Равновесие разворачивается

Смотрите также: Денатурация (биохимия)

«Термодинамика белков» перенаправляется сюда. О термодинамике реакций, катализируемых белками, см. Ферменты .

В биохимии наконечника атомно - равновесное разворачивание — это процесс разворачивания молекулы белка или РНК путем постепенного изменения окружающей ее среды, например, путем изменения температуры или давления , pH , добавления химических денатурантов или приложения силы, как при использовании силового микроскопа . Если равновесие сохранялось на всех этапах, то процесс теоретически должен быть обратимым при равновесном сворачивании . Равновесное разворачивание можно использовать для определения термодинамической стабильности структуры белка или РНК, т.е. разницы свободной энергии между свернутым и развернутым состояниями.

Теоретическая основа

В своей простейшей форме равновесное разворачивание предполагает, что молекула может принадлежать только к двум термодинамическим состояниям: свернутому состоянию (обычно обозначаемому N для «нативного» состояния) и развернутому состоянию (обычно обозначаемому U ). Модель сворачивания белка по принципу «все или ничего» была впервые предложена Тимом Энсоном в 1945 году. но считается, что это справедливо только для небольших отдельных структурных доменов белков (Jackson, 1998); более крупные домены и многодоменные белки часто находятся в промежуточных состояниях. Как обычно в статистической механике , эти состояния соответствуют ансамблям молекулярных конформаций, а не одной конформации.

Молекула может переходить между нативным и развернутым состояниями в соответствии с простой кинетической моделью.

Н ⇌ У

с константами скорости $k_{f}$ и $k_{u}$ для складывания( ${\ce {U -> N}}$) и разворачивается ( ${\ce {N -> U}}$) реакции соответственно. Безразмерная константа равновесия $K_{eq}\ {\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{u}}{k_{f}}}={\frac {\left[{\ce {U}}\right]_{eq}}{\left[{\ce {N}}\right]_{eq}}}$ может быть использован для определения конформационной стабильности $\Delta G^{o}$ по уравнению

$\Delta G^{o}=-RT\ln K_{eq}$

где $R$ газовая постоянная и $T$ — абсолютная температура в Кельвинах . Таким образом, $\Delta G^{o}$ является положительным, если развернутое состояние менее стабильно (т. е. нежелательно) по сравнению с исходным состоянием.

Самый прямой способ измерения конформационной стабильности. $\Delta G^{o}$ молекулы с двухуровневой укладкой заключается в измерении ее кинетических констант скорости $k_{f}$ и $k_{u}$ при интересующих условиях решения. Однако, поскольку сворачивание белка обычно завершается за миллисекунды, такие измерения могут быть трудновыполнимыми, обычно требуются дорогостоящие смесители с остановленным потоком или (в последнее время) смесители непрерывного потока, чтобы вызвать сворачивание с высоким временным разрешением. Интерферометрия двойной поляризации — это новый метод прямого измерения конформационных изменений и $\Delta G^{o}$.

Химическая денатурация

В менее обширном методе равновесного разворачивания доли свернутых и развернутых молекул (обозначаемые как $p_{N}$ и $p_{U}$соответственно) измеряют по мере того, как условия растворения постепенно изменяются от условий, благоприятствующих нативному состоянию, к условиям, благоприятствующим развернутому состоянию, например, путем добавления денатуранта, такого как гидрохлорид гуанидиния или мочевина . (При равновесном складывании происходит обратный процесс.) Учитывая, что сумма дробей должна равняться единице и их отношение должно задаваться множителем Больцмана , имеем

$p_{N}={\frac {1}{1+e^{-\Delta G/RT}}}$

$p_{U}=1-p_{N}={\frac {e^{-\Delta G/RT}}{1+e^{-\Delta G/RT}}}={\frac {1}{1+e^{\Delta G/RT}}}$

Обычно обнаруживается, что стабильность белка изменяется линейно в зависимости от концентрации денатуранта. Для объяснения этого наблюдения был предложен ряд моделей, среди которых наиболее заметными являются модель связывания денатуранта и модель обмена растворителя (обе принадлежат Джону Шеллману). ) и Модель линейной экстраполяции (LEM; Ник Пейс). ). Все модели предполагают, что при денатурации заселяются/освобождаются только два термодинамических состояния. Их можно расширить для интерпретации более сложных схем реакций.

Модель связывания денатуранта предполагает, что на молекуле белка (свернутой или развернутой) имеются специфические, но независимые участки, с которыми денатурирующий агент связывается с эффективной (средней) константой связывания k . Равновесие смещается в сторону развернутого состояния при высоких концентрациях денатуранта, поскольку оно имеет больше мест связывания для денатуранта по сравнению со свернутым состоянием ( $\Delta n$). Другими словами, причиной денатурационных переходов считают увеличение количества потенциальных сайтов, находящихся в развернутом состоянии. Элементарное лечение приводит к следующей функциональной форме:

$\Delta G=\Delta G_{w}-RT\Delta n\ln \left(1+k[D]\right)$

где $\Delta G_{w}$ — стабильность белка в воде, а [D] — концентрация денатуранта. Таким образом, анализ данных денатурации с помощью этой модели требует 7 параметров: $\Delta G_{w}$, $\Delta n$, k , а также наклоны и точки пересечения сложенных и развернутых базовых линий состояния.

Модель обмена растворителя (также называемая «моделью слабого связывания» или «селективной сольватацией») Шеллмана предполагает идею равновесия между молекулами воды, связанными с независимыми участками белка, и денатурирующими молекулами в растворе. Он имеет форму:

$\Delta G=\Delta G_{w}-RT\Delta n\ln \left(1+(K-1)X_{D}\right)$

где $K$ – константа равновесия реакции обмена, $X_{d}$ – мольная доля денатуранта в растворе. Эта модель пытается ответить на вопрос, действительно ли молекулы денатуранта связываются с белком или они кажутся связанными только потому, что денатуранты занимают около 20-30% от общего объема раствора при высоких концентрациях, используемых в экспериментах, т.е. неспецифические эффекты – отсюда и термин «слабая связь». Как и в модели связывания денатуранта, для подгонки этой модели также требуется 7 параметров. Одна общая идея, полученная из обеих этих моделей, заключается в том, что константы связывания (в молярном масштабе) для мочевины и гидрохлорида гуанидиния малы: ~ 0,2. $M^{-1}$ для мочевины и 0,6 $M^{-1}$ для GuHCl.

Интуитивно понятно, что разница в количестве мест связывания между сложенным и развернутым состояниями прямо пропорциональна различиям в доступной площади поверхности. Это формирует основу для LEM , которая предполагает простую линейную зависимость стабильности от концентрации денатуранта. Результирующий наклон графика стабильности в зависимости от концентрации денатуранта называется значением m. Говоря чисто математическими терминами, значение m представляет собой производную изменения свободной энергии стабилизации при добавлении денатуранта. Однако сильная корреляция между площадью доступной поверхности (ASA), открытой при разворачивании, то есть разницей в ASA между развернутым и свернутым состоянием исследуемого белка (dASA), и значением m была задокументирована Пейсом и его сотрудниками. . Ввиду этого наблюдения значения m обычно интерпретируются как пропорциональные dASA. Для LEM не существует физической основы, и он носит чисто эмпирический характер, хотя широко используется для интерпретации данных о денатурации растворителя. Имеет общий вид:

$\Delta G=m\left([D]_{1/2}-[D]\right)$

где наклон $m$ называется « m -значением» (> 0 для приведенного выше определения) и $\left[D\right]_{1/2}$ (также называемая C _m ) представляет собой концентрацию денатуранта, при которой 50% молекул сворачиваются ( средняя точка денатурации перехода, где $p_{N}=p_{U}=1/2$).

На практике наблюдаемые экспериментальные данные при различных концентрациях денатуранта соответствуют модели двух состояний с этой функциональной формой для $\Delta G$, вместе с линейными базовыми линиями для сложенного и развернутого состояний. $m$ и $\left[D\right]_{1/2}$ — два подгоночных параметра, а также четыре других для линейных базовых линий (наклон и точка пересечения для каждой линии); в некоторых случаях наклоны предполагаются равными нулю, что дает всего четыре подгоночных параметра. Конформационная стабильность $\Delta G$ может быть рассчитан для любой концентрации денатуранта (включая стабильность при нулевом денатурировании) на основе подобранных параметров $m$ и $\left[D\right]_{1/2}$. В сочетании с кинетическими данными по сворачиванию значение m можно использовать для грубой оценки количества скрытой гидрофобной поверхности в переходном состоянии сворачивания.

Структурные зонды

К сожалению, вероятность $p_{N}$ и $p_{U}$ не может быть измерено напрямую. Вместо этого мы анализируем относительную популяцию свернутых молекул, используя различные структурные зонды, например, поглощение при 287 нм (которое сообщает о воздействии триптофана и тирозина в растворителе ), круговой дихроизм в дальнем ультрафиолете (180-250 нм, который сообщает о вторичном структура белкового остова), интерферометрия с двойной поляризацией (которая сообщает о размере молекул и плотности складок) и флуоресценция в ближнем ультрафиолете (которая сообщает об изменениях в окружении триптофана и тирозина). Однако подойдет практически любой зонд складчатой ​​структуры; поскольку измерение проводится в равновесии, нет необходимости в высоком временном разрешении. Таким образом, можно провести измерения ЯМР химических сдвигов , характеристической вязкости , воздействия растворителя (химической реакционной способности) боковых цепей, таких как цистеин, воздействия протеаз на основную цепь, а также различных гидродинамических измерений.

Чтобы преобразовать эти наблюдения в вероятности $p_{N}$ и $p_{U}$, обычно предполагается, что наблюдаемое $A$ принимает одно из двух значений, $A_{N}$ или $A_{U}$, соответствующий исходному или развернутому состоянию соответственно. Следовательно, наблюдаемая величина равна линейной сумме

$A=A_{N}p_{N}+A_{U}p_{U}$

Подгоняя наблюдения $A$ при различных условиях решения этой функциональной формы можно оценить $A_{N}$ и $A_{U}$, а также параметры $\Delta G$. Подходящие переменные $A_{N}$ и $A_{U}$ иногда допускается линейное изменение в зависимости от условий растворения, например, температуры или концентрации денатуранта, асимптоты когда $A$ Наблюдается линейное изменение в условиях сильного складывания или сильного разворачивания.

Термическая денатурация

Предполагая денатурацию двух состояний, как указано выше, можно вывести фундаментальные термодинамические параметры, а именно: $\Delta H$, $\Delta S$ и $\Delta G$ при условии, что у человека есть знания по $\Delta C_{p}$ исследуемой системы.

Термодинамические наблюдаемые денатурации можно описать следующими уравнениями:

${\begin{aligned}\Delta H(T)&=\Delta H(T_{d})+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}dT\\&=\Delta H(T_{d})+\Delta C_{p}[T-T_{d}]\\\Delta S(T)&={\frac {\Delta H(T_{d})}{T_{d}}}+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}d\ln T\\&={\frac {\Delta H(T_{d})}{T_{d}}}+\Delta C_{p}\ln {\frac {T}{T_{d}}}\\\Delta G(T)&=\Delta H-T\Delta S\\&=\Delta H(T_{d}){\frac {T_{d}-T}{T_{d}}}+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}dT-T\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}d\ln T\\&=\Delta H(T_{d})\left(1-{\frac {T}{T_{d}}}\right)-\Delta C_{p}\left[T_{d}-T+T\ln \left({\frac {T}{T_{d}}}\right)\right]\end{aligned}}$

где $\ \Delta H$, $\ \Delta S$ и $\ \Delta G$ указывают энтальпию , энтропию и свободную энергию Гиббса разворачивания при постоянном pH и давлении. Температура, $\ T$ варьируется для проверки термической стабильности системы и $\ T_{d}$ — температура, при которой половина молекул в системе развернута. Последнее уравнение известно как уравнение Гиббса–Гельмгольца .

Определение теплоемкости белков

В принципе, все вышеперечисленные термодинамические наблюдаемые можно рассчитать по одной термограмме дифференциальной сканирующей калориметрии системы, предполагая, что ${\ce {\Delta C_p}}$ не зависит от температуры. Однако получить точные значения для ${\ce {\Delta C_p}}$ Сюда. Точнее, ${\ce {\Delta C_p}}$ можно вывести из вариаций ${\ce {\Delta H(T_d)}}$ против. ${\ce {T_d}}$ чего можно достичь путем измерений с небольшими изменениями pH или концентрации белка . Наклон линейной аппроксимации равен ${\ce {\Delta C_p}}$. Обратите внимание, что любая нелинейность точек данных указывает на то, что $\Delta C_{p}$ вероятно, не зависит от температуры.

Альтернативно, ${\ce {\Delta C_p}}$ также можно оценить путем расчета площади доступной поверхности (ASA) белка до и после термической денатурации следующим образом:

${\ce {\Delta ASA}}={\ce {ASA_{unfolded}}}-{\ce {ASA_{native}}}$

Для белков, имеющих известную трехмерную структуру, ${\ce {ASA_{native}}}$ можно рассчитать с помощью компьютерных программ, таких как Deepview (также известных как Swiss PDB Viewer ). ${\ce {ASA_{unfolded}}}$ можно рассчитать по табличным значениям каждой аминокислоты с помощью полуэмпирического уравнения:

${\ce {ASA_{unfolded}}}=\left(a_{{\ce {polar}}}\times {\ce {ASA_{polar}}}\right)+\left(a_{{\ce {aromatic}}}\times {\ce {ASA_{aromatic}}}\right)+\left(a_{{\ce {nonpolar}}}\times {\ce {ASA_{nonpolar}}}\right)$

где нижние индексы полярный, неполярный и ароматический указывают на части 20 встречающихся в природе аминокислот.

Наконец, для белков существует линейная корреляция между ${\ce {\Delta ASA}}$ и ${\ce {\Delta C_p}}$ через следующее уравнение:

${\ce {\Delta C_p}}=0.61\times {\ce {\Delta ASA}}$

Оценка развития двух состояний

Кроме того, можно оценить, протекает ли сворачивание в соответствии с разворачиванием в двух состояниях, как описано выше. Это можно сделать с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии путем сравнения калориметрической энтальпии денатурации, т.е. площади под пиком, $A_{\text{peak}}$ к энтальпии Ван 'т-Гоффа, описываемой следующим образом:

$\Delta H_{vH}(T)=-R{\frac {d\ln K}{dT^{-1}}}$

в $T=T_{d}$ тот $\Delta H_{vH}(T_{d})$ можно описать как:

$\Delta H_{vH}(T_{d})={\frac {RT_{d}^{2}\Delta C_{p}^{\max }}{A_{\text{peak}}}}$

Когда наблюдается развертывание в двух состояниях, $A_{\text{peak}}=\Delta H_{vH}(T_{d})$. $\Delta C_{p}^{\max }$ – высота пика теплоемкости.

Обобщение на белковые комплексы и многодоменные белки.

Используя приведенные выше принципы, для гомомерных и гетеромерных белков, от мономеров до тримеров, были выведены уравнения, связывающие глобальный сигнал белка, соответствующий состояниям сворачивания в равновесии, и переменную величину денатурирующего агента, будь то температура или химическая молекула. и потенциально тетрамеры. Эти уравнения обеспечивают надежную теоретическую основу для измерения стабильности сложных белков и для сравнения стабильности белков дикого типа и мутантных белков. Такие уравнения невозможно вывести для пентамеров высших олигомеров из-за математических ограничений (теорема Абеля-Руффини).

Дальнейшее чтение

• Пейс CN. (1975) «Стабильность глобулярных белков», Критические обзоры CRC по биохимии , 1-43.
• Санторо ММ и Болен Д.В. (1988) «Развертывание изменений свободной энергии, определенное методом линейной экстраполяции. 1. Развертывание фенилметансульфонил-α-химотрипсина с использованием различных денатурантов», Biochemistry , 27 , 8063–8068.
• Привалов ПЛ. (1992) «Физическая основа стабильности свернутых конформаций белков», в книге «Сворачивание белков» , Т.Э. Крейтон, изд., WH Freeman, стр. 83–126.
• Яо М. и Болен Д.В. (1995) «Насколько достоверны измерения свободной энергии разворачивания, индуцированного денатурантом? Уровень соответствия общепринятым предположениям в расширенном диапазоне стабильности рибонуклеазы А», Biochemistry , 34 , 3771–3781.
• Джексон С.Э. (1998) «Как сворачиваются небольшие однодоменные белки?», Folding & Design , 3 , R81-R91.
• Швем Дж.М. и Стайтс МЫ. (1998) «Применение автоматизированных методов для определения конформационной стабильности белка», «Методы энзимологии» , 295 , 150–170.