Микротом
Микротом срезы (от греческого mikros , что означает «маленький», и temnein , что означает «разрезать») — это режущий инструмент, используемый для изготовления чрезвычайно тонких срезов материала, известных как , причем этот процесс называется микросрезами . Важное значение для науки : микротомы используются в микроскопии для подготовки образцов для наблюдения в проходящем свете или электронном излучении.
В микротомах используются стальные , стеклянные или алмазные лезвия в зависимости от нарезаемого образца и желаемой толщины разрезаемых срезов. Стальные лезвия используются для подготовки гистологических срезов тканей животных и растений для световой микроскопии . Стеклянные ножи используются для нарезки срезов для световой микроскопии и для нарезки очень тонких срезов для электронной микроскопии . Алмазные ножи промышленного класса используются для нарезки твердых материалов, таких как кости , зубы и твердые растительные вещества, как для световой, так и для электронной микроскопии. ювелирного качества Алмазные ножи также используются для нарезки тонких срезов для электронной микроскопии.
Микротомия — это метод подготовки тонких срезов таких материалов, как кости, минералы и зубы, а также альтернатива электрополировке и ионному фрезерованию . Срезы микротома можно сделать достаточно тонкими, чтобы можно было разрезать человеческий волос по ширине, с толщиной среза от 50 нм до 100 мкм .
История [ править ]
На заре развития светового микроскопа срезы растений и животных готовили вручную с помощью бритвенных лезвий. Было обнаружено, что для наблюдения за структурой наблюдаемого образца важно делать чистые воспроизводимые разрезы порядка 100 мкм, через которые можно пропускать свет. Это позволило наблюдать образцы с помощью световых микроскопов в просвечивающем режиме.
Одно из первых приспособлений для приготовления таких отрубов было изобретено в 1770 году Джорджем Адамсом-младшим (1750–1795) и далее развито Александром Каммингсом . [2] Устройство имело ручное управление, образец удерживался в цилиндре, а секции создавались из верхней части образца с помощью ручной рукоятки. [1] [3]
В 1835 году Эндрю Причард разработал модель на основе стола, которая позволяла изолировать вибрацию, прикрепив устройство к столу, отделив оператора от ножа. [4]
Иногда приписывание изобретения микротома приписывают анатому Вильгельму Хису-старшему (1865 г.). [5] [6] В своей книге «Beschreibung eines Mikrotoms» (по-немецки «Описание микротома ») Вильгельм писал:
Аппарат обеспечил точность в работе, благодаря которой я могу достичь участков, которые я не могу создать вручную. А именно это позволило добиться возможности получения непрерывных участков объектов в ходе исследования.
Другие источники также приписывают разработку чешскому физиологу Яну Евангелисте Пуркине . [7] В нескольких источниках модель Пуркина описывается как первая в практическом использовании. [8] [9]
Неясность происхождения микротома связана с тем, что первые микротомы были просто режущими аппаратами, а фаза развития ранних устройств практически не документирована.
В конце 1800-х годов создание очень тонких и постоянно тонких образцов с помощью микротомии вместе с избирательным окрашиванием важных клеточных компонентов или молекул позволило визуализировать детали микроскопа. [10] [11]
Сегодня большинство микротомов представляют собой ножевую конструкцию со сменным ножом, держателем образца и механизмом продвижения. В большинстве устройств резка образца начинается с перемещения образца над ножом, при этом механизм продвижения автоматически перемещается вперед, так что можно сделать следующий разрез выбранной толщины. Толщина секции контролируется механизмом регулировки, обеспечивающим точный контроль.
Приложения [ править ]
Наиболее распространенными применениями микротомов являются:
- Традиционный метод гистологии : ткани фиксируются, обезвоживаются, очищаются и заливаются расплавленным парафином , который при охлаждении образует твердый блок. Затем ткань разрезают на микротоме толщиной от 2 до 50 мкм. Оттуда ткань можно поместить на предметное стекло микроскопа, окрасить соответствующим водным красителем (красками) после удаления парафина и исследовать с помощью светового микроскопа. [12]
- Процедура замораживания срезов : богатые водой ткани затвердевают замораживанием и в замороженном состоянии разрезают с помощью замораживающего микротома или микротома- криостата ; срезы окрашивают и исследуют под световым микроскопом. Этот метод намного быстрее, чем традиционная гистология (5 минут вместо 16 часов), и используется в сочетании с медицинскими процедурами для быстрой постановки диагноза. Криосрезы также можно использовать в иммуногистохимии, поскольку замораживание ткани останавливает деградацию ткани быстрее, чем использование фиксатора , и не так сильно изменяет и маскирует ее химический состав.
- Метод электронной микроскопии : после заливки тканей в эпоксидную смолу микротом, оснащенный стеклянным или алмазным ножом ювелирного качества, используется для разрезания очень тонких срезов (обычно от 60 до 100 нанометров). Срезы окрашивают водным раствором соответствующей соли тяжелого металла и исследуют в просвечивающем электронном микроскопе . Этот инструмент часто называют ультрамикротомом . Ультрамикротом также используется со стеклянным ножом или алмазным ножом промышленного класса для разрезания срезов перед изготовлением тонких срезов. Эти срезы обычно имеют толщину от 0,5 до 1 мкм, их монтируют на предметное стекло и окрашивают для определения интересующих областей под световым микроскопом перед получением тонких срезов для ПЭМ. Тонкие срезы для ТЭМ часто делают алмазным ножом ювелирного качества. В дополнение к традиционным методам ТЭМ ультрамикротомы все чаще устанавливаются внутри камеры СЭМ, поэтому поверхность лицевой поверхности блока можно визуализировать, а затем удалить с помощью микротома, чтобы открыть следующую поверхность для визуализации. Эта техника называется серийная блочная сканирующая электронная микроскопия (СБФЭМ).
- Техника ботанической микротомии: для твердых материалов, таких как дерево, кость и кожа, требуется санный микротом . Эти микротомы имеют более тяжелые лезвия и не могут резать так же тонко, как обычный микротом.
- Спектроскопия (особенно FTIR или инфракрасная спектроскопия ). Техника: необходимы тонкие полимерные срезы, чтобы инфракрасный луч мог проникнуть в исследуемый образец. Толщина образцов составляет от 20 до 100 мкм. Это нормально. Для более детального анализа гораздо меньших участков тонкого среза FTIR- микроскопию для проверки образцов. можно использовать
Последней разработкой является лазерный микротом , который разрезает целевой образец фемтосекундным лазером вместо механического ножа. Этот метод является бесконтактным и не требует техники подготовки проб. Лазерный микротом способен разрезать практически любую ткань в ее естественном состоянии. В зависимости от обрабатываемого материала возможна толщина среза от 10 до 100 мкм.
Интервалы секционирования можно разделить главным образом на:
- Серийное секционирование: получение непрерывной ленты срезов из парафинового блока и использование всех для слайдов.
- Ступенчатые разрезы: собраны на заданных глубинах в блоке.
Типы [ править ]
Сани [ править ]
Санный микротом — это устройство, в котором образец помещается в фиксированный держатель (челнок), который затем перемещается вперед и назад по ножу. В современных микротомах салазки расположены на линейном подшипнике, конструкция которого позволяет микротому легко разрезать множество грубых срезов. [13] Регулируя углы между образцом и ножом микротома, можно уменьшить давление, оказываемое на образец во время разреза. [13] Типичным применением микротома такой конструкции является подготовка больших образцов, например, залитых в парафин для биологических препаратов. Типичная толщина среза, достижимая на санном микротоме, составляет от 1 до 60 мкм.
Роторный [ править ]
Этот прибор представляет собой обычную конструкцию микротома. Это устройство работает с поэтапным вращательным действием, так что фактическое резание является частью вращательного движения. В ротационном микротоме нож обычно фиксируется в вертикальном положении. [14]
На рисунке слева поясняется принцип разреза. За счет движения держателя образца образец разрезается ножом из положения 1 в положение 2, после чего свежий срез остается на ноже. В высшей точке вращательного движения держатель образца выдвигается на ту же толщину, что и срез, который необходимо изготовить, позволяя изготовить следующий срез.
Маховик многих микротомов можно управлять вручную. Преимущество этого метода состоит в том, что можно выполнить чистый разрез, поскольку относительно большая масса маховика предотвращает остановку образца во время его разрезания. В новых моделях маховик часто встроен в корпус микротома. Типичная толщина среза ротационного микротома составляет от 1 до 60 мкм. Для твердых материалов, таких как образцы, залитые синтетической смолой, такая конструкция микротома позволяет получать хорошие «полутонкие» срезы толщиной всего 0,5 мкм.
Криомикротом [ править ]
Для резки замороженных образцов многие ротационные микротомы можно адаптировать для резки в камере с жидким азотом в так называемой криомикротомной установке. Пониженная температура позволяет повысить твердость образца, например, за счет стеклования, что позволяет готовить полутонкие образцы. [13] Однако температуру образца и температуру ножа необходимо контролировать, чтобы оптимизировать полученную толщину образца.
Ультрамикротом [ править ]
Ультрамикротом — основной инструмент ультрамикротомии . Он позволяет готовить очень тонкие срезы, при этом устройство работает так же, как ротационный микротом, но с очень жесткими допусками на механическую конструкцию. Благодаря тщательно продуманной механической конструкции линейное тепловое расширение крепления используется для обеспечения очень точного контроля толщины. [13]
Эти чрезвычайно тонкие срезы важны для использования с просвечивающим электронным микроскопом (ПЭМ) и серийной сканирующей электронной микроскопией (SBFSEM), а иногда также важны для светооптической микроскопии. [14] Типичная толщина этих срезов составляет от 40 до 100 нм для просвечивающей электронной микроскопии и часто от 30 до 50 нм для SBFSEM. Более толстые срезы толщиной до 500 нм также берутся для специализированных приложений TEM или для срезов для исследования с помощью световой микроскопии, чтобы выбрать область для окончательных тонких срезов. алмазные ножи С ультрамикротомами используются (предпочтительно) и стеклянные ножи. Чтобы собрать срезы, их помещают на поверхность жидкости во время разрезания и осторожно помещают на сетку, подходящую для просмотра образцов ПЭМ. Толщину среза можно оценить по цветам тонкопленочной интерференции отраженного света, которые видны из-за чрезвычайно малой толщины образца. [15]
Вибрация [ править ]
Вибрирующий микротом работает путем резки с помощью вибрирующего лезвия, что позволяет производить результирующий разрез с меньшим давлением, чем требовалось бы для неподвижного лезвия. Вибрирующий микротом обычно используется для сложных биологических образцов. [13] Толщина среза обычно составляет около 30–500 мкм для живой ткани и 10–500 мкм для фиксированной ткани. [16]
Пила [ править ]
Пильный микротом специально предназначен для твердых материалов, таких как зубы или кости. Микротом этого типа имеет утопленную вращающуюся пилу, которая разрезает образец. Минимальная толщина среза составляет около 30 мкм и может быть выполнена для сравнительно больших образцов. [13]
Лазер [ править ]
Лазерный . микротом – это инструмент для бесконтактного нарезки срезов [17] Предварительная подготовка образца путем заливки, замораживания или химической фиксации не требуется, что сводит к минимуму артефакты, возникающие в результате методов подготовки. В качестве альтернативы эту конструкцию микротома можно также использовать для очень твердых материалов, таких как кости или зубы, а также некоторых видов керамики. В зависимости от свойств материала образца достижимая толщина составляет от 10 до 100 мкм.
Устройство работает за счет режущего действия инфракрасного лазера. Поскольку лазер излучает излучение в ближнем инфракрасном диапазоне, в этом режиме длины волны лазер может взаимодействовать с биологическими материалами. Благодаря четкой фокусировке зонда внутри образца создается фокус очень высокой интенсивности, до ТВт /см. 2 , может быть достигнуто. Благодаря нелинейному взаимодействию оптического проникновения в фокальной области происходит разделение материала в процессе, известном как фоторазрушение. Ограничивая длительность лазерного импульса фемтосекундным диапазоном, энергия, расходуемая в целевой области, точно контролируется, тем самым ограничивая зону взаимодействия разреза до менее микрометра. За пределами этой зоны время воздействия сверхкороткого луча приводит к минимальному или полному отсутствию термического повреждения остальной части образца.
Лазерное излучение направляется на быстро сканирующую оптическую систему на основе зеркала, которая обеспечивает трехмерное позиционирование точки пересечения луча, одновременно обеспечивая перемещение луча в желаемую интересующую область. Сочетание высокой мощности и высокой скорости растра позволяет сканеру за короткое время вырезать большие площади образца. На лазерном микротоме также возможна лазерная микродиссекция внутренних участков тканей, клеточных структур и других мелких образований.
Ножи [ править ]
Выбор профиля лезвия ножа микротома зависит от материала и подготовки образцов, а также от окончательных требований к образцам (например, толщины и качества среза).
Типы дизайна и кроя [ править ]
Как правило, ножи характеризуются профилем лезвия ножа, который подпадает под категории плоско-вогнутых, клиновидных или долотообразных конструкций.
Плоские вогнутые ножи микротома чрезвычайно острые, но при этом очень деликатные и поэтому используются только с очень мягкими образцами. [14] Ножи с клиновым профилем несколько более стабильны и находят применение при обработке материалов средней твердости, например, при резке эпоксидной смолы или криогенных образцов. Наконец, профиль долота с тупой кромкой повышает устойчивость ножа, но при этом для выполнения разреза требуется значительно большее усилие.
Для ультрамикротомов требуются стеклянные и алмазные ножи, поэтому ширина среза лезвия составляет порядка нескольких миллиметров и, следовательно, значительно меньше, чем у классических ножей для микротомов. Стеклянные ножи обычно изготавливаются путем разрушения стеклянных брусков с использованием специальных устройств для разрушения «ножевиков». Стеклянные ножи можно использовать для первоначальной подготовки проб, даже если для окончательного разрезания можно использовать алмазные ножи. Стеклянные ножи обычно имеют небольшие желоба, сделанные из пластиковой ленты, которые заполняются водой, чтобы образец мог плавать для последующего сбора. [13] Алмазные лезвия могут быть встроены в такой существующий желоб, что позволяет использовать тот же метод сбора.
Разделение [ править ]
Перед разрезанием на микротоме биологические материалы обычно помещают в более жесткий фиксатор в процессе, известном как заливка. Это достигается за счет притока жидкого вещества вокруг образца, такого как парафин (воск) или эпоксидная смола, которое помещается в форму и позже затвердевает, образуя «блок», который легко разрезать.
Склонение представляет собой угол контакта между вертикалью образца и лезвием ножа. Если лезвие ножа расположено под прямым углом (наклон = 90), рез производится напрямую с использованием режима давления, и поэтому силы пропорционально больше. Однако если нож наклонен, относительное движение ножа становится все более параллельным движению образца, что позволяет осуществлять разрезание. Такое поведение очень важно для больших или твердых образцов.
Наклон ножа — это угол между торцом ножа и образцом. Для оптимального результата этот угол должен быть выбран соответствующим образом. Оптимальный угол зависит от геометрии ножа, скорости резания и многих других параметров. Если угол отрегулирован на ноль, рез ножа часто может стать неравномерным, и для сглаживания этого необходимо использовать новое положение ножа.
Если угол слишком велик, образец может смяться, а нож может вызвать периодические изменения толщины среза. Дальнейшее увеличение угла до слишком большого значения может привести к повреждению самого лезвия ножа.
См. также [ править ]
Ссылки [ править ]
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б Хилл, Джон (1770). Строительство из дерева с самого начала его роста; Объяснено с помощью микроскопа и доказано экспериментами в самых разных видах . Лондон: Автор. стр. 5–11 , фото I.
- ^ Кекетт, Джон (1848). Практический трактат по использованию микроскопа . Лондон: Ипполит Байьер. стр. 306 , Глава XII (Микротомы и микротомные ножи).
- ^ Аноним (1910). «Микротом восемнадцатого века» . Журнал Королевского микроскопического общества . Оксфорд, Англия: Королевское микроскопическое общество: 779–782.
- ^ Гилберт Морган Смит: Развитие ботанической микротехники. В: Труды Американского микроскопического общества 34, Nr. 2. 1915, С. 71–129, ( PDF-версия статьи) JSTOR 3221940. дои : 10.2307/3221940
- ^ «Вильгельм Хис» . Британская энциклопедия Интернет. Британская энциклопедия . Проверено 24 марта 2009 г.
- ^ Лукас М., Кларк П., Таббс Р.С., Капос Т., Тротц М. (2008). «Его семья и их вклад в кардиологию». Международный журнал кардиологии . 123 (2): 75–78. дои : 10.1016/j.ijcard.2006.12.070 . ISSN 0167-5273 . ПМИД 17433467 .
- ^ «Гистология» . MSN Энкарта . Архивировано из оригинала 25 апреля 2009 года . Проверено 18 марта 2009 г.
- ^ Детлев Гантен: Справочник по молекулярной медицине , Springer, ISBN 3-540-64552-7 , ( Google-Книги )
- ^ Вернер Герабек, Бернхард Д. Хааге, Гундольф Кейл, Вольфганг Вегнер (2005): Энциклопедия истории медицины, Вальтер де Грюйтер, ISBN 3-11-015714-4 , ( Google-Книги )
- ^ Эрнст Майр (2002). Развитие биологической мысли. (Эволюция биологической мысли) . Спрингер. ISBN 978-3-540-43213-5 .
- ^ Вернер Линс, Вернер Линб, Йохен Фангханель: Гистология: цитология, общая гистология, микроскопическая анатомия. (Гистология: цитология, общая гистология, микроскопическая анатомия) Вальтер де Грюйтер, 1998 г., ISBN 3-11-014032-2 ( Google-Книги )
- ^ Бэнкрофт, Джон; Стивенс, Алан, ред. (1982). Теория и практика гистологических методов (2-е изд.). Лонгман Групп Лимитед.
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с д и ж г Гудрун Ланг (2006). Гистотехника. Практический учебник по биомедицинскому анализу. (Гистология: практический учебник аналитической биомедицины) . Спрингер, Вена/Нью-Йорк. ISBN 978-3-211-33141-5 .
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с Клаус Хенкель: Резка с помощью микротома. Архивировано 10 ноября 2009 г. в Wayback Machine . Микробиологическая ассоциация Мюнхена e. В., 2006, по состоянию на 15 февраля 2009 г.
- ^ Пичи Ли Д. (1958). «Тонкие срезы: исследование толщины срезов и физического искажения, возникающего во время микротомии» (PDF) . J Biophys Biochem Цитол . 4 (3): 233–242. дои : 10.1083/jcb.4.3.233 . ПМК 2224471 . ПМИД 13549493 .
- ^ Крумдик, Карлос Л. (январь 2013 г.). «Разработка микротома живых тканей: размышления машиниста-любителя» . Ксенобиотика . 43 (1): 2–7. дои : 10.3109/00498254.2012.724727 . ISSN 0049-8254 . ПМИД 23009272 . S2CID 6108637 .
- ^ Хольгер Любачовски, 2007: Лазерная микротомия , WILEY-VCH Verlag GmbH, Биофотоника, S. 49–51 ( PDF заархивировано 19 июля 2011 г. в Wayback Machine ). два : 10.1002/opph.201190252
Внешние ссылки [ править ]
- . Британская энциклопедия (11-е изд.). 1911.
| Посадка деревьев , облесение |
|  |
|---|---|---|
| Измерение | ||
| Пожаротушение | ||
| Топоры | ||
| Пилы | ||
| Ведение журнала | ||
| Другой | ||
