Круговой дихроизм

Круговой дихроизм ( КД ) — это дихроизм, включающий циркулярно поляризованный свет, т. е. дифференциальное поглощение левого и правого света . Свет с левой круговой (LHC) и правой круговой (RHC) поляризацией представляет два возможных состояния спинового углового момента для фотона, поэтому круговой дихроизм также называют дихроизмом для спинового углового момента. Это явление было открыто Жаном-Батистом Био , Огюстеном Френелем и Эме Коттоном в первой половине XIX века. Круговой дихроизм и круговое двойное лучепреломление — проявления оптической активности . Он проявляется в полосах поглощения оптически активных хиральных молекул. КД- спектроскопия имеет широкий спектр применений во многих различных областях. В частности, УФ- КД используется для исследования вторичной структуры белков. UV/Vis CD используется для исследования переходов с переносом заряда . КД ближнего инфракрасного диапазона используется для исследования геометрической и электронной структуры путем исследования -переходов металла d → d . Колебательный круговой дихроизм , в котором используется свет инфракрасной области энергии, используется для структурных исследований небольших органических молекул, а в последнее время белков и ДНК.

Физические принципы

Круговая поляризация света

Основная статья: Круговая поляризация

Электромагнитное излучение состоит из электрического ${\boldsymbol {E}}$ и магнитный ${\boldsymbol {B}}$ поле, которое колеблется перпендикулярно друг другу и направлению распространения, волна поперечная . В то время как линейно поляризованный свет возникает, когда вектор электрического поля колеблется только в одной плоскости, свет с круговой поляризацией возникает, когда направление вектора электрического поля вращается вокруг направления его распространения, в то время как вектор сохраняет постоянную величину. В одной точке пространства вектор круговой поляризации очерчивает круг за один период частоты волны, отсюда и название. На двух диаграммах ниже показаны векторы электрического поля линейно и циркулярно поляризованного света в один момент времени для ряда положений; график электрического вектора с круговой поляризацией образует спираль вдоль направления распространения ${\boldsymbol {k}}$. Для левоциркулярно поляризованного света (ЛЦП) при распространении к наблюдателю электрический вектор вращается против часовой стрелки . Для света с правой круговой поляризацией (RCP) электрический вектор вращается по часовой стрелке.

Взаимодействие циркулярно поляризованного света с веществом.

Когда свет с круговой поляризацией проходит через поглощающую оптически активную среду, скорости между правой и левой поляризациями различаются ( $c_{\mathrm {L} }\neq c_{\mathrm {R} }$), а также их длину волны ( $\lambda _{\mathrm {L} }\neq \lambda _{\mathrm {R} }$) и степень их поглощения ( $\varepsilon _{\mathrm {L} }\neq \varepsilon _{\mathrm {R} }$). Круговой дихроизм – отличие $\Delta \varepsilon \equiv \varepsilon _{\mathrm {L} }-\varepsilon _{\mathrm {R} }$. Электрическое поле светового луча вызывает линейное смещение заряда при взаимодействии с молекулой ( электрический диполь ), тогда как его магнитное поле вызывает циркуляцию заряда ( магнитный диполь ). Эти два движения в сочетании вызывают возбуждение электрона по спирали, которое включает в себя перемещение и вращение и связанные с ними операторы . Экспериментально установленная зависимость между вращательной силой $R$ образца и $\Delta \varepsilon$ дается

$R_{\mathrm {exp} }={\frac {3hc10^{3}\ln(10)}{32\pi ^{3}N_{\mathrm {A} }}}\int {\frac {\Delta \varepsilon }{\nu }}\mathrm {d} {\nu }$

Вращательная сила также была определена теоретически.

$R_{\mathrm {theo} }={\frac {1}{2mc}}\mathrm {Im} \int \Psi _{g}{\widehat {M}}_{\mathrm {(elec.dipole)} }\Psi _{e}\mathrm {d} \tau \bullet \int \Psi _{g}{\widehat {M}}_{\mathrm {(mag.dipole)} }\Psi _{e}\mathrm {d} \tau$

Из этих двух уравнений мы видим, что для того, чтобы иметь ненулевое значение $\Delta \varepsilon$, операторы электрического и магнитного дипольного момента ( ${\widehat {M}}_{\mathrm {(elec.dipole)} }$ и ${\widehat {M}}_{\mathrm {(mag.dipole)} }$) должно трансформироваться как то же неприводимое представление . $\mathrm {C} _{n}$ и $\mathrm {D} _{n}$ являются единственными точечными группами , где это может произойти, делая активными только хиральные молекулы CD.

Проще говоря, поскольку свет с круговой поляризацией сам по себе является «хиральным», он по-разному взаимодействует с хиральными молекулами . То есть два типа света с круговой поляризацией поглощаются в разной степени. В эксперименте CD равное количество левого и правого света с круговой поляризацией выбранной длины волны поочередно излучается в (хиральный) образец. Одна из двух поляризаций поглощается больше, чем другая, и измеряется эта зависящая от длины волны разница поглощения, что дает спектр КД образца. Благодаря взаимодействию с молекулой вектор электрического поля света после прохождения через образец прослеживает эллиптическую траекторию.

Важно, что хиральность молекулы может быть конформационной, а не структурной. То есть, например, белковая молекула со спиральной вторичной структурой может иметь КД, меняющийся при изменении конформации.

Дельта поглощения

По определению,

$\Delta A=A_{\mathrm {L} }-A_{\mathrm {R} }\,$

где $\Delta A$ (Дельта-поглощение) — это разница между поглощением света с левой круговой поляризацией (LCP) и правой круговой поляризацией (RCP) (это то, что обычно измеряется). $\Delta A$ является функцией длины волны , поэтому для того, чтобы измерение имело смысл, должна быть известна длина волны, на которой оно было выполнено.

Молярный круговой дихроизм

Это также можно выразить, применив закон Бера , как:

$\Delta A=(\varepsilon _{\mathrm {L} }-\varepsilon _{\mathrm {R} })Cl\,$

где

$\varepsilon _{\mathrm {L} }$ и $\varepsilon _{\mathrm {R} }$ – молярные коэффициенты экстинкции света LCP и RCP,

$C$ молярная концентрация ,

$l$ — длина пути в сантиметрах (см).

Затем

$\Delta \varepsilon =\varepsilon _{\mathrm {L} }-\varepsilon _{\mathrm {R} }\,$

– молярный круговой дихроизм. Это внутреннее свойство обычно подразумевается под круговым дихроизмом вещества. С $\Delta \varepsilon$ является функцией длины волны, значением молярного кругового дихроизма ( $\Delta \varepsilon$) должен указывать длину волны, на которой он действителен.

Внешние воздействия на круговой дихроизм

Во многих практических применениях кругового дихроизма (КД), как обсуждается ниже, измеренная КД является не просто внутренним свойством молекулы, а, скорее, зависит от молекулярной конформации. В таком случае CD также может быть функцией температуры, концентрации и химической среды, включая растворители. В этом случае сообщаемое значение CD должно также указывать эти другие важные факторы, чтобы быть значимым.

В упорядоченных структурах, лишенных двойной вращательной симметрии, оптическая активность включая дифференциальную передачу (и отражение ) волн круговой поляризации зависит также от направления распространения через материал. В этом случае так называемая внешняя 3d-хиральность связана с взаимной ориентацией светового луча и структуры.

Молярная эллиптичность

Хотя $\Delta A$ обычно измеряется, по историческим причинам большинство измерений приводятся в градусах эллиптичности.Молярная эллиптичность представляет собой круговой дихроизм с поправкой на концентрацию. Молярный круговой дихроизм и молярная эллиптичность, $[\theta ]$, легко преобразуются уравнением:

Эллиптически поляризованный свет (фиолетовый) состоит из неравных вкладов правого (синего) и левого (красного) света с круговой поляризацией.

$[\theta ]=3298.2\,\Delta \varepsilon .\,$

Это соотношение получается путем определения эллиптичности поляризации как:

$\tan \theta ={\frac {E_{\mathrm {R} }-E_{\mathrm {L} }}{E_{\mathrm {R} }+E_{\mathrm {L} }}}\,$

где

$E_{\mathrm {R} }$ и $E_{\mathrm {L} }$ – величины электрического поля векторов правоциркулярного и левоциркулярно поляризованного света соответственно.

Когда $E_{\mathrm {R} }$ равно $E_{\mathrm {L} }$ (когда нет разницы в поглощении света право- и левополяризованного света), $\theta$ равен 0° и свет линейно поляризован . Когда либо $E_{\mathrm {R} }$ или $E_{\mathrm {L} }$ равен нулю (при полном поглощении света круговой поляризации в одном направлении), $\theta$ Угол равен 45°, а свет имеет круговую поляризацию .

Обычно эффект кругового дихроизма невелик, поэтому $\tan \theta$ мала и может быть аппроксимирована как $\theta$ в радианах . Поскольку интенсивность или освещенность , $I$, света пропорциональна квадрату вектора электрического поля, эллиптичность становится:

$\theta ({\text{radians}})={\frac {(I_{\mathrm {R} }^{1/2}-I_{\mathrm {L} }^{1/2})}{(I_{\mathrm {R} }^{1/2}+I_{\mathrm {L} }^{1/2})}}\,$

Затем, заменив I, используя закон Бера в форме натурального логарифма :

$I=I_{0}\mathrm {e} ^{-A\ln 10}\,$

Эллиптичность теперь можно записать как:

$\theta ({\text{radians}})={\frac {(\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {R} }}{2}}\ln 10}-\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {L} }}{2}}\ln 10})}{(\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {R} }}{2}}\ln 10}+\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {L} }}{2}}\ln 10})}}={\frac {\mathrm {e} ^{\Delta A{\frac {\ln 10}{2}}}-1}{\mathrm {e} ^{\Delta A{\frac {\ln 10}{2}}}+1}}\,$

С $\Delta A\ll 1$, это выражение можно аппроксимировать, разложив экспоненты в ряд Тейлора до первого порядка, а затем отбросив члены $\Delta A$ в сравнении с единицей и переводом из радиан в градусы:

$\theta ({\text{degrees}})=\Delta A\left({\frac {\ln 10}{4}}\right)\left({\frac {180}{\pi }}\right)\,$

Линейная зависимость концентрации растворенного вещества и длины пути устраняется путем определения молярной эллиптичности как:

$[\theta ]={\frac {100\theta }{Cl}}\,$

Тогда, объединив два последних выражения с законом Бера , молярная эллиптичность становится:

$[\theta ]=100\,\Delta \varepsilon \left({\frac {\ln 10}{4}}\right)\left({\frac {180}{\pi }}\right)=3298.2\,\Delta \varepsilon \,$

Исторически единицами молярной эллиптичности являются (град·см ² /дмол). Для расчета молярной эллиптичности необходимо знать концентрацию образца (г/л), длину пути клетки (см) и молекулярную массу (г/моль).

Если образец представляет собой белок, вместо молекулярной массы часто используется средняя масса остатка (средняя молекулярная масса содержащихся в нем аминокислотных остатков), при этом белок рассматривается как раствор аминокислот. Использование средней эллиптичности остатков облегчает сравнение CD белков с разной молекулярной массой; использование этого нормализованного CD важно при изучении структуры белка.

Средняя эллиптичность остатка

Методы оценки вторичной структуры полимеров, в частности белков и полипептидов, часто требуют, чтобы измеренный спектр молярной эллиптичности был преобразован в нормализованное значение, в частности, значение, не зависящее от длины полимера. Для этой цели используется средняя эллиптичность остатка; это просто измеренная молярная эллиптичность молекулы, деленная на количество мономерных единиц (остатков) в молекуле.

Применение к биологическим молекулам

Верхняя панель: Спектроскопия кругового дихроизма в ультрафиолетовой области длин волн (УФ-КД) слитого белка MBP-цитохром b ₆ в различных растворах детергентов. Это показывает, что белок в СД, как и в растворе Тритона Х-100, восстановил свою структуру. Однако спектры, полученные из раствора ДСН, демонстрируют пониженную эллиптичность в диапазоне 200–210 нм, что указывает на неполное восстановление вторичной структуры.
Нижняя панель: Содержание вторичных структур, предсказанное по спектрам КД с использованием алгоритма CDSSTR. Белок в растворе ДСН демонстрирует повышенное содержание неупорядоченных структур и пониженное содержание спиралей.

В общем случае это явление будет проявляться в полосах поглощения любой оптически активной молекулы. Как следствие, биологические молекулы проявляют круговой дихроизм из-за их правовращающих и левовращающих компонентов. Еще более важно то, что вторичная структура также придает отчетливый CD соответствующим молекулам. Следовательно, альфа-спираль белков и двойная спираль нуклеиновых кислот имеют спектральные характеристики CD, представляющие их структуры. Способность CD давать репрезентативную структурную характеристику делает его мощным инструментом в современной биохимии, приложения которого можно найти практически во всех областях исследований.

CD тесно связан с методом оптической вращательной дисперсии (ORD) и обычно считается более продвинутым. CD измеряется в полосах поглощения интересующей молекулы или вблизи них, тогда как ORD может быть измерен вдали от этих полос. Преимущество компакт-диска очевидно при анализе данных. Структурные элементы различаются более четко, поскольку их записанные полосы не перекрываются сильно на определенных длинах волн, как это происходит в ORD. В принципе, эти два спектральных измерения могут быть взаимно преобразованы посредством интегрального преобразования ( соотношение Крамерса-Кронига ), если все поглощения включены в измерения.

Спектр КД белков в дальнем УФ ( ультрафиолетовом ) диапазоне может выявить важные характеристики их вторичной структуры . Спектры КД можно легко использовать для оценки доли молекулы, находящейся в конформации альфа-спирали , конформации бета-листа , конформации бета-поворота или какой-либо другой конформации (например, случайного клубка ). Эти дробные распределения накладывают важные ограничения на возможные вторичные конформации, в которых может находиться белок. CD, как правило, не может сказать, где обнаруженные альфа-спирали расположены внутри молекулы, или даже полностью предсказать, сколько их. Несмотря на это, CD является ценным инструментом, особенно для демонстрации изменений в телосложении. Его можно, например, использовать для изучения того, как вторичная структура молекулы изменяется в зависимости от температуры или концентрации денатурирующих агентов, например хлорида гуанидиния или мочевины . Таким образом, он может раскрыть важную термодинамическую информацию о молекуле (например, энтальпию и свободную Гиббса энергию денатурации ), которую иначе невозможно легко получить. Любой, кто попытается изучить белок, найдет CD ценным инструментом для проверки того, что белок находится в своей нативной конформации, прежде чем проводить с ним обширные и/или дорогостоящие эксперименты. Кроме того, существует ряд других применений спектроскопии КД в химии белков, не связанных с оценкой доли альфа-спирали. Кроме того, спектроскопия КД использовалась в исследованиях бионеорганических интерфейсов. В частности, его использовали для анализа различий во вторичной структуре сконструированного белка до и после титрования реагентом.

Спектр КД в ближней УФ-области (>250 нм) белков дает информацию о третичной структуре . Сигналы, полученные в области 250–300 нм, обусловлены поглощением, дипольной ориентацией и природой окружающего окружения аминокислот фенилаланина, тирозина, цистеина (или мостиков SS ) и триптофана дисульфидных . В отличие от КД в дальнем УФ-диапазоне, спектр КД в ближнем УФ-диапазоне нельзя отнести к какой-либо конкретной трехмерной структуре. Скорее, спектры КД в ближнем УФ-диапазоне предоставляют структурную информацию о природе простетических групп в белках, например, гем-групп в гемоглобине и цитохроме с .

Видимая КД-спектроскопия является очень мощным методом изучения взаимодействий металл-белок и может разрешать отдельные электронные dd-переходы как отдельные полосы. Спектры КД в видимой области света возникают только тогда, когда ион металла находится в хиральном окружении, поэтому свободные ионы металлов в растворе не обнаруживаются. Преимущество этого метода состоит в том, что он позволяет наблюдать только металл, связанный с белком, поэтому легко получить зависимость от pH и стехиометрию. Оптическая активность в комплексах ионов переходных металлов объясняется конфигурационными, конформационными и вицинальными эффектами. Клевпатинонд и Вайлс (2007) разработали набор эмпирических правил для прогнозирования появления видимых спектров КД для Cu. ²⁺ и Ни ²⁺ плоскоквадратные комплексы, включающие координацию гистидина и основной цепи.

КД дает менее конкретную структурную информацию, чем рентгеновская кристаллография и ЯМР-спектроскопия белков , например, , которые оба дают данные об атомном разрешении. Однако КД-спектроскопия — быстрый метод, не требующий больших количеств белков или обширной обработки данных. Таким образом, CD можно использовать для исследования большого количества условий растворителя , варьирующейся температуры , pH , солености и присутствия различных кофакторов.

КД- спектроскопия обычно используется для изучения белков в растворе и, таким образом, дополняет методы исследования твердого состояния. Это также является ограничением, поскольку многие белки встроены в мембраны в нативном состоянии, а растворы, содержащие мембранные структуры, часто сильно рассеиваются. CD иногда измеряют в тонких пленках.

КД Спектроскопия также проводилась с использованием полупроводниковых материалов, таких как TiO _{2 ,} для получения сильных сигналов в УФ-диапазоне длин волн, где часто происходят электронные переходы биомолекул.

Экспериментальные ограничения

КД также изучался в углеводах , но с ограниченным успехом из-за экспериментальных трудностей, связанных с измерением спектров КД в вакуумной ультрафиолетовой (ВУФ) области спектра (100–200 нм), где лежат соответствующие полосы КД незамещенных углеводов. . Замещенные углеводы с полосами выше ВУФ-области были успешно измерены.

Измерение CD также осложняется тем фактом, что типичные водные буферные системы часто поглощают в диапазоне, в котором структурные особенности демонстрируют дифференциальное поглощение циркулярно поляризованного света. Фосфатный , сульфатный , карбонатный и ацетатный буферы обычно несовместимы с ЦД, если они не сильно разбавлены, например, в диапазоне 10–50 мМ. Буферную систему TRIS следует полностью избегать при выполнении CD в дальнем УФ-диапазоне. бората и Соединения ония часто используются для установления подходящего диапазона pH для экспериментов по КД. Некоторые экспериментаторы заменили ион хлорида фторидом, поскольку фторид меньше поглощает в дальнем УФ-диапазоне, а некоторые работали в чистой воде. Другой, почти универсальный метод заключается в минимизации поглощения растворителя за счет использования ячеек с более короткой длиной пути при работе в дальнем УФ-диапазоне, длина пути 0,1 мм не является редкостью в этой работе.

Помимо измерений в водных системах, КД, особенно в дальней УФ-области спектра, можно измерять в органических растворителях, например, этаноле, метаноле, трифторэтаноле (ТФЭ). Последний имеет то преимущество, что индуцирует структурообразование белков, индуцируя бета-листы в одних и альфа-спирали в других, чего они не проявляют в нормальных водных условиях. Однако наиболее распространенные органические растворители, такие как ацетонитрил , ТГФ , хлороформ , дихлорметан , несовместимы с КД в дальнем УФ-диапазоне.

Может быть интересно отметить, что спектры CD белка, используемые при оценке вторичной структуры, связаны с орбитальным поглощением от π до π* амидных связей, связывающих аминокислоты. Эти полосы поглощения частично лежат в так называемом вакуумном ультрафиолете (длины волн менее 200 нм). Интересующая область длин волн фактически недоступна в воздухе из-за сильного поглощения света кислородом на этих длинах волн. На практике эти спектры измеряются не в вакууме, а в бескислородном приборе (заполненном чистым газообразным азотом).

После устранения кислорода, возможно, вторым наиболее важным техническим фактором при работе на длинах волн ниже 200 нм является проектирование остальной части оптической системы с низкими потерями в этой области. Важным в этом отношении является использование алюминизированных зеркал , покрытия которых оптимизированы для снижения потерь в этой области спектра.

Обычным источником света в этих приборах является ксеноновая лампа высокого давления с короткой дугой . Обычные ксеноновые дуговые лампы непригодны для использования в условиях слабого ультрафиолета. специально сконструированные лампы с колбой из синтетического кварца Вместо этого необходимо использовать высокой чистоты.

Свет синхротронных источников имеет гораздо более высокий поток на коротких длинах волн и используется для записи компакт-диска с длиной волны до 160 нм. В 2010 году спектрофотометр КД на установке накопителя электронов ISA в Орхусском университете в Дании использовался для регистрации твердотельных спектров КД до 120 нм. На квантовомеханическом уровне плотности признаков кругового дихроизма и оптического вращения идентичны. Оптическая вращающаяся дисперсия и круговой дихроизм имеют один и тот же квантовый информационный контент.

См. также

• Спиновая селективность, индуцированная киральностью
• Оптическая активность гиперрэлеевского рассеяния
• Линейный дихроизм
• Магнитный круговой дихроизм
• Оптическая активность
• Оптическая изомерия
• Оптическое вращение
• Оптическая вращательная дисперсия
• Банк данных по круговому дихроизму белков
• Спектроскопия кругового дихроизма синхротронного излучения
• Двухфотонный круговой дихроизм
• Колебательный круговой дихроизм

Внешние ссылки

• Спектроскопия кругового дихроизма от Alliance Protein Laboratories, коммерческого поставщика услуг.
• Введение в спектроскопию кругового дихроизма от Applied Photophysicals, поставщика оборудования
• Анимированное пошаговое руководство по круговому дихроизму и оптическому вращению от профессора Валева.