Иммунная электронная микроскопия

Иммунная электронная микроскопия (чаще называемая иммуноэлектронной микроскопией ) является эквивалентом иммунофлуоресценции , но в ней используется электронная микроскопия , а не световая микроскопия . ^[1] Иммуноэлектронная микроскопия идентифицирует и локализует интересующую молекулу, в частности интересующий белок, путем присоединения ее к определенному антителу . Эта связь может образоваться до или после внедрения клеток в предметные стекла. и антителом происходит реакция Между антигеном , в результате чего эта метка становится видимой под микроскопом. Сканирующая электронная микроскопия является подходящим вариантом, если антиген находится на поверхности клетки, но может потребоваться трансмиссионная электронная микроскопия, чтобы увидеть метку, если антиген находится внутри клетки. ^[2]

Процесс [ править ]

Антигены и соответствующие им антитела (обычно два) взаимодействуют на участке. ^[1] Затем трансмиссионная электронная микроскопия обнаруживает антитело и, следовательно, белок. Второе антитело обычно связано с золотом, поскольку золото имеет высокий атомный номер , что делает его очень плотным. Частицы коллоидного золота делают антитела видимыми за счет конъюгации с ними, поскольку известен их точный диаметр. ^[3] Когда электроны проходят через микроскоп, они ударяются об эту золотую частицу. Плотный атом золота отражает электроны, испускаемые электронным микроскопом, и вызывает появление целевой частицы внутри образца. ^[1]

Другой возможный процесс включает в себя белок А , полученный из бактерии . Он постоянно покрывает атом золота и связывается с константной областью антител. В этом процессе белок А используется в качестве замены вторичного и, следовательно, требуется только одно антитело. Белок А делает целевой белок видимым. Таким образом, весь процесс приводит к локализации и визуализации целевого белка. ^[1]

При использовании иммунной электронной микроскопии образец может быть либо тонким срезом, чтобы электроны могли проникнуть в него, либо отрицательно окрашенным. Негативное окрашивание имеет более высокое разрешение, но позволяет идентифицировать только молекулы, которые можно было бы распознать, если бы они стояли отдельно. При использовании в иммунной электронной микроскопии негативное окрашивание имплантирует небольшую частицу в образец, что позволяет лучше различить структуры внутри него. Преимущество иммуноэлектронной микроскопии заключается в том, что она позволяет распознавать частицы независимо от контекста. ^[4]

и Осложнения результаты

Потенциальные осложнения

Срезы под микроскопом должны быть очень тонкими, чтобы позволить электронам пройти. Некоторые сложности могут возникнуть на этапах подготовки, необходимой для создания тонких срезов, включая химическую фиксацию и заливку (обычно в пластик). Эти агрессивные препараты могут денатурировать антигены, нарушая их необходимую связь с антителами. Исследователи изобрели и использовали специальные процессы, позволяющие обойти эти проблемы и сохранить взаимодействие между антигеном и антителами. Эти методы включают световую фиксацию, а не химическую фиксацию, замораживание образца перед его разделением и инкубацию при комнатной температуре, а не при высоких температурах. ^[1]

Связи между антителами и их соответствующим антигеном или между антителами и их золотыми метками могут быть лишь частично надежными из-за воздействия низких концентраций или стерических препятствий при связывании. Контрольные группы необходимы для учета количества маркировки, которое происходит естественным путем без вируса. ^[5]

Результаты [ править ]

Результаты иммуноэлектронной микроскопии обычно оценивают количественно визуально. Чтобы количественный анализ был эффективным, образец должен обладать определенными характеристиками, что ограничивает частоту его использования. Это применимо в таких ситуациях, как наблюдение за тем, сколько частиц коллоидного золота прикреплено к конкретному антителу. ^[5] В ходе успешных экспериментов иммунная электронная микроскопия может точно определить местонахождение белков и углубить понимание взаимосвязи между структурой и функцией. Эти процессы маркировки и локализации помогают исследователям понять различные клеточные пути и процессы. ^[3]

Протоколы ЭМ-фиксации и внедрения сильно влияют на результаты образования иммунных комплексов: многие процедуры фиксации и обработки электронной микроскопии, такие как серия дегидратации, приводящая к полимеризации в пластике Epon, или сшивание белков глутаральдегидом-формальдегидом, не позволяют связывать антитело с его предшественником. цель. В одной статье было показано, что поддержание активных сайтов связывания с помощью щадящей ЭМ-фиксации и процедуры внедрения показало, что цитоплазматический транспорт, который, как считалось ранее, происходит через микровезикулы, на самом деле является артефактом препарата, возникающим из-за меченного пероксидазой антитела, используемого перед фиксацией: Прямое мечение иммунозолотом в срезах Lowicryl EM показало цитоплазматический транспорт без везикул в тканях яичников. ^[6].

1987:216А:395-401. Adv Exp Med Biol \1987:216A:395-401. дои: 10.1007/978-1-4684-5344-7_45.

История [ править ]

В 1931 году Эрнст Руска (лауреат Нобелевской премии 1986 года) и Макс Нолл создали первый электронный микроскоп. Это изобретение привело к созданию сканирующего электронного микроскопа и просвечивающего электронного микроскопа, которые позже способствовали развитию иммуноэлектронной микроскопии. Сначала технологии позволяли создавать только двухмерные изображения, но теперь, благодаря современным технологиям, доступны и трехмерные изображения. ^[3]

Иммуноэлектронная микроскопия возникла, когда две независимые группы в 1940-х годах объединили вирус табачной мозаики и его антисыворотку. Затем они исследовали его под электронным микроскопом. В то время разрешение было намного хуже из-за отсутствия дополнительного контраста и низкого качества микроскопов того времени. Известно, что частицы, использованные в эксперименте, имели форму стержней, и обе группы исследователей обнаружили, что эти стержни слиплись в группу, размер которой примерно в два раза превышал первоначальный размер. Более полутора десятилетий спустя исследователи начали использовать отдельные антитела, прикрепленные к вирусам. Наконец, в 1962 году появились отрицательно окрашенные антитела. ^[4]

Приложения [ править ]

Вирусы [ править ]

Трансмиссионная электронная микроскопия успешно предоставляет общую информацию о структуре, но с трудом дифференцирует более подробные части вируса или клетки. Иммуноэлектронная микроскопия помогает диагностировать вирусные инфекции и определять местонахождение вирусных антигенов в вакцинах. ^[5] Иммуноэлектронная микроскопия позволяет в достаточной степени диагностировать заболевания и идентифицировать возбудителей . Одним из примеров является его способность отображать разрушение миелина на базальной мембране . Это повреждение может быть связано с замедлением нервных импульсов, что приводит к широкому спектру когнитивных и физических проблем. Другой пример включает выявление кожных поражений . В этом случае ученые обнаружили недостаточное количество закрепляющихся фибрилл в базальной мембране, из-за чего кожа стала более хрупкой. В обоих случаях ученые определили конкретный антиген, на который нужно нацелиться, чтобы использовать иммунную электронную микроскопию, чтобы обнаружить и узнать больше об этих заболеваниях. ^[7]

почек Биопсия

Первоначально почек при биопсии использовалась иммунофлуоресцентная микроскопия, которая обеспечивала более низкое разрешение, чем иммуноэлектронная микроскопия. Прежде чем перейти от световой микроскопии к электронной микроскопии, результаты показали многочисленные биопсии, требующие дополнительной электронной микроскопии для обеспечения более точного диагноза. Дополнительное применение иммуноэлектронной микроскопии произошло как для постановки первичного диагноза, так и для подтверждения результатов световой микроскопии. Ученые решили завершить исследование эффективности каждого вида микроскопии. Во многих случаях, используя только световую микроскопию, врачи не могли поставить первоначальный диагноз. Некоторым даже поставили неправильный диагноз. Тип диагноза также играл решающую роль в эксперименте. Флуоресцентная световая микроскопия точно идентифицирует некоторые диагнозы без необходимости последующего наблюдения. Другие было гораздо труднее дифференцировать и нуждались в электронной микроскопии. Даже у пациентов, у которых иммунофлуоресцентная микроскопия дала правильные результаты, исследователи все еще считали, что подтверждение необходимо. Результаты данного исследования продемонстрировали необходимость перехода от световой микроскопии к электронной микроскопии для диагностики биопсии почки. ^[8]

Ссылки [ править ]

^ Jump up to: Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Лодиш, Харви; Берк, Арнольд; Кайзер, Крис; Кригер, Монти; Бретшер, Энтони; Плоэ, Хидде; Амон, Анжелика; Мартин, Келси (1 апреля 2016 г.). Молекулярно-клеточная биология (8-е изд.). У. Х. Фриман. ISBN 978-1464183393 .
^ «Услуги иммуно-электронной микроскопии в центре электронной микроскопии - Медицинской школе UMASS» . Медицинская школа Массачусетского университета в Чан . 2 ноября 2013 года . Проверено 5 декабря 2022 г.
^ Jump up to: Перейти обратно: ^а ^б ^с «Иммуноэлектронная микроскопия» . Атлас белков человека .
^ Jump up to: Перейти обратно: ^а ^б Милн, Роберт Г. (1991). Электронная микроскопия возбудителей растений . Шпрингер, Берлин, Гейдельберг. стр. 87–102. дои : 10.1007/978-3-642-75818-8_7 . ISBN 978-3-642-75818-8 . S2CID 80868758 . Проверено 6 декабря 2022 г.
^ Jump up to: Перейти обратно: ^а ^б ^с Гулати, Ниту М.; Ториан, Удана; Галлахер, Джон Р.; Харрис, Одри К. (июнь 2019 г.). «Иммуноэлектронная микроскопия вирусных антигенов» . Современные протоколы в микробиологии . 53 (1): е86. дои : 10.1002/cpmc.86 . ПМК 6588173 . ПМИД 31219685 .
^ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3687530.
^ Кардонес, Адела Рамби Г.; Холл, Рассел П. (1 января 2019 г.). «63 – Буллезные болезни кожи и слизистых оболочек» . Клиническая иммунология (5-е изд.). Эльзевир. стр. 857–870.д1. ISBN 978-0-7020-6896-6 . Проверено 6 декабря 2022 г.
^ Хаас, М. (1 января 1997 г.). «Переоценка рутинной электронной микроскопии при исследовании нативных биоптатов почек» . Журнал Американского общества нефрологов . 8 (1): 70–76. дои : 10.1681/ASN.V8170 . ISSN 1046-6673 . ПМИД 9013450 . S2CID 26970189 . Проверено 6 декабря 2022 г.

[book-1] Jump up to: Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Лодиш, Харви; Берк, Арнольд; Кайзер, Крис; Кригер, Монти; Бретшер, Энтони; Плоэ, Хидде; Амон, Анжелика; Мартин, Келси (1 апреля 2016 г.). Молекулярно-клеточная биология (8-е изд.). У. Х. Фриман. ISBN 978-1464183393 .

[2] «Услуги иммуно-электронной микроскопии в центре электронной микроскопии - Медицинской школе UMASS» . Медицинская школа Массачусетского университета в Чан . 2 ноября 2013 года . Проверено 5 декабря 2022 г.

[atlas-3] Jump up to: Перейти обратно: ^а ^б ^с «Иммуноэлектронная микроскопия» . Атлас белков человека .

[milne-4] Jump up to: Перейти обратно: ^а ^б Милн, Роберт Г. (1991). Электронная микроскопия возбудителей растений . Шпрингер, Берлин, Гейдельберг. стр. 87–102. дои : 10.1007/978-3-642-75818-8_7 . ISBN 978-3-642-75818-8 . S2CID 80868758 . Проверено 6 декабря 2022 г.

[viral-5] Jump up to: Перейти обратно: ^а ^б ^с Гулати, Ниту М.; Ториан, Удана; Галлахер, Джон Р.; Харрис, Одри К. (июнь 2019 г.). «Иммуноэлектронная микроскопия вирусных антигенов» . Современные протоколы в микробиологии . 53 (1): е86. дои : 10.1002/cpmc.86 . ПМК 6588173 . ПМИД 31219685 .

[6] ttps://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3687530.

[7] Кардонес, Адела Рамби Г.; Холл, Рассел П. (1 января 2019 г.). «63 – Буллезные болезни кожи и слизистых оболочек» . Клиническая иммунология (5-е изд.). Эльзевир. стр. 857–870.д1. ISBN 978-0-7020-6896-6 . Проверено 6 декабря 2022 г.

[8] Хаас, М. (1 января 1997 г.). «Переоценка рутинной электронной микроскопии при исследовании нативных биоптатов почек» . Журнал Американского общества нефрологов . 8 (1): 70–76. дои : 10.1681/ASN.V8170 . ISSN 1046-6673 . ПМИД 9013450 . S2CID 26970189 . Проверено 6 декабря 2022 г.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]