Электронный микроскоп — это микроскоп используется пучок электронов , в котором в качестве источника освещения . Они используют электронную оптику, аналогичную стеклянным линзам оптического светового микроскопа, для управления электронным лучом, например, фокусируя его для создания увеличенных изображений или дифракции электронов картин . Поскольку длина волны электрона может быть в 100 000 раз меньше, чем у видимого света, электронные микроскопы имеют гораздо более высокое разрешение — около 0,1 нм, что сопоставимо с примерно 200 нм для световых микроскопов . [1] Электронный микроскоп может означать:
Дополнительную информацию можно найти по ссылкам выше. Эта статья содержит некоторую общую информацию, в основном о просвечивающих электронных микроскопах.
Репродукция раннего электронного микроскопа, построенного Эрнстом Руской в 1930-х годах.
Многие разработки заложили основу электронной оптики, используемой в микроскопах. [2] Значительным шагом стала работа Герца в 1883 г. [3] который изготовил электронно-лучевую трубку с электростатическим и магнитным отклонением, продемонстрировав манипуляцию направлением электронного луча. Другие фокусировали электроны осевым магнитным полем Эмилем Вихертом в 1899 году. [4] улучшенные катоды с оксидным покрытием, которые производили больше электронов, Артур Венельт в 1905 году. [5] и разработка электромагнитной линзы в 1926 году Гансом Бушем . [6] По словам Денниса Габора , физик Лео Сцилард в 1928 году пытался убедить его построить электронный микроскоп, на который Сцилард подал патент. [7]
До сих пор остается спорным вопрос о том, кто изобрел просвечивающий электронный микроскоп. [8] [9] [10] [11] В 1928 году в Берлинском техническом университете Адольф Матиас (профессор технологии высокого напряжения и электроустановок) назначил Макса Нолля руководить группой исследователей для продвижения исследований в области электронных лучей и электронно-лучевых осциллографов. В состав команды входили несколько аспирантов, в том числе Эрнст Руска . В 1931 году Макс Нолл и Эрнст Руска [12] [13] успешно создал увеличенные изображения сетчатых сеток, расположенных над анодной апертурой. Устройство, копия которого показана на рисунке, использовало две магнитные линзы для достижения большего увеличения, первый электронный микроскоп. (Макс Нолл умер в 1969 году, поэтому не получил доли Нобелевской премии 1986 года за изобретение электронного микроскопа.)
Очевидно, независимой от этих усилий была работа Райнхольда Рюденберга в Schuckert Siemens - . Согласно патентному праву (Патент США № 2058914 [14] и 2070318, [15] оба поданы в 1932 году), он является изобретателем электронного микроскопа, но неясно, когда у него появился работающий инструмент. В 1932 году он заявил в очень краткой статье: [16] что Сименс работал над этим несколько лет до подачи патентов в 1932 году, утверждая, что его усилия были параллельны развитию университета. Он умер в 1961 году, настолько похожий на Макса Нолла, что не имел права на долю Нобелевской премии 1986 года. [17] [18]
В следующем, 1933 году Руска и Нолл построили первый электронный микроскоп, разрешение которого превысило оптический (световой) микроскоп. [19] Четыре года спустя, в 1937 году, компания «Сименс» профинансировала работу Эрнста Руски и Бодо фон Борриса и наняла Хельмута Руску , брата Эрнста, для разработки приложений для микроскопа, особенно для работы с биологическими образцами. [19] [20] Также в 1937 году Манфред фон Арденне изобрел сканирующий электронный микроскоп . [21] В 1938 году компания Siemens выпустила первый коммерческий электронный микроскоп. [22] Первые североамериканские электронные микроскопы были сконструированы в 1930-х годах в Университете штата Вашингтон Андерсоном и Фитцсиммонсом. [23] и в Университете Торонто Эли Франклин Бертон и студенты Сесил Холл, Джеймс Хиллиер и Альберт Пребус. Компания Siemens выпустила трансмиссионный электронный микроскоп (ПЭМ) в 1939 году. [24] Хотя современные трансмиссионные электронные микроскопы способны увеличивать изображение в два миллиона раз, как научные инструменты они остаются такими же, но с улучшенной оптикой.
Первоначальная форма электронного микроскопа, просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ), использует высокого напряжения электронный луч для освещения образца и создания изображения. Электронный луч создается электронной пушкой , причем электроны обычно с напряжением от 40 до 400 кэВ, фокусируются электромагнитными линзами и проходят через образец. Выходя из образца, электронный луч несет информацию о структуре образца, которая увеличивается линзами микроскопа. Пространственное изменение этой информации («изображения») можно наблюдать, проецируя увеличенное электронное изображение на детектор . Например, изображение может просматриваться непосредственно оператором с использованием флуоресцентного экрана просмотра, покрытого люминофором или сцинтилляционным материалом , таким как сульфид цинка . посредством оптической системы линзы или оптоволоконного Люминофор высокого разрешения также может быть соединен с датчиком цифровой камеры световода . Детекторы прямых электронов не имеют сцинтиллятора и подвергаются непосредственному воздействию электронного луча, что устраняет некоторые ограничения камер со сцинтиллятором. [30]
Просвечивающие электронные микроскопы часто используются в режиме дифракции электронов . Преимущества электронной дифракции перед рентгеновской кристаллографией заключаются в том, что образец не обязательно должен представлять собой монокристалл или даже поликристаллический порошок. [ нужна ссылка ]
STEM растрирует сфокусированный зонд на образце. Таким образом, высокое разрешение ПЭМ возможно в STEM. Фокусирующее действие (и аберрации) происходит до того, как электроны попадают на образец в ПЭМ, но уже после этого в ПЭМ. Использование в STEM растрового луча, подобного SEM, упрощает кольцевую визуализацию темного поля и другие аналитические методы, но также означает, что данные изображения собираются последовательно, а не параллельно. [ нужна ссылка ]
Изображение Bacillus subtilis , полученное с помощью электронного микроскопа 1960-х годов.
СЭМ создает изображения путем зондирования образца сфокусированным электронным лучом, который сканируется поперек образца ( растровое сканирование ). Когда электронный луч взаимодействует с образцом, он теряет энергию по различным механизмам. Потерянная энергия преобразуется в альтернативные формы, такие как тепло, эмиссия вторичных электронов с низкой энергией и обратно рассеянных электронов с высокой энергией, световое излучение ( катодолюминесценция ) или рентгеновское излучение, все из которых обеспечивают сигналы, несущие информацию о свойствах образца. поверхность, такие как ее топография и состав. [ нужна ссылка ] Изображение, отображаемое с помощью СЭМ, отображает изменяющуюся интенсивность любого из этих сигналов на изображении в положении, соответствующем положению луча на образце в момент генерации сигнала. На показанном СЭМ-изображении муравья изображение было построено на основе сигналов, создаваемых детектором вторичных электронов - нормальный или традиционный режим визуализации в большинстве СЭМ. [ нужна ссылка ]
Как правило, разрешение изображения SEM ниже, чем у TEM. Однако, поскольку СЭМ отображает поверхность образца, а не его внутреннюю часть, электронам не нужно проходить через образец. Это снижает необходимость в тщательной подготовке образца для его утончения до электронной прозрачности. СЭМ также имеет большую глубину резкости и поэтому может создавать изображения, которые хорошо отображают трехмерную форму поверхности образца. [ нужна ссылка ]
В наиболее распространенных конфигурациях электронные микроскопы создают изображения с одним значением яркости на пиксель, при этом результаты обычно отображаются в оттенках серого . [34] Однако часто эти изображения затем раскрашивают с помощью программного обеспечения для определения характеристик или просто путем ручного редактирования с помощью графического редактора. Это может быть сделано для уточнения структуры или для эстетического эффекта и обычно не добавляет новой информации об образце. [35]
Материалы, которые будут рассматриваться в просвечивающем электронном микроскопе, могут потребовать обработки для получения подходящего образца. Требуемая техника варьируется в зависимости от образца и требуемого анализа:
Встраивание биологических образцов – после обезвоживания ткань для наблюдения в просвечивающем электронном микроскопе встраивают, чтобы ее можно было разделить на секции и подготовить к просмотру. Для этого ткань пропускают через «переходный растворитель», такой как оксид пропилена (эпоксипропан) или ацетон , а затем пропитывают эпоксидной смолой, такой как Araldite , Epon или Durcupan ; [39] ткани также могут быть заделаны непосредственно в водосмешиваемую акриловую смолу . После полимеризации (затвердевания) смолы образец разрезают ультрамикротомией и окрашивают . [ нужна ссылка ]
Заливка, материалы – после заливки в смолу образец обычно шлифуется и полируется до зеркального блеска с использованием сверхтонких абразивов. [ нужна ссылка ]
Замораживание-перелом или замораживание – метод препарирования. [40] [41] [42] особенно полезен для исследования липидных мембран и включенных в них белков в режиме «лицом к лицу». [43] [44] [45] Замораживание разрыва помогает вскрыть мембраны, чтобы можно было увидеть, что находится внутри. На внешней стороне мембраны пекарских дрожжей видны небольшие отверстия, в которых расщепляются белки, иногда в виде небольших колец. Свежую ткань или суспензию клеток быстро замораживают (криофиксация), затем разламывают. [46] (или с помощью микротома) [45] при этом поддерживается температура жидкого азота. Поверхность холодного излома (иногда «травленная» путем повышения температуры примерно до -100 ° C на несколько минут, чтобы позволить небольшому количеству льда возвыситься) [45] затем затеняют напыленной платиной или золотом под средним углом 45° в испарителе с высоким вакуумом. Второй слой углерода, напыляемый перпендикулярно средней плоскости поверхности, часто наносится для улучшения стабильности покрытия-реплики. Образец возвращают к комнатной температуре и давлению, затем чрезвычайно хрупкую «предварительно затененную» металлическую копию поверхности излома отделяют от лежащего под ним биологического материала путем тщательного химического расщепления кислотами, раствором гипохлорита или детергентом SDS . Все еще плавающую копию тщательно промывают от остатков химикатов, осторожно вылавливают на мелкие сетки, сушат, а затем просматривают в ПЭМ. [ нужна ссылка ]
Маркировка реплики замороженного перелома иммунозолотом (FRIL) – метод замораживания-перелома был модифицирован, чтобы обеспечить идентификацию компонентов поверхности перелома с помощью маркировки иммунозолотом. Вместо удаления всей подлежащей ткани размороженной копии на последнем этапе перед просмотром под микроскопом толщина ткани минимизируется во время или после процесса перелома. Тонкий слой ткани остается связанным с металлической копией, поэтому его можно пометить иммунозолотом антителами к выбранным структурам. Тонкий слой исходного образца на реплике с прикрепленным золотом позволяет идентифицировать структуры в плоскости излома. [47] Существуют также родственные методы, которые маркируют поверхность протравленных клеток. [48] и другие варианты маркировки реплик. [49]
Ионно-лучевое фрезерование – разжижение образцов до тех пор, пока они не станут прозрачными для электронов, путем обстрела ионами (обычно аргона ) поверхности под углом и распыления материала с поверхности. Подклассом этого метода является фрезерование сфокусированным ионным лучом , при котором ионы галлия используются для создания электронно-прозрачной мембраны или «ламели» в определенной области образца, например, с помощью устройства внутри микропроцессора или с помощью SEM с фокусированным ионным лучом . Ионно-лучевое фрезерование также можно использовать для полировки поперечного сечения перед анализом материалов, которые трудно подготовить с помощью механической полировки. [ нужна ссылка ]
Негативное окрашивание – суспензии, содержащие наночастицы или мелкодисперсный биологический материал (например, вирусы и бактерии), на короткое время смешиваются с разбавленным раствором электронно-непрозрачного раствора, такого как молибдат аммония, уранилацетат (или формиат) или фосфорновольфрамовая кислота . [ нужна ссылка ] Эту смесь наносят на ЭМ-сетку, предварительно покрытую пластиковой пленкой типа формвара, промокают, затем дают высохнуть. Для достижения наилучших результатов просмотр этого препарата в TEM следует проводить без промедления. Этот метод важен в микробиологии для быстрой, но грубой морфологической идентификации, но также может использоваться в качестве основы для трехмерной реконструкции с высоким разрешением с использованием методологии ЭМ-томографии, когда в качестве опоры используются углеродные пленки. Негативное окрашивание также используется для наблюдения за наночастицами. [ нужна ссылка ]
Разделение – получение тонких срезов образца, полупрозрачных для электронов. Их можно разрезать с помощью ультрамикротомии на ультрамикротоме со стеклянным или алмазным ножом для получения ультратонких срезов толщиной около 60–90 нм. Также используются одноразовые стеклянные ножи, поскольку их можно изготовить в лаборатории и они намного дешевле. Секции также можно создавать на месте путем фрезерования в СЭМ сфокусированным ионным лучом , где секция известна как ламель. [38]
Окрашивание - используются тяжелые металлы, такие как свинец , уран или вольфрам, для рассеивания электронов изображения и, таким образом, создания контраста между различными структурами, поскольку многие (особенно биологические) материалы почти «прозрачны» для электронов (объекты слабой фазы). В биологии образцы можно окрашивать «целым блоком» перед заливкой, а также позже, после секционирования. Обычно тонкие срезы окрашивают в течение нескольких минут водным или спиртовым раствором уранилацетата, а затем водным раствором цитрата свинца. [50]
Ранняя электронная микроскопия биологических образцов часто носила описательный характер и использовала недавно появившееся более высокое разрешение. [51] Это по-прежнему справедливо для различных приложений, таких как диагностическая электронная микроскопия .
Однако электронные микроскопы сейчас часто используются в более сложных рабочих процессах, причем в каждом рабочем процессе обычно используется несколько технологий, позволяющих проводить более сложный и/или более количественный анализ образца. Ниже приведены несколько примеров, но это не следует считать исчерпывающим списком. Выбор рабочего процесса будет сильно зависеть от приложения и требований соответствующих научных вопросов, таких как разрешение, объем, природа целевой молекулы и т. д.
Например, изображения световой и электронной микроскопии одной и той же области образца могут быть наложены друг на друга, чтобы сопоставить данные двух методов. Это обычно используется для предоставления контекстной ЭМ-информации с более высоким разрешением о флуоресцентно-меченной структуре. Это корреляционная световая и электронная микроскопия ( КЛЭМ ) [52] — это один из ряда доступных сейчас корреляционных рабочих процессов. Другим примером является масс-спектрометрия высокого разрешения (ионная микроскопия), которая использовалась для получения корреляционной информации о субклеточной локализации антибиотиков. [53] данные, которые было бы трудно получить другими способами. [ нужна ссылка ]
Первоначальная роль электронных микроскопов в визуализации двумерных срезов (ПЭМ) или поверхности образца (СЭМ со вторичными электронами) также все больше распространялась на глубь образцов. [54] Ранним примером таких рабочих процессов « объемной ЭМ » было простое накопление ПЭМ-изображений последовательных срезов образца. Следующей разработкой стала виртуальная реконструкция объёма толстого среза (200-500 нм) путём обратной проекции набора изображений, снятых под разными углами наклона — ПЭМ-томография . [55]
Чтобы получить объемные наборы данных ЭМ на большей глубине, чем ПЭМ-томография (микрометры или миллиметры по оси z), можно использовать серию изображений, сделанных на глубине образца. Например, ленты последовательных срезов можно визуализировать с помощью ПЭМ, как описано выше, а при использовании более толстых срезов можно использовать последовательную ПЭМ-томографию для увеличения z-разрешения. Совсем недавно изображения, полученные в обратно рассеянных электронах (BSE), можно получить из более крупной серии срезов, собранных на кремниевых пластинах, что известно как матричная томография SEM. [56] [57] Альтернативный подход — использовать BSE SEM для изображения поверхности блока вместо секции после удаления каждой секции. С помощью этого метода ультрамикротом, установленный в камере СЭМ, может повысить автоматизацию рабочего процесса; блок образцов загружается в камеру, и система запрограммирована на непрерывное разрезание и получение изображений через образец. Это известно как SEM с серийным блоком. [58] В родственном методе сфокусированным ионным лучом для удаления срезов вместо ультрамикротома используется фрезерование . В этих методах серийной визуализации выходные данные, по сути, представляют собой последовательность изображений через блок образцов, которые можно последовательно выровнять в цифровом виде и, таким образом, реконструировать в объемный набор ЭМ- данных. Увеличение объема, доступного в этих методах, расширило возможности электронной микроскопии для решения новых вопросов. [54] такие как картирование нейронных связей в мозге, [59] и места мембранного контакта между органеллами. [60]
Электронные микроскопы дороги в изготовлении и обслуживании. Микроскопы, предназначенные для достижения высокого разрешения, должны размещаться в устойчивых зданиях (иногда под землей) со специальными услугами, такими как системы подавления магнитного поля. [61]
Сканирующие электронные микроскопы, работающие в обычном режиме высокого вакуума, обычно визуализируют проводящие образцы; поэтому непроводящие материалы требуют проводящего покрытия (сплав золото/палладий, углерод, осмий и т. д.). Низковольтный режим современных микроскопов позволяет наблюдать непроводящие образцы без покрытия. Непроводящие материалы также можно визуализировать с помощью сканирующего электронного микроскопа с переменным давлением (или окружающей средой). [ нужна ссылка ]
Маленькие стабильные образцы, такие как углеродные нанотрубки , панцири диатомовых водорослей и небольшие минеральные кристаллы (например, асбестовые волокна), не требуют специальной обработки перед исследованием в электронном микроскопе. Образцы гидратированных материалов, в том числе практически все биологические образцы, необходимо готовить различными способами для их стабилизации, уменьшения толщины (сверхтонкие срезы) и повышения электронно-оптического контраста (окрашивание). Эти процессы могут привести к появлению артефактов , но их обычно можно выявить путем сравнения результатов, полученных с использованием совершенно разных методов подготовки образцов. С 1980-х годов анализ криофиксированных и остеклованных образцов стал все чаще использоваться учеными, что еще раз подтверждает обоснованность этого метода. [64] [65] [66]
^ «Масштаб вещей» . Управление фундаментальных энергетических наук Министерства энергетики США. 26 мая 2006 г. Архивировано из оригинала 1 февраля 2010 г. Проверено 31 января 2010 г.
^ Люфт, Дж. Х. (1961). «Усовершенствования методов заливки эпоксидной смолы». Журнал биофизической и биохимической цитологии . Том. 9, нет. 2. п. 409. ПМК 2224998 . ПМИД 13764136 .
^ Мериман Х.Т. и Кафиг Э. (1955). Исследование замороженных образцов, кристаллов льда и роста кристаллов льда методом электронной микроскопии. Военно-морская медицина. Рез. Интс. Репт НМ 000 018.01.09 Том. 13 стр. 529–544
Arc.Ask3.Ru Номер скриншота №: 4205d21d58e6983a66c130b3d5a5d254__1719399480 URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/42/54/4205d21d58e6983a66c130b3d5a5d254.html Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1: Electron microscope - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)