Микрокристаллическая электронография
Микрокристаллическая электронография , или MicroED , [1] [2] — это криоЭМ- метод, разработанный лабораторией Гонена в конце 2013 года в исследовательском кампусе Джанелия Медицинского института Говарда Хьюза . MicroED — это форма электронной кристаллографии , в которой тонкие трехмерные кристаллы используются для определения структуры методом дифракции электронов . До этой демонстрации макромолекулярная (белковая) электронная кристаллография в основном использовалась, например, для двумерных кристаллов. [3] [4] Метод является одним из нескольких современных вариантов подходов к определению атомных структур с помощью электронной дифракции, впервые продемонстрированных для положения атомов водорода в кристаллах NH4Cl В. Е. Лашкаревым и И. Д. Усыкиным в 1933 г. [5] который с тех пор используется для поверхностей, [6] посредством прецессионной дифракции электронов , [7] большая часть ранних работ описана в работах Бориса Вайнштейна. [8] и Дуглас Л. Дорсет . [9]
Метод был разработан для определения структуры белков из нанокристаллов, которые из-за своего размера обычно не пригодны для рентгеновской дифракции . [10] Кристаллы размером в одну миллиардную часть размера, необходимого для рентгеновской кристаллографии, могут давать высококачественные данные. [11] Образцы замораживаются гидратированными, как и для всех других методов CryoEM, но вместо использования просвечивающего электронного микроскопа ( ПЭМ ) в режиме визуализации его используют в режиме дифракции с низким воздействием электронов (обычно < 0,01 e). − /Ой 2 /с). Нанокристалл подвергается воздействию дифрагирующего луча и непрерывно вращается. [2] а дифракция снимается на светосильную камеру в виде фильма. [2] Затем данные MicroED обрабатываются с использованием программного обеспечения для рентгеновской кристаллографии для анализа и уточнения структуры. [12] Аппаратное и программное обеспечение, использованное в эксперименте MicroED, является стандартным и широко доступным. [13] [14]
Развитие [ править ]
Дифракция электронов для определения кристаллических структур восходит к самым ранним дням дифракции электронов. О первой успешной демонстрации MicroED сообщила в 2013 году Гонена . лаборатория [1] для структуры лизоцима , классического тестового белка в рентгеновской кристаллографии .
Экспериментальная установка [ править ]
Опубликованы подробные протоколы настройки электронного микроскопа и сбора данных. [15]
Инструментарий [ править ]
Микроскоп [ править ]
Данные MicroED собираются с помощью трансмиссионной электронной (криогенной) микроскопии . Микроскоп может быть оснащен апертурой выбранной площади, но MicroED также может быть изготовлен без апертуры выбранной площади. Хотя сообщалось о некоторых структурах без замораживания, радиационные повреждения иногда сводятся к минимуму и более высокое разрешение достигается за счет использования криоохлаждения даже для небольших молекул. [16]
Детекторы [ править ]
Для сбора данных дифракции электронов в экспериментах MicroED использовались различные детекторы. детекторы, использующие устройства с зарядовой связью (ПЗС) и комплементарную технологию металл-оксид-полупроводник (КМОП) Были использованы . С помощью КМОП-детекторов можно интерпретировать количество отдельных электронов. [17] В последнее время детекторы прямых электронов стали успешно использоваться как в линейном, так и в счетном режимах. [18] [19] В этих примерах подсчет электронов позволил осуществить ab initio фазировку и визуализировать водороды в белках.
Сбор данных [ править ]
Все еще дифракция [ править ]
В первоначальной публикации доказательства концепции на MicroED использовались кристаллы лизоцима. [1] С одного нанокристалла было собрано до 90 градусов данных с дискретными шагами в 1 градус между кадрами. Каждая дифракционная картина была получена при сверхнизкой мощности дозы ~0,01 е. − /Ой 2 /с. Данные с 3-х кристаллов были объединены [20] получить структуру с разрешением 2,9 Å и хорошей статистикой уточнения, позволяющую определять структуру дозочувствительного белка из трехмерных микрокристаллов в криогенных условиях.
Непрерывное вращение [ править ]
MicroED использует непрерывную ротацию во время схемы сбора данных. [2] Здесь кристалл медленно вращается в одном направлении, а дифракция записывается на светосильную камеру в виде фильма. Это привело к некоторому улучшению качества данных и позволило обрабатывать данные с использованием стандартного программного обеспечения для рентгеновской кристаллографии. [2] Непрерывное вращение MicroED улучшает отбор проб обратного пространства. [21]
Обработка данных [ править ]
Опубликованы подробные протоколы обработки данных MicroED. [12] Когда данные MicroED собираются с использованием непрерывного вращения столика, стандартное программное обеспечение для кристаллографии [14] можно использовать.
и другими методами дифракции между MicroED Различия электронов
Другие методы дифракции электронов, которые были разработаны и продемонстрировали свою эффективность, включают автоматическую дифракционную томографию (ADT). [22] и вращательная дифракция электронов (RED [23] ). Эти методы немного отличаются от MicroED: в ADT гониометра для покрытия обратного пространства в сочетании с прецессией луча для уменьшения эффектов динамической дифракции. используются дискретные шаги наклона [22] ADT использует аппаратное и программное обеспечение для прецессионной и сканирующей просвечивающей электронной микроскопии для отслеживания кристаллов. [22] RED выполняется в TEM, но гониометр наклоняется дискретными шагами, а наклон луча используется для заполнения пробелов. [23] Программное обеспечение используется для обработки данных ADT и RED. [23]
Вехи [ править ]
Область применения метода [ править ]
MicroED использовался для определения структуры крупных глобулярных белков. [24] мелкие белки, [2] пептиды, [25] мембранные белки, [26] органические молекулы, [27] [28] и неорганические соединения. [29] Во многих из этих примеров наблюдались водороды и заряженные ионы. [25] [26]
болезни Паркинсона Новые структуры α - синуклеина
Первые структуры, решенные MicroED, были опубликованы в конце 2015 года. [25] Эти структуры состояли из пептидных фрагментов, которые образуют токсичное ядро α-синкулеина , белка, ответственного за болезнь Паркинсона , и приводят к пониманию механизма агрегации токсичных агрегатов. Структуры решены с разрешением 1,4 Å.
белка Новая структура R2lox
Первая новая структура белка, раскрытая с помощью MicroED, была опубликована в 2019 году. [30] Белок представляет собой металлофермент R2-подобную лиганд-связывающую оксидазу (R2lox) из Sulfolobus acidocaldarius. Структура была решена с разрешением 3,0 Å путем молекулярной замены с использованием модели с 35% идентичностью последовательности, построенной на основе ближайшего гомолога с известной структурой.
Ссылки [ править ]
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с Ши, Дэн; Нанненга, Брент Л; Яданза, Мэтью Дж; Гонен, Тамир (19 ноября 2013 г.). «Трехмерная электронная кристаллография белковых микрокристаллов» . электронная жизнь . 2 : e01345. дои : 10.7554/elife.01345 . ISSN 2050-084X . ПМК 3831942 . ПМИД 24252878 .
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с д и ж Нанненга, Брент Л; Ши, Дэн; Лесли, Эндрю Г.В.; Гонен, Тамир (3 августа 2014 г.). «Определение структуры высокого разрешения путем сбора данных непрерывного вращения в MicroED» . Природные методы . 11 (9): 927–930. дои : 10.1038/nmeth.3043 . ISSN 1548-7091 . ПМК 4149488 . ПМИД 25086503 .
- ^ Гонен, Тамир; Слиз, Петр; Кистлер, Йорг; Ченг, Ифань; Уолц, Томас (май 2004 г.). «Мембранные соединения аквапорина-0 обнаруживают структуру закрытой водной поры» . Природа . 429 (6988): 193–197. дои : 10.1038/nature02503 . ISSN 1476-4687 .
- ^ Уолц, Томас; Хираи, Терухиса; Мурата, Казуёси; Хейманн, Дж. Бернар; Мицуока, Каору; Фудзиёси, Ёсинори; Смит, Барбара Л.; Согласен, Питер; Энгель, Андреас (июнь 1997 г.). «Трёхмерная структура аквапорина-1» . Природа . 387 (6633): 624–627. дои : 10.1038/42512 . ISSN 0028-0836 .
- ^ Лашкарев, МЫ; Усыскин И.Д. (1933). «Определение положения ионов водорода в кристаллической решетке NH4Cl методом электронной дифракции» . Журнал физики (на немецком языке). 85 (9–10): 618–630. дои : 10.1007/BF01331003 . ISSN 1434-6001 .
- ^ Такаянаги, К.; Танисиро, Ю.; Такахаши, М.; Такахаши, С. (1 мая 1985 г.). «Структурный анализ Si(111)-7×7 методами СВВ-трансмиссионной электронной дифракции и микроскопии» . Журнал вакуумной науки и технологий A: Вакуум, поверхности и пленки . 3 (3): 1502–1506. дои : 10.1116/1.573160 . ISSN 0734-2101 .
- ^ Винсент, Р.; Мидгли, Пенсильвания (1994). «Двойная коническая балочная система-качалка для измерения интегральных интенсивностей дифракции электронов» . Ультрамикроскопия . 53 (3): 271–282. дои : 10.1016/0304-3991(94)90039-6 .
- ^ ВАЙНШТЕЙН, Б.К. (1964), «Экспериментальные электронографические исследования структуры» , Структурный анализ методом электронной дифракции , Elsevier, стр. 295–390 , получено 1 мая 2024 г.
- ^ Дорсет, ДЛ (31 августа 1995 г.). Структурная электронная кристаллография . Springer Science & Business Media. ISBN 978-0-306-45049-5 .
- ^ Ши, Дэн; Нанненга, Брент Л; де ла Крус, М. Джейсон; Лю, Цзиньян; Сотелл, Стивен; Калеро, Гильермо; Рейес, Фрэнсис Э; Хаттне, Йохан; Гонен, Тамир (май 2016 г.). «Сборник данных MicroED для макромолекулярной кристаллографии» . Протоколы природы . 11 (5): 895–904. дои : 10.1038/нпрот.2016.046 . ISSN 1754-2189 . ПМЦ 5357465 . ПМИД 27077331 .
- ^ де ла Крус, М. Джейсон; Хаттне, Йохан; Ши, Дэн; Зайдлер, Пол; Родригес, Хосе; Рейес, Фрэнсис Э; Савая, Майкл Р.; Кашио, Дуилио; Вайс, Саймон С. (2017). «Структуры атомного разрешения из фрагментированных белковых кристаллов криоЭМ-методом MicroED» . Природные методы . 14 (4): 399–402. дои : 10.1038/nmeth.4178 . ISSN 1548-7091 . ПМК 5376236 . ПМИД 28192420 .
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б Хаттне, Йохан; Рейес, Фрэнсис Э.; Нанненга, Брент Л.; Ши, Дэн; де ла Крус, М. Джейсон; Лесли, Эндрю Г.В.; Гонен, Тамир (01 июля 2015 г.). «Сбор и обработка данных MicroED» . Acta Crystallographica Раздел А. 71 (4): 353–360. дои : 10.1107/s2053273315010669 . ISSN 2053-2733 . ПМЦ 4487423 . ПМИД 26131894 .
- ^ Зацепин, Надя А; Ли, Чуфэн; Коласурд, Пейдж; Нанненга, Брент Л. (октябрь 2019 г.). «Взаимодополняемость серийной фемтосекундной кристаллографии и MicroED для определения структуры микрокристаллов» . Современное мнение в области структурной биологии . 58 : 286–293. дои : 10.1016/j.sbi.2019.06.004 . ПМК 6778504 . ПМИД 31345629 .
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б Нанненга, Брент Л.; Гонен, Тамир (май 2019 г.). «Крио-ЭМ метод микрокристаллической электронографии (MicroED)» . Природные методы . 16 (5): 369–379. дои : 10.1038/s41592-019-0395-x . ISSN 1548-7091 . ПМК 6568260 . ПМИД 31040436 .
- ^ Ши, Дэн; Нанненга, Брент Л; де ла Крус, М. Джейсон; Лю, Цзиньян; Сотелл, Стивен; Калеро, Гильермо; Рейес, Фрэнсис Э; Хаттне, Йохан; Гонен, Тамир (14 апреля 2016 г.). «Сборник данных MicroED для макромолекулярной кристаллографии» . Протоколы природы . 11 (5): 895–904. дои : 10.1038/нпрот.2016.046 . ISSN 1754-2189 . ПМЦ 5357465 . ПМИД 27077331 .
- ^ Кристенсен, Йеппе; Хортон, Питер Н.; Бери, Чарльз С.; Дикерсон, Джошуа Л.; Таберман, Хелена; Гарман, Элспет Ф.; Коулз, Саймон Дж. (01 июля 2019 г.). «Радиационное повреждение в кристаллографии малых молекул: факт, а не вымысел» . МСКРЖ . 6 (4): 703–713. дои : 10.1107/S2052252519006948 . ISSN 2052-2525 . ПМК 6608633 . ПМИД 31316814 .
- ^ См. также https://www.gatan.com/ccd-vs-cmos и https://www.gatan.com/techniques/imaging .
- ^ Мартынович, Майкл В.; Клабберс, Макс ТБ; Хаттне, Йохан; Гонен, Тамир (июнь 2022 г.). «Фазировка макромолекулярных структур ab initio с использованием данных электронного счета MicroED» . Природные методы . 19 (6): 724–729. дои : 10.1038/s41592-022-01485-4 . ISSN 1548-7091 . ПМЦ 9184278 . ПМИД 35637302 .
- ^ Клабберс, Макс ТБ; Мартынович, Майкл В.; Хаттне, Йохан; Гонен, Тамир (2022). «Водороды и сети водородных связей в макромолекулярных данных MicroED» . Журнал структурной биологии: X. 6 : 100078. дои : 10.1016/j.yjsbx.2022.100078 . ПМЦ 9731847 . ПМИД 36507068 .
- ^ Ши, Дэн; Нанненга, Брент Л; Яданза, Мэтью Дж; Гонен, Тамир (19 ноября 2013 г.). «Трехмерная электронная кристаллография белковых микрокристаллов» . электронная жизнь . 2 : e01345. doi : 10.7554/eLife.01345 . ISSN 2050-084X . ПМК 3831942 . ПМИД 24252878 .
- ^ Нанненга, Брент Л; Ши, Дэн; Лесли, Эндрю Г.В.; Гонен, Тамир (сентябрь 2014 г.). «Определение структуры высокого разрешения путем сбора данных непрерывного вращения в MicroED» . Природные методы . 11 (9): 927–930. дои : 10.1038/nmeth.3043 . ISSN 1548-7091 . ПМК 4149488 . ПМИД 25086503 .
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с Мугнайоли, Э.; Горелик Т.; Колб, У. (2009). « Решение структуры «Ab initio» на основе данных электронографии, полученных с помощью комбинации автоматизированной дифракционной томографии и метода прецессии». Ультрамикроскопия . 109 (6): 758–765. дои : 10.1016/j.ultramic.2009.01.011 . ISSN 0304-3991 . ПМИД 19269095 .
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с Ван, Вэй; Сунь, Цзюньлян; Су, Цзе; Ховмеллер, Свен; Цзоу, Сяодун (15 ноября 2013 г.). «Трёхмерная вращательная дифракция электронов: программное обеспечениеRED для автоматизированного сбора и обработки данных» . Журнал прикладной кристаллографии . 46 (6): 1863–1873. дои : 10.1107/s0021889813027714 . ISSN 0021-8898 . ПМЦ 3831301 . ПМИД 24282334 .
- ^ Нанненга, Брент Л; Ши, Дэн; Хаттне, Йохан; Рейес, Фрэнсис Э; Гонен, Тамир (10 октября 2014 г.). «Структура каталазы, определенная с помощью MicroED» . электронная жизнь . 3 : e03600. дои : 10.7554/elife.03600 . ISSN 2050-084X . ПМЦ 4359365 . ПМИД 25303172 .
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с Родригес, JA; Иванова, М.; Савая, MR; Касио, Д.; Рейес, Ф.; Ши, Д.; Джонсон, Л.; Гюнтер, Э.; Сангван, С. (9 сентября 2015 г.). «Структура MicroED сегмента GVVHGVTTVA из семейного мутанта A53T белка болезни Паркинсона, остатки альфа-синуклеина 47-56». дои : 10.2210/pdb4znn/pdb .
{{cite journal}}: Для цитирования журнала требуется|journal=( помощь ) - ^ Jump up to: Перейти обратно: а б Лю, С.; Гонен, Т. (12 сентября 2018 г.). «Структура MicroED ионного канала NaK демонстрирует процесс разделения Na + в фильтр селективности». дои : 10.2210/pdb6cpv/pdb . S2CID 240183721 .
{{cite journal}}: Для цитирования журнала требуется|journal=( помощь ) - ^ Галлахер-Джонс, Маркус; Глинн, Калина; Бойер, Дэвид Р.; Мартынович, Майкл В.; Эрнандес, Эвелин; Мяо, Дженнифер; Зи, Чи-Те; Новикова Ирина Владимировна; Гольдшмидт, Лукаш (15 января 2018 г.). «Субангстремовая крио-ЭМ структура протофибриллы приона обнаруживает полярную застежку» . Структурная и молекулярная биология природы . 25 (2): 131–134. дои : 10.1038/s41594-017-0018-0 . ISSN 1545-9993 . ПМК 6170007 . ПМИД 29335561 .
- ^ Джонс, Кристофер; Мартынович, М; Хаттне, Йохан; Фултон, Тайлер Дж.; Штольц, Брайан М.; Родригес, Хосе А.; Нельсон, Осия; Гонен, Тамир (2018). «КриоЭМ-метод MicroED как мощный инструмент для определения структуры малых молекул» (PDF) . Центральная научная служба ACS . 4 (11): 1587–1592. дои : 10.26434/chemrxiv.7215332.v1 . ПМК 6276044 . ПМИД 30555912 .
- ^ Вергара, Сандра; Люкс, Дилан А.; Мартынович, Майкл В.; Сантьяго, Улисес; Пласенсия-Вилла, Германия; Вайс, Саймон С.; де ла Крус, М. Джейсон; Блэк, Дэвид М.; Альварес, Маркос М. (31 октября 2017 г.). «Структура MicroED Au146 (p-MBA) 57 при субатомном разрешении демонстрирует двойниковый кластер FCC» . Журнал физической химии . 8 (22): 5523–5530. doi : 10.1021/acs.jpclett.7b02621 . ISSN 1948-7185 . ПМК 5769702 . ПМИД 29072840 .
- ^ Сюй, Хунъи; Лебретт, Хьюго; Клабберс, Макс ТБ; Чжао, Цзинцзин; Гриз, Джулия Дж.; Цзоу, Сяодун; Хёгбом, Мартин (7 августа 2019 г.). «Раскрытие новой структуры белка R2lox методом микрокристаллической электронной дифракции» . Достижения науки . 5 (8): eaax4621. дои : 10.1126/sciadv.aax4621 . ПМЦ 6685719 . ПМИД 31457106 .
