопии светлого поля видны особенности, в которых либо тень отбрасывается на поверхность падающим светом, либо часть поверхности менее отражающая, возможно, из-за наличия ямок или царапин. Выпуклые объекты, которые слишком гладкие, чтобы отбрасывать тени, не будут отображаться на изображениях в светлом поле, но свет, отражающийся от сторон объекта, будет виден на изображениях в темном поле.

• Сравнение методов просвечивания, используемых для создания контраста в образце папиросной бумаги (1,559 мкм/пиксель при просмотре в полном разрешении)
• 
  Темнопольное освещение, контраст образца возникает за счет света, рассеянного образцом.
• 
  Освещение светлого поля , контраст образца обусловлен ослаблением света в образце.
• 
  Освещение кроссполяризованным светом , контраст образца возникает за счет вращения поляризованного света через образец.
• 
  Фазово-контрастное освещение, контраст образца возникает за счет интерференции лучей света различной длины через образец.

Использование в вычислительной технике

Темнопольная микроскопия недавно была применена в манипуляторах компьютерной мыши, чтобы позволить мыши работать на прозрачном стекле, визуализируя микроскопические дефекты и пыль на поверхности стекла.

Темнопольная микроскопия в сочетании

В сочетании с гиперспектральной визуализацией темнопольная микроскопия становится мощным инструментом для характеристики наноматериалов , встроенных в клетки. В недавней публикации Пацковский и др. использовали этот метод для изучения прикрепления наночастиц золота (AuNP), нацеленных на CD44 + раковые клетки.

электронного

Основная статья: трансмиссионная электронная микроскопия

Слабый пучок DF деформации вокруг сердечников ядерных треков

Темнопольные исследования в просвечивающей электронной микроскопии играют важную роль при изучении кристаллов и кристаллических дефектов, а также при визуализации отдельных атомов.

темном поле

Кратко, визуализация включает в себя наклон падающего освещения до тех пор, пока дифрагированный, а не падающий луч не пройдет через небольшую апертуру объектива в задней фокальной плоскости объектива. Темнопольные изображения в этих условиях позволяют отображать дифрагированную интенсивность, исходящую от одной совокупности дифрагирующих плоскостей, как функцию проекции положения на образце и как функцию наклона образца.

В монокристаллических образцах темнопольные изображения образца, наклоненного в непосредственной близости от условия Брэгга, позволяют «подсветить» только те дефекты решетки, такие как дислокации или выделения, которые изгибают один набор плоскостей решетки в их окрестностях. . Анализ интенсивности таких изображений может затем использоваться для оценки величины этого изгиба. С другой стороны, в поликристаллических образцах темнопольные изображения служат для освещения только той подгруппы кристаллов, которая обладает брэгговским отражением при данной ориентации.

показывать Анимация: темнопольная визуализация кристаллов

Digital dark-field simulation of 2 nm metal particles on a nano-cylinder This animation illustrates movement of an aperture (centered in the orange figure at left) over the power spectrum (a digital substitute for the back focal-plane's optical diffraction pattern) shown with the DC peak (or unscattered beam) below center. Only nanocrystals with projected periodicities that diffract into the aperture light up in the dark-field image at right. The aperture is moving by 1.25° increments around the ring associated with diffraction from gold 2.3 Å (111) lattice spacings.

Визуализация в слабом луче

Цифровое темнопольное изображение внутренних близнецов

Визуализация слабым лучом включает в себя оптику, аналогичную обычной темному полю, но использует гармонику дифрагированного луча , а не сам дифрагированный луч. Таким образом можно получить гораздо более высокое разрешение напряженных областей вокруг дефектов.

Кольцевая визуализация в темном поле под низким и большим углом

Кольцевая визуализация в темном поле требует формирования изображений с электронами, дифрагированными в кольцевую апертуру, центрированную на нерассеянном луче, но не включая его. Для больших углов рассеяния в сканирующем просвечивающем электронном микроскопе это иногда называют Z -контрастным изображением из-за усиленного рассеяния на атомах с большим атомным номером.

поля

Это математический метод, промежуточный между прямым и обратным (преобразование Фурье) пространством для исследования изображений с четко определенной периодичностью, таких как изображения решетчатых полос электронного микроскопа. Как и в случае с аналоговой визуализацией в темном поле в просвечивающем электронном микроскопе, она позволяет «осветить» те объекты в поле зрения, где находятся интересующие периодичности. В отличие от аналоговой визуализации в темном поле, она также может позволить составить карту Фурье-фазы периодичностей и, следовательно, фазовых градиентов, которые предоставляют количественную информацию о векторной деформации решетки.

См. также

• Кольцевая визуализация в темном поле
• Микроскопия светового поля
• Вейвлеты

Внешние ссылки

• Nikon - Стереомикроскопия > Освещение темного поля
• Молекулярные выражения
• Праймер для освещения Darkfield
• Гейдж Ш. 1920. Современная темнопольная микроскопия и история ее развития . Труды Американского микроскопического общества 39 (2): 95–141.
• Темнопольные и фазово-контрастные микроскопы (Université Paris Sud)