Криогенная электронная томография

На этой схеме показана концепция электронной томографии. Образец отображается в ПЭМ, когда он наклонен под разными углами, в результате чего получается «серия наклонов» 2D-изображений (вверху). Эта серия наклонов затем вычислительно реконструируется в трехмерную «томограмму» (внизу).

Криогенная электронная томография ( криоЭТ ) — это метод визуализации, используемый для реконструкции трехмерных объемов образцов с высоким разрешением (~ 1–4 нм), часто (но не ограничиваясь ими) биологических макромолекул и клеток . CryoET — это специализированное применение трансмиссионной электронной криомикроскопии (CryoTEM), при котором образцы визуализируются под наклоном, в результате чего получается серия 2D-изображений, которые можно объединить для создания 3D-реконструкции, аналогичной компьютерной томографии человеческого тела. В отличие от других методов электронной томографии , изображения образцов получаются в криогенных условиях (< –150 °C). Структура клеточного материала иммобилизуется в некристаллическом стекловидном льду , что позволяет визуализировать его без обезвоживания или химической фиксации , которые в противном случае могли бы разрушить или исказить биологические структуры.

Описание техники

Центральный срез томограммы интактной бактериоворусной клетки Bdellovibrio . Масштабная линейка 200 нм.

В электронной микроскопии (ЭМ) образцы получают в высоком вакууме . Такой вакуум несовместим с биологическими образцами, такими как клетки; вода выкипит, и разница в давлении взорвет ячейку. Поэтому при использовании методов ЭМ при комнатной температуре образцы готовят путем фиксации и обезвоживания. Однако другим подходом к стабилизации биологических образцов является их замораживание ( криоэлектронная микроскопия или криоЭМ). Как и в других методах электронной криомикроскопии, образцы для криоЭТ (обычно небольшие клетки, такие как бактерии , археи или вирусы ) готовятся в стандартной водной среде и наносятся на ЭМ-решетку. Затем сетку погружают в криоген (обычно жидкий этан ) настолько эффективно, что воды молекулы не успевают перестроиться в кристаллическую решетку. Получающееся в результате состояние воды называется «стекловидным льдом» и сохраняет нативные клеточные структуры, такие как липидные мембраны , которые обычно разрушаются при замерзании. Замороженные образцы впоследствии хранятся при температуре жидкого азота при хранении и визуализации, так что вода никогда не нагревается настолько, чтобы кристаллизоваться.

Образцы визуализируются в просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ). Как и в других методах электронной томографии , образец наклоняется под разными углами относительно электронного луча (обычно каждые 1 или 2 градуса, примерно от -60 ° до +60 °), и изображение получается под каждым углом. Эту серию изображений с наклоном затем можно компьютерно реконструировать в трехмерное изображение интересующего объекта. Это называется томограммой или томографической реконструкцией .

с высоким in situ получения изображений

Одним из наиболее часто упоминаемых преимуществ криоЭТ является способность реконструировать трехмерные объемы отдельных объектов (белков, клеток и т. д. ) вместо необходимости создания нескольких копий образца в кристаллографических методах или в других методах криоЭМ визуализации, таких как анализ одиночных частиц . CryoET считается методом in situ при использовании в невозмущенной клетке или другой системе, поскольку замораживание с погружением фиксирует образец на месте достаточно быстро, чтобы вызвать минимальные изменения в положении атомов.

Соображения

Толщина образца

В просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), поскольку электроны сильно взаимодействуют с веществом , образцы должны быть очень тонкими, чтобы не вызывать потемнения образцов из-за многократного упругого рассеяния . Поэтому при криоЭТ толщина образцов обычно составляет менее ~500 нм. По этой причине большинство исследований криоЭТ сосредоточено на очищенных макромолекулярных комплексах , вирусах или небольших клетках, таких как клетки многих видов бактерий и архей. Например, криоЭТ использовался для понимания инкапсуляции наночастиц белковой клетки размером 12 нм внутри вирусоподобных наночастиц размером 60 нм.

(а) Томографический срез сердечного саркомера. Масштабная линейка, 50 нм. (б) Реконструированные нити, отображенные на томограмме. Масштабная линейка, 50 нм (в) Структура толстой нити от М-полосы до С-зоны.

Более крупные клетки и даже ткани можно подготовить для криоЭТ путем истончения, либо путем криосрезов, либо путем сфокусированным ионным лучом измельчения (FIB). При криодеструкции замороженные блоки клеток или тканей разрезаются на тонкие образцы с помощью криомикротома . При измельчении FIB замороженные образцы подвергаются воздействию сфокусированного луча ионов, обычно галлия , которые точно срезают материал сверху и снизу образца, оставляя тонкую пластинку, подходящую для криоЭТ-визуализации.

Отношение сигнал/шум

Для структур, которые присутствуют в нескольких копиях на одной или нескольких томограммах, более высокое разрешение (даже ≤1 нм) можно получить путем усреднения субтомограмм . Подобно анализу одиночных частиц, усреднение субтомограмм вычислительно объединяет изображения идентичных объектов для увеличения отношения сигнал/шум .

Ограничения

Радиационное повреждение

Известно, что электронная микроскопия приводит к более быстрому разложению биологических образцов по сравнению с образцами в материаловедении и физике из-за радиационного повреждения . В большинстве других методов визуализации биологических образцов, основанных на электронной микроскопии, объединение сигналов от множества различных копий образцов было общим способом решения этой проблемы ( например, кристаллография, анализ одиночных частиц). В криоЭТ вместо множества изображений разных копий образцов делается множество изображений одной области. Следовательно, флюенс (количество электронов, переданных на единицу площади) на образец примерно в 2–5 раз больше, чем при анализе одной частицы. Томография материалов, гораздо более устойчивых, обеспечивает значительно более высокое разрешение, чем типичная биологическая визуализация, что позволяет предположить, что радиационное повреждение является самым большим ограничением для криоЭТ биологических образцов.

Разрешение по глубине

Сильное взаимодействие электронов с веществом также приводит к эффекту анизотропного разрешения. Поскольку образец наклоняется во время визуализации, электронный луч взаимодействует с более толстым видимым образцом вдоль оптической оси микроскопа под более высокими углами наклона. На практике углы наклона, превышающие примерно 60–70°, не дают много информации и поэтому не используются. Это приводит к «недостающему клину» информации в окончательной томограмме, что снижает разрешение параллельно электронному лучу.

Схематично показана передача информации для различных схем наклона. Наклоны показаны от −60° до +60° с шагом 3° для 41 общего наклона. Значения серого соответствуют передаче информации при каждом наклоне в соответствии с цветовой картой, показанной слева. Снижение передачи информации объясняется более высокими наклонами, увеличением видимой толщины образца и накоплением радиационных повреждений по всей схеме сбора.

Термин «отсутствующий клин» возник из-за преобразования Фурье томограммы, когда пустой клин очевиден из-за того, что образец не наклонен на 90 °. Отсутствие клина приводит к недостаточному разрешению глубины выборки, поскольку недостающая информация в основном располагается вдоль оси z. Недостающий клин также является проблемой в трехмерной электронной кристаллографии , где ее обычно решают путем слияния нескольких наборов данных, которые перекрывают друг друга, или путем расширения симметрии , где это возможно. Оба этих решения обусловлены природой кристаллографии, поэтому ни одно из них не может быть применено к томографии.

Сегментация

Основным препятствием в области криоЭТ является выявление представляющих интерес структур в сложной клеточной среде. Такие решения, как коррелированная криофлуоресцентная световая микроскопия , и световая микроскопия сверхвысокого разрешения (например, крио-PALM ) может быть интегрирован с CryoET. В этих методах образец, содержащий интересующий белок с флуоресцентной меткой, подвергается глубокой заморозке и сначала визуализируется в световом микроскопе, оснащенном специальным столиком, позволяющим хранить образец при температуре субкристаллизации (< -150 ° C). Определяется местоположение флуоресцентного сигнала, и образец переносится в CryoTEM, где то же место затем визуализируется с высоким разрешением с помощью криоЭТ.

См. также

• Электронная микроскопия
• Электронная томография
• Просвечивающая электронная криомикроскопия
• Просвечивающая электронная микроскопия

Внешние ссылки

• Начало курса криоЭМ (Калифорнийский технологический институт)