✖


Jump to content

Просвечивающая электронная криомикроскопия

КриоТЕМ-изображение GroEL, взвешенного в аморфном льду, при 50 000 ×. увеличении
Продолжительность: 8 секунд.
Структура алкогольоксидазы полученная Pichia Pastoris, методом CryoTEM.

Просвечивающая электронная криомикроскопия ( CryoTEM ), широко известная как крио-ЭМ , представляет собой форму криогенной электронной микроскопии , точнее тип просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ), где образец исследуется при криогенных температурах (обычно температурах жидкого азота ). [1] Крио-ЭМ, а именно трехмерная электронная микроскопия ( 3DEM ), набирает популярность в структурной биологии . [2]

Полезность трансмиссионной электронной криомикроскопии связана с тем, что она позволяет наблюдать образцы, которые не были окрашены или каким-либо образом зафиксированы, демонстрируя их в естественной среде. В этом отличие от рентгеновской кристаллографии , которая требует кристаллизации образца, что может быть затруднительно, и помещения его в нефизиологическую среду, что иногда может приводить к функционально нерелевантным конформационным изменениям.

Достижения в технологии детекторов электронов , в частности DED (прямые детекторы электронов), а также более мощные программные алгоритмы визуализации позволили определять макромолекулярные структуры с разрешением, близким к атомному. [3] Изображенные макромолекулы включают вирусы , рибосомы , митохондрии , ионные каналы и ферментные комплексы. Начиная с 2018 года крио-ЭМ можно будет применять к таким маленьким структурам, как гемоглобин (64 кДа ). [4] и с разрешением до 1,8 Å . [5] В 2019 году крио-ЭМ структуры составляли 2,5% структур, депонированных в Банке данных белков . [6] и это число продолжает расти. [7] Применением криоЭМ является криоэлектронная томография (крио-ЭТ), при которой трехмерная реконструкция образца создается из наклоненных двумерных изображений.

Развитие [ править ]

Первоначальное обоснование использования CryoTEM заключалось в том, что это средство борьбы с радиационным повреждением биологических образцов. Количество радиации, необходимое для получения изображения образца в электронном микроскопе, достаточно велико, чтобы стать потенциальным источником повреждения хрупких структур. Кроме того, высокий вакуум, необходимый на колонке электронного микроскопа, делает среду для образца весьма жесткой.

Проблема вакуума была частично решена введением негативных красителей , но даже при негативных красителях биологические образцы склонны к структурному разрушению при обезвоживании образца. Погружение образцов в лед при температуре ниже температуры сублимации предполагалось изначально, но вода имеет тенденцию образовывать кристаллическую решетку с более низкой плотностью при замерзании, и это может разрушить структуру всего, что в нее встроено.

В начале 1980-х годов несколько групп, изучающих физику твердого тела, пытались получить стекловидный лед различными способами, такими как замораживание под высоким давлением или мгновенное замораживание. В своей основополагающей статье 1984 года группа под руководством Жака Дюбоше из Европейской лаборатории молекулярной биологии продемонстрировала изображения аденовируса, встроенного в застеклованный слой воды. [8] Обычно считается, что эта статья знаменует собой зарождение крио-ЭМ, и этот метод был разработан до такой степени, что стал рутинным во многих лабораториях по всему миру.

Энергия электронов, используемых для визуализации (80–300 кВ), достаточно высока, чтобы ковалентные связи можно было разорвать . Когда образцы для визуализации уязвимы к радиационному повреждению, необходимо ограничить воздействие электронов, используемых для получения изображения. Эти низкие экспозиции требуют, чтобы изображения тысяч или даже миллионов идентичных замороженных молекул были выбраны, выровнены и усреднены для получения карт высокого разрешения с использованием специального программного обеспечения. Значительное улучшение структурных характеристик было достигнуто в 2012 году за счет внедрения детекторов прямых электронов и более совершенных вычислительных алгоритмов. [1] [2]

В 2015 году Бриджит Каррагер и ее коллеги из Национального ресурса по автоматизированной молекулярной микроскопии Скриппса использовали методы, разработанные ею и Клинтом Поттером, для определения первой крио-ЭМ структуры с разрешением менее 3 Å, тем самым сделав CryoTEM инструментом, сравнимым с ним и потенциально превосходящим его. традиционным методам рентгеновской кристаллографии. [9] [10] С тех пор были достигнуты более высокие разрешения, в том числе структура бактериального фермента β-галактозидазы размером 2,2 Å в 2015 году. [11] и структура глутаматдегидрогеназы размером 1,8 Å в 2016 году. [12] Крио-ЭМ также использовалась для определения структуры различных вирусов, в том числе вируса Зика . [13] и был применен к большим комплексам, таким как сплайсосома . [14] В 2017 году Нобелевская премия по химии была присуждена совместно Жаку Дюбоше , Иоахиму Франку и Ричарду Хендерсону «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением». [15]

Биологические образцы [ править ]

Тонкая пленка [ править ]

Биологический материал наносится на сетку электронной микроскопии и сохраняется в замороженном гидратированном состоянии путем быстрого замораживания, обычно в жидком этане при температуре , близкой к температуре жидкого азота . Поддерживая образцы при температуре жидкого азота или ниже, их можно поместить в высокий вакуум колонки электронного микроскопа . Большинство биологических образцов чрезвычайно радиочувствительны , поэтому их необходимо визуализировать с помощью методов низких доз (полезно, что низкая температура просвечивающей электронной криомикроскопии обеспечивает дополнительный фактор защиты от радиационного повреждения).

Следовательно, изображения чрезвычайно зашумлены . Для некоторых биологических систем можно усреднить изображения, чтобы увеличить соотношение сигнал/шум и получить информацию с высоким разрешением об образце, используя метод, известный как анализ одиночных частиц . Этот подход в целом требует, чтобы усредняемые объекты были идентичны, хотя теперь можно изучить некоторую ограниченную конформационную гетерогенность (например, рибосому ). Трехмерные реконструкции белковых комплексов и вирусов на основе изображений CryoTEM были решены с субнанометровым или почти атомным разрешением, что позволило по-новому взглянуть на структуру и биологию этих больших ансамблей.

Анализ упорядоченных массивов белков, таких как двумерные кристаллы или трансмембранных белков спиральные массивы белков, также позволяет проводить своего рода усреднение, которое может предоставить информацию с высоким разрешением об образце. Этот метод называется электронной кристаллографией .

Срезы стекловидного тела [ править ]

Метод тонких пленок ограничен тонкими образцами (обычно < 500 нм), поскольку электроны не могут пересекать более толстые образцы без многократного рассеяния. Более толстые образцы можно остекловать путем погружной заморозки ( криофиксации ) в этане (толщина до десятков мкм) или, что чаще, замораживанием под высоким давлением (до сотен мкм). Затем их можно разрезать на тонкие срезы (толщиной от 40 до 200 нм) алмазным ножом в криультрамикротоме при температуре ниже -135 ° C (температура расстекловывания). Срезы собираются на сетке электронного микроскопа и визуализируются так же, как образец, остеклованный в тонкую пленку. Этот метод называется трансмиссионной электронной криомикроскопией срезов стекловидного тела (CEMOVIS) или трансмиссионной электронной криомикроскопией замороженных гидратированных срезов.

Образцы материалов [ править ]

Помимо возможности визуализации остеклованных биологических образцов, CryoTEM также можно использовать для визуализации образцов материалов, которые слишком летучи в вакууме, чтобы их можно было визуализировать с помощью стандартной электронной микроскопии при комнатной температуре. Например, остеклованные участки границы раздела жидкость-твердое тело можно извлечь для анализа с помощью CryoTEM. [16] а сера, склонная к сублимации в вакууме электронных микроскопов, может быть стабилизирована и отображена в CryoTEM. [17]

Обработка изображений в крио-ТЕМ [ править ]

Несмотря на то, что в большинстве подходов электронной микроскопии пытаются получить изображение материала с наилучшим разрешением, в крио-ПЭМ это не всегда получается. Помимо всех преимуществ изображений с высоким разрешением, соотношение сигнал/шум остается основным препятствием, которое не позволяет определить ориентацию каждой частицы. Например, в комплексах макромолекул существует несколько различных структур, которые проецируются из 3D в 2D во время визуализации, и если они не различимы, результатом обработки изображения будет размытие. Вот почему вероятностные подходы становятся более эффективными в такого рода исследованиях. [18] В настоящее время при обработке крио-ЭМ изображений широко используются два популярных подхода: метод максимального правдоподобия, открытый в 1998 году. [19] и относительно недавно адаптированный байесовский подход. [20]

Подход оценки максимального правдоподобия приходит в эту область из статистики. Здесь все возможные ориентации частиц суммируются, чтобы получить результирующее распределение вероятностей. Мы можем сравнить это с типичной оценкой методом наименьших квадратов , где частицы получают точную ориентацию на изображении. [21] Таким образом, после вычислений частицы в образце получают «нечеткую» ориентацию, взвешенную по соответствующим вероятностям. Весь процесс итеративный, и с каждой следующей итерацией модель становится лучше. Хорошие условия для создания модели, которая точно отражает реальную структуру, — это когда данные не содержат слишком много шума, а частицы не имеют какого-либо предпочтительного направления. Основным недостатком подхода максимального правдоподобия является то, что результат зависит от первоначального предположения, и оптимизация модели иногда может застрять на локальном минимуме. [22]

Байесовский подход , который сейчас используется в крио-ТЕМ, носит эмпирический характер. Это означает, что распределение частиц основано на исходном наборе данных. Аналогично, в обычном байесовском методе существует фиксированная априорная вероятность , которая изменяется после наблюдения данных. Основное отличие от оценки максимального правдоподобия заключается в специальном термине реконструкции, который помогает сгладить полученные карты, а также уменьшить шум во время реконструкции. [21] Сглаживание карт происходит за счет предположения, что априорная вероятность является распределением Гаусса, и анализа данных в пространстве Фурье. Поскольку связь между предварительными знаниями и набором данных установлена, вероятность ошибок человеческого фактора снижается, что потенциально повышает объективность реконструкции изображения. [20]

С появлением новых методов крио-ТЭМ-визуализации и реконструкции изображений появляются новые программные решения, которые помогают автоматизировать этот процесс. После того, как эмпирический байесовский подход был реализован в компьютерной программе с открытым исходным кодом RELION (REgularized LIkelihood OptimizatioN) для 3D-реконструкции, [23] [24] программа получила широкое распространение в области крио-ТЕМ. Он предлагает ряд исправлений, улучшающих разрешение реконструированных изображений, позволяет реализовывать универсальные сценарии с использованием языка Python и выполняет обычные задачи классификации 2D/3D-моделей или создания моделей de novo . [25] [26]

Техники [ править ]

В CryoTEM можно использовать различные методы. [27] К популярным методам относятся:

  1. Электронная кристаллография
    1. Анализ двумерных кристаллов
    2. Анализ спиральных нитей или трубок
    3. Микрокристаллическая электронография (MicroED) [28] [29] [30] [31]
  2. Анализ одиночных частиц (SPA)
    1. CryoTEM с временным разрешением [32] [33] [34]
  3. Электронная криотомография (криоЭТ)

См. также [ править ]

В Wikibooks есть книга на тему: Программные средства для молекулярной микроскопии.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Jump up to: Перейти обратно: а б Кюльбрандт В. (август 2014 г.). «Крио-ЭМ вступает в новую эру» . электронная жизнь . 3 : e03678. дои : 10.7554/elife.03678 . ПМК   4131193 . ПМИД   25122623 .
  2. ^ Jump up to: Перейти обратно: а б Каллауэй Э (сентябрь 2015 г.). «Революция не кристаллизуется: новый метод проносится через структурную биологию» . Природа . 525 (7568): 172–4. Бибкод : 2015Natur.525..172C . дои : 10.1038/525172а . ПМИД   26354465 .
  3. ^ Мурата К., Вольф М. (февраль 2018 г.). «Криоэлектронная микроскопия для структурного анализа динамических биологических макромолекул» . Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Общие предметы . 1862 (2): 324–334. дои : 10.1016/j.bbagen.2017.07.020 . ПМИД   28756276 .
  4. ^ Хошуэй М., Раджаиния М., Баумайстер В., Данев Р. (июнь 2017 г.). «Крио-ЭМ структура гемоглобина при 3,2 Å, определенная с помощью фазовой пластинки Вольта» . Природные коммуникации . 8 : 16099. Бибкод : 2017NatCo...816099K . дои : 10.1038/ncomms16099 . ПМК   5497076 . ПМИД   28665412 .
  5. ^ Мерк А., Бартесаги А., Банерджи С., Фальконьери В., Рао П., Дэвис М.И., Прагани Р., Боксер М.Б., Эрл Л.А., Милн Дж.Л., Субраманиам С. (июнь 2016 г.). «Разрушение барьеров разрешения крио-ЭМ для облегчения открытия лекарств» . Клетка . 165 (7): 1698–1707. дои : 10.1016/j.cell.2016.05.040 . ПМК   4931924 . ПМИД   27238019 .
  6. ^ «Распределение данных PDB по экспериментальному методу и молекулярному типу» . www.rcsb.org . Проверено 3 декабря 2019 г.
  7. ^ «Статистика PDB: рост структур в результате экспериментов 3DEM, выпущенных в год» . www.rcsb.org . Проверено 22 декабря 2018 г.
  8. ^ Адриан М., Дюбоше Дж., Лепо Дж., Макдауэлл А.В. (1984). «Криоэлектронная микроскопия вирусов» . Природа . 308 (5954): 32–6. Бибкод : 1984Natur.308...32A . дои : 10.1038/308032a0 . ПМИД   6322001 . S2CID   4319199 .
  9. ^ Деллисанти, Косма (2015). «Резолюция, разрушающая барьеры». Структурная и молекулярная биология природы . 22 (5): 361. doi : 10.1038/nsmb.3025 . S2CID   12198387 .
  10. ^ Кэмпбелл М.Г., Вислер Д., Ченг А., Поттер К.С., Каррагер Б. (март 2015 г.). «Реконструкция протеасомы 20S Thermoplasma acidophilum с разрешением 2,8 Å с использованием криоэлектронной микроскопии» . электронная жизнь . 4 . doi : 10.7554/eLife.06380 . ПМК   4391500 . ПМИД   25760083 .
  11. ^ Бартесаги А., Мерк А., Банерджи С., Мэттис Д., Ву Икс, Милн Дж.Л., Субраманиам С. (июнь 2015 г.). «Крио-ЭМ структура β-галактозидазы с разрешением 2,2 Å в комплексе с ингибитором проникновения в клетку» . Наука . 348 (6239): 1147–51. Бибкод : 2015Sci...348.1147B . дои : 10.1126/science.aab1576 . ПМК   6512338 . ПМИД   25953817 .
  12. ^ Вонк Дж., DJ Mills (октябрь 2017 г.). «Достижения в области криоЭМ олигомерных ферментов высокого разрешения» . Современное мнение в области структурной биологии . 46 : 48–54. дои : 10.1016/j.sbi.2017.05.016 . ПМИД   28624735 .
  13. ^ Сирохи Д., Чен З., Сан Л., Клозе Т., Пирсон Т.К., Россманн М.Г., Кун Р.Дж. (апрель 2016 г.). «Крио-ЭМ-структура вируса Зика с разрешением 3,8 Å» . Наука . 352 (6284): 467–70. Бибкод : 2016Sci...352..467S . дои : 10.1126/science.aaf5316 . ПМЦ   4845755 . ПМИД   27033547 .
  14. ^ Ченг Ю (август 2018 г.). «Одночастичная крио-ЭМ-Как она сюда попала и куда пойдет» . Наука . 361 (6405): 876–880. Бибкод : 2018Sci...361..876C . дои : 10.1126/science.aat4346 . ПМК   6460916 . ПМИД   30166484 .
  15. ^ «Нобелевская премия по химии 2017 года – пресс-релиз» . www.nobelprize.org . 4 октября 2017 г. Проверено 4 октября 2017 г.
  16. ^ Захман М.Дж., Асенат-Смит Э., Эстрофф Л.А., Куркутис Л.Ф. (декабрь 2016 г.). «Подготовка интактных поверхностей раздела твердого тела и жидкости для конкретного объекта путем локализации in situ без меток и криофокированного подъема ионного луча» . Микроскопия и микроанализ . 22 (6): 1338–1349. Бибкод : 2016MiMic..22.1338Z . дои : 10.1017/S1431927616011892 . ПМИД   27869059 .
  17. ^ Левин Б.Д., Захман М.Дж., Вернер Дж.Г., Сахоре Р., Нгуен К.Х., Хан Ю, Се Б, Ма Л., Арчер Л.А., Джанелис Э.П., Виснер Ю., Куркутис Л.Ф., Мюллер Д.А. (февраль 2017 г.). «Характеристика серных и наноструктурированных катодов серных батарей в электронной микроскопии без артефактов сублимации» . Микроскопия и микроанализ . 23 (1): 155–162. Бибкод : 2017MiMic..23..155L . дои : 10.1017/S1431927617000058 . ПМИД   28228169 . S2CID   6801783 .
  18. ^ Ченг, Ифань (31 августа 2018 г.). «Одночастичная крио-ЭМ — как она сюда попала и куда пойдет» . Наука . 361 (6405): 876–880. Бибкод : 2018Sci...361..876C . дои : 10.1126/science.aat4346 . ISSN   0036-8075 . ПМК   6460916 . ПМИД   30166484 .
  19. ^ Сигворт, Ф.Дж. (1998). «Подход максимального правдоподобия к уточнению одночастичного изображения» . Журнал структурной биологии . 122 (3): 328–339. дои : 10.1006/jsbi.1998.4014 . ПМИД   9774537 .
  20. ^ Jump up to: Перейти обратно: а б Шерес, Сьорс Х.В. (январь 2012 г.). «Байесовский взгляд на определение структуры крио-ЭМ» . Журнал молекулярной биологии . 415 (2): 406–418. дои : 10.1016/j.jmb.2011.11.010 . ПМК   3314964 . ПМИД   22100448 .
  21. ^ Jump up to: Перейти обратно: а б Ногалес, Ева; Шерес, Сьорс Х.В. (май 2015 г.). «Крио-ЭМ: уникальный инструмент визуализации сложности макромолекул» . Молекулярная клетка . 58 (4): 677–689. doi : 10.1016/j.molcel.2015.02.019 . ISSN   1097-2765 . ПМЦ   4441764 . ПМИД   26000851 .
  22. ^ Сигворт, Фред Дж. (01 февраля 2016 г.). «Принципы криоЭМ обработки одночастичных изображений» . Микроскопия . 65 (1): 57–67. doi : 10.1093/jmicro/dfv370 . ISSN   2050-5698 . ПМЦ   4749045 . ПМИД   26705325 .
  23. ^ Шерес, Сьорс Х.В. (1 декабря 2012 г.). «РЕЛИОН: Реализация байесовского подхода к определению структуры крио-ЭМ» . Журнал структурной биологии . 180 (3): 519–530. дои : 10.1016/j.jsb.2012.09.006 . ISSN   1047-8477 . ПМК   3690530 . ПМИД   23000701 .
  24. ^ «РЕЛИОН: Программное обеспечение для обработки изображений для криоэлектронной микроскопии» . Гитхаб . 3дем. 27 октября 2023 г. Проверено 27 октября 2023 г.
  25. ^ Бай, Сяо-чэнь; Макмаллан, Грег; Шерес, Сьорс Х.В. (январь 2015 г.). «Как крио-ЭМ совершает революцию в структурной биологии» . Тенденции биохимических наук . 40 (1): 49–57. дои : 10.1016/j.tibs.2014.10.005 . ISSN   0968-0004 . ПМИД   25544475 . S2CID   19727349 .
  26. ^ Живанов, Ясенко; Накане, Таканори; Форсберг, Бьёрн О; Киманиус, Дари; Хаген, Вим Дж. Х.; Линдал, Эрик; Шерес, Сьорс Х.В. (09 ноября 2018 г.). Эгельман, Эдвард Х; Куриян, Джон (ред.). «Новые средства автоматизированного крио-ЭМ определения структуры высокого разрешения в РЕЛИОН-3» . электронная жизнь . 7 : е42166. дои : 10.7554/eLife.42166 . ISSN   2050-084X . ПМК   6250425 . ПМИД   30412051 .
  27. ^ Презентация по криоэлектронной микроскопии | PharmaXChange.info
  28. ^ Ши Д., Нанненга Б.Л., Иаданза М.Г., Гонен Т. (ноябрь 2013 г.). «Трехмерная электронная кристаллография белковых микрокристаллов» . электронная жизнь . 2 : e01345. doi : 10.7554/eLife.01345 . ПМК   3831942 . ПМИД   24252878 .
  29. ^ Нанненга Б.Л., Ши Д., Лесли А.Г., Гонен Т. (сентябрь 2014 г.). «Определение структуры высокого разрешения путем сбора данных непрерывного вращения в MicroED» . Природные методы . 11 (9): 927–930. дои : 10.1038/nmeth.3043 . ПМК   4149488 . ПМИД   25086503 .
  30. ^ Ши Д., Нанненга Б.Л., де ла Крус М.Дж., Лю Дж., Сотель С., Калеро Дж., Рейес Ф.Е., Хаттне Дж., Гонен Т. (май 2016 г.). «Сборник данных MicroED для макромолекулярной кристаллографии» . Протоколы природы . 11 (5): 895–904. дои : 10.1038/нпрот.2016.046 . ПМЦ   5357465 . ПМИД   27077331 .
  31. ^ де ла Круз М.Д., Хаттне Дж., Ши Д., Зейдлер П., Родригес Дж., Рейес Ф.Е., Савайя М.Р., Касио Д., Вайс СК, Ким С.К., Хинк К.С., Хинк А.П., Калеро Г., Айзенберг Д., Гонен Т. (февраль 2017 г.) . «Структуры атомного разрешения из фрагментированных белковых кристаллов криоЭМ-методом MicroED» . Природные методы . 14 (4): 399–402. дои : 10.1038/nmeth.4178 . ПМК   5376236 . ПМИД   28192420 .
  32. ^ Фу З, Каледхонкар С, Борг А, Сунь М, Чен Б, Грассуччи Р.А., Эренберг М, Фрэнк Дж (декабрь 2016 г.). «Ключевые промежуточные соединения в рециркуляции рибосом, визуализированные с помощью криоэлектронной микроскопии с временным разрешением» . Структура . 24 (12): 2092–2101. дои : 10.1016/j.str.2016.09.014 . ПМК   5143168 . ПМИД   27818103 .
  33. ^ Фэн X, Фу З, Каледхонкар С, Цзя Ю, Шах Б, Цзинь А, Лю З, Сунь М, Чен Б, Грассуччи Р.А., Рен Ю, Цзян Х, Фрэнк Дж, Линь Кью (апрель 2017 г.). «Быстрый и эффективный метод микрофлюидного распыления-погружения для одночастичной крио-ЭМ высокого разрешения» . Структура . 25 (4): 663–670.е3. дои : 10.1016/j.str.2017.02.005 . ПМК   5382802 . ПМИД   28286002 .
  34. ^ Чен Б., Каледхонкар С., Сунь М., Шен Б., Лу З., Барнард Д., Лу Т.М., Гонсалес Р.Л., Фрэнк Дж. (июнь 2015 г.). «Структурная динамика ассоциации субъединиц рибосомы, изученная с помощью криогенной электронной микроскопии с временным разрешением при смешивании и распылении» . Структура . 23 (6): 1097–105. дои : 10.1016/j.str.2015.04.007 . ПМК   4456197 . ПМИД   26004440 .

Дальнейшее чтение [ править ]

Внешние ссылки [ править ]

Ресурсы библиотеки о
Криомикроскопия
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Transmission_electron_cryomicroscopy&oldid=1229891751"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 1fb61f46eb388b2de1d3dfba2eef68f3__1718772540
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/1f/f3/1fb61f46eb388b2de1d3dfba2eef68f3.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Transmission electron cryomicroscopy - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)