Криофиксация
Криофиксация — это метод фиксации или стабилизации биологических материалов как первый этап подготовки образцов для электронной и криоэлектронной микроскопии . [1] Типичные образцы для криофиксации включают небольшие образцы растительных или животных тканей , клеточные суспензии микроорганизмов или культивируемых клеток , суспензии вирусов или вирусных капсидов и образцы очищенных макромолекул , особенно белков . [2] [3]
Виды криофиксации: вымораживание-сушка, вымораживание-замещение и вымораживание-травление. [ нужна ссылка ] [ нужны разъяснения ]
Погружная заморозка
[ редактировать ]Этот метод включает сверхбыстрое охлаждение небольших образцов тканей или клеток до температуры жидкого азота (-196 ° C) или ниже, остановку любого движения и метаболической активности и сохранение внутренней структуры путем замораживания всех жидких фаз в твердом состоянии. Обычно образец погружают в жидкий азот или жидкий этан или жидкий пропан в контейнере, охлаждаемом жидким азотом. Конечная цель – заморозить образец так быстро (при 10 4 до 10 6 К в секунду), что кристаллы льда образца не могут образовываться или не могут вырасти настолько большими, чтобы вызвать повреждение ультраструктуры . Формирование образцов, содержащих образцы в аморфном льду, является « Святым Граалем » биологической криомикроскопии. [ нужна ссылка ]
На практике очень трудно достичь достаточно высоких скоростей охлаждения для получения аморфного льда более нескольких микрометров в образцах толщиной . Для этого образец погружают в жидкий азот при температуре его кипения (-196 °С). [4] не всегда замораживает образец достаточно быстро по нескольким причинам. Во-первых, жидкий азот быстро кипит вокруг образца, образуя пленку изолирующего N.
2 газа, который замедляет передачу тепла к криогенной жидкости, известный как эффект Лейденфроста . Скорость охлаждения можно улучшить, откачивая жидкий азот с помощью пластинчато-роторного вакуумного насоса в течение нескольких десятков секунд перед погружением в него образца. Это снижает температуру жидкого азота ниже точки кипения, так что, когда образец погружается в него, он плотно окутывает образец на короткий период времени и более эффективно отводит от него тепло. Еще более быстрое охлаждение можно получить, погрузив образцы в жидкий пропан или этан (этан оказался более эффективным). [5] охлаждены очень близко к температуре плавления с использованием жидкого азота. [6] или ударив образцом о тщательно отполированные металлические поверхности из меди или серебра , охлаждаемые жидким азотом . [7] Во-вторых, два свойства самой воды препятствуют быстрой криофиксации крупных образцов. [8] Теплопроводность металлов льда очень низка по сравнению с теплопроводностью , а вода при замерзании выделяет скрытую теплоту плавления , предотвращая быстрое охлаждение образцов толщиной более нескольких микрометров.
Замораживание под высоким давлением
[ редактировать ]Высокое давление помогает предотвратить образование крупных кристаллов льда. В технологии быстрой заморозки под собственным давлением (SPRF), в которой можно использовать множество различных криогенов, в последнее время рекламируется как привлекательная и недорогая альтернатива заморозке под высоким давлением (HPF). [9] Холодный азот под давлением заменяет этанол при температуре примерно 123К. Теплый этанол затем выбрасывается замерзающим LN2 и, скорее всего, образует смесь этанола и азота, которая постепенно становится все холоднее и холоднее. [10]
Сублимационная сушка
[ редактировать ]время сушки сокращается на 30% При правильной сублимационной сушке . [11]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Пилхофер, Мартин; Ладинский, Марк С.; Макдауэлл, Аласдер В.; Дженсен, Грант Дж. (2010). Бактериальный ТЭМ . Методы клеточной биологии. Том. 96. стр. 21–45. дои : 10.1016/S0091-679X(10)96002-0 . ISBN 9780123810076 . ISSN 0091-679X . ПМИД 20869517 .
- ^ Эхлин П. (1992). Низкотемпературная микроскопия и анализ . Нью-Йорк: Издательская корпорация Plenum.
- ^ Дюбоше Дж., Адриан М., Чанг Дж.Дж., Хомо Дж.К., Лепо Дж., Макдауэлл А.В., Шульц П. (1988). «Криоэлектронная микроскопия остеклованных образцов» (PDF) . Ежеквартальные обзоры биофизики . 21 (2): 129–228. дои : 10.1017/s0033583500004297 . ПМИД 3043536 . S2CID 2741633 .
- ^ Баттерсби Б.Дж., Шарп Дж.К., Уэбб Р.И., Барнс Г.Т. (1994). «Витрификация водных суспензий в контролируемой среде для электронной микроскопии: улучшенное устройство погружного охлаждения». Журнал микроскопии . 176 (2): 110–120. дои : 10.1111/j.1365-2818.1994.tb03505.x . S2CID 95926972 .
- ^ Райан, Кейт П. (1992). «Криофиксация тканей для электронной микроскопии: обзор методов погружного охлаждения» (PDF) . Сканировать. Микроск . 6 (3): 715–743.
- ^ Лысый ВБ (1984). «Относительная эффективность криогенных жидкостей, используемых для быстрого охлаждения криогенных образцов». Журнал микроскопии . 134 (3): 261–270. дои : 10.1111/j.1365-2818.1984.tb02519.x . S2CID 97233738 .
- ^ Эллисон Д.П., Доу К.С., Рорвик М.К. (1987). «Создание и работа простого и недорогого устройства для замораживания для электронной микроскопии». Журнал микроскопии . 147 (Часть 1): 103–108. дои : 10.1111/j.1365-2818.1987.tb02822.x . ПМИД 3305955 . S2CID 112876 .
- ^ Лысый ВБ (1987). Количественная криофиксация . Бристоль и Филадельфия: Адам Хилгер.
- ^ Леуниссен Ян Л.М. и Йи Х. (2009). «Быстрое замораживание под давлением (SPRF): новый метод криофиксации для подготовки образцов в электронной микроскопии» . Дж. Микроск . 235 (1): 25–35. дои : 10.1111/j.1365-2818.2009.03178.x . ПМИД 19566624 . S2CID 205342519 . Архивировано из оригинала 5 января 2013 г.
- ^ Студер, Д. (сентябрь 1995 г.). «Витрификация суставного хряща методом замораживания под высоким давлением» . Журнал микроскопии . 179 (3): 321–322. дои : 10.1111/j.1365-2818.1995.tb03648.x . ПМИД 7473694 . S2CID 32347571 .
- ^ Сильва, АСС; Шмидт, ФК (01.10.2019). «Вакуумная заморозка экстракта кофе в различных технологических условиях» . Пищевые и биотехнологические технологии . 12 (10): 1683–1695. дои : 10.1007/s11947-019-02314-x . ISSN 1935-5149 . S2CID 201644501 .