Остановился поток

Остановленный поток - это экспериментальный метод изучения химических реакций с полупериодом порядка 1 мс, предложенный Бриттоном Ченсом. ^[1]^[2] и расширен Квентином Гибсоном ^[3] (Другие методы, такие как метод температурного скачка , ^[4] доступны для гораздо более быстрых процессов.)

Описание метода

Краткое содержание

в остановленном потоке Спектрометрия химическую кинетику позволяет изучать быстрых реакций (с полупериодами порядка миллисекунд) в растворе. Впервые он был использован в первую очередь для изучения реакций, катализируемых ферментами. Затем метод остановки потока быстро нашел свое место почти во всех лабораториях биохимии, биофизики и химии, где требовалось отслеживать химические реакции в миллисекундном масштабе времени. В своей простейшей форме остановленный поток смешивает два раствора. Небольшие объемы растворов быстро и непрерывно подаются в высокопроизводительный смеситель. Этот процесс смешивания затем инициирует чрезвычайно быструю реакцию. Вновь смешанный раствор поступает в наблюдательную ячейку и выталкивает содержимое ячейки (раствор, оставшийся от предыдущего эксперимента или от необходимых этапов промывки). Время, необходимое для того, чтобы этот раствор прошел от точки смешивания до точки наблюдения, называется мертвым временем. Минимальный объем впрыска будет зависеть от объема смесительной камеры. Как только будет введено достаточно раствора для полного удаления предыдущего раствора, прибор достигает стационарного состояния, и поток можно остановить. В зависимости от технологии привода шприца остановка потока достигается с помощью запорного клапана, называемого жесткой остановкой, или с помощью запорного шприца. Остановка потока также посылает «сигнал запуска» детектору, называемому триггером, чтобы можно было наблюдать за реакцией. Время запуска обычно контролируется программным обеспечением, поэтому пользователь может запустить его одновременно с остановкой потока или за несколько миллисекунд до остановки, чтобы проверить достижение стационарного состояния.

Реагентные шприцы

Два шприца наполнены растворами, которые не вступают в химическую реакцию до тех пор, пока не смешаются между собой. Они имеют поршни, которые приводятся в движение одним приводным поршнем или независимыми шаговыми двигателями, так что они соединены вместе, и их содержимое одновременно вытесняется в смесительное устройство.

Смесительная камера

Ламинарный поток ( слева ) обеспечивает незначительное перемешивание или его отсутствие вообще, но турбулентный поток ( справа ) обеспечивает очень быстрое перемешивание.

После того, как два раствора вытесняются из шприцов, они попадают в систему смешивания с перегородками, обеспечивающими полное смешивание, с турбулентным, а не ламинарным потоком. (Ламинарный поток позволит двум растворам течь бок о бок с неполным смешиванием.)

Мертвое время

Мертвое время — это время, за которое растворы пройдут от точки смешивания до точки наблюдения, это та часть кинетики, которую невозможно наблюдать. Таким образом, чем меньше мертвое время, тем больше информации может получить пользователь. В старых приборах это время могло составлять порядка 1 мс, но улучшения теперь допускают мертвое время около 0,3 мс. ^[5]

Наблюдательная камера

Смешанные реагенты проходят через ячейку наблюдения, которая позволяет наблюдать за реакцией спектрофотометрически, обычно с помощью ультрафиолетовой спектроскопии , флуоресцентной спектроскопии , кругового дихроизма или рассеяния света , и в настоящее время принято объединять несколько из них. ^[6]Для измерения флуоресценции обычно предпочтительнее использовать наблюдательную кювету с коротким световым путем (от 0,75 до 1,5 мм), чтобы уменьшить эффекты самопоглощения. Для измерения поглощения предпочтительны кюветы для наблюдения с более длинным световым путем (от 0,5 см до 1 см). В современных системах с остановленным потоком можно использовать различные модели клеток, и можно менять кювету между двумя экспериментами. Для рентгеновских измерений с остановленным потоком используется кварцевый капилляр с тонкими стенками, чтобы минимизировать поглощение кварца. Одновременные измерения рентгеновского излучения и поглощения возможны в одном и том же капилляре.

Остановка

Пройдя через камеру наблюдения, смесь поступает в третий шприц, содержащий поршень, который приводится в движение потоком и активирует переключатель, останавливающий поток и активирующий наблюдение.

Непрерывный поток

Метод остановки потока является развитием метода непрерывного потока, используемого Гамильтоном Хартриджем и Фрэнсисом Роутоном. ^[7] изучить связывание О ₂ с гемоглобином. В отсутствие какой-либо останавливающей системы реакционная смесь поступала в длинную трубку мимо системы наблюдения (состоявшей в 1923 году из простого колориметра) в отходы. Передвигая колориметр вдоль трубки и зная скорость потока, Хартридж и Роутон смогли измерить процесс через известное время.

В свое время это было революционное достижение, показавшее, что казалось бы неразрешимая проблема (изучение процесса, занимающего миллисекунды, с использованием оборудования, требующего секунды для каждого измерения) может быть решена с помощью простого оборудования. Однако на практике это ограничивалось реагентами, доступными в больших количествах: для белков это фактически ограничивало реакции гемоглобина. Для практических целей этот подход устарел.

Закаленный поток

Метод остановки потока зависит от наличия спектроскопических свойств, которые можно использовать для отслеживания реакции. В противном случае охлажденный поток является альтернативой использованию традиционных химических методов анализа. ^[8] Вместо системы механической остановки реакция останавливается путем гашения , при этом продукты доставляются реципиенту, который немедленно останавливает реакцию либо путем мгновенного замораживания, либо путем денатурации фермента химическим денатурирующим веществом, либо путем воздействия на образец денатурирующего источника света. Как и в методе непрерывного потока, время между смешиванием и закалкой можно варьировать, изменяя длину трубки.

Метод импульсного закаленного потока, предложенный Аланом Ферштом и Россом Джейксом. ^[9] устраняет необходимость в длинной трубке. Реакция инициируется точно так же, как в эксперименте с остановкой потока, но имеется третий шприц, вызывающий гашение через определенное и заданное время после инициирования.

Погашенный поток имеет как преимущества, так и недостатки по сравнению с остановленным потоком. С одной стороны, химический анализ проясняет, какой процесс измеряется, тогда как не всегда может быть очевидно, какой процесс представляет собой спектроскопический сигнал. С другой стороны, закаленное течение гораздо более трудоемко, поскольку каждая точка на временном графике должна определяться отдельно. Изображение слева: катализ нитрогеназой Klebsiella pneumoniae. ^[10] , что поглощение при 420 нм измеряло высвобождение Pi _{иллюстрирует обе эти точки: согласие в половинном времени указывает на то} , но эксперимент с гашенным потоком потребовал 11 точек данных.

Ссылки

^ Шанс, Бриттон (1951). «Быстрая и чувствительная спектрофотометрия. I. Ускоренные и остановленные методы измерения кинетики реакций и спектров нестабильных соединений в видимой области спектра». Обзор научных инструментов . 22 (8): 619–627. дои : 10.1063/1.1746019 .
^ Шанс, Бриттон; Легале, Виктор (1951). «Быстрая и чувствительная спектрофотометрия. II. Приставка с остановленным потоком для стабилизированного кварцевого спектрофотометра». Обзор научных инструментов . 22 (8): 627–634. дои : 10.1063/1.1746020 .
^ Гибсон, QH (1954). «Аппарат с остановленным потоком для изучения быстрых реакций». Дискуссии Фарадеевского общества . 17 : 137. дои : 10.1039/df9541700137 .
^ Эйген, М. (1954). «Методы исследования ионных реакций в водных растворах с периодами полураспада до 10–9 сек. Применение к реакциям нейтрализации и гидролиза». Обсуждать. Фарадей Соц . 17 : 194–205. дои : 10.1039/df9541700194 .
^ Кларк, Чарльз Р. (1997). «Кинетический эксперимент с остановленным потоком для передовых студенческих лабораторий: образование тиоцианата железа (III)». Журнал химического образования . 74 (10): 1214. Бибкод : 1997JChEd..74.1214C . дои : 10.1021/ed074p1214 .
^ Гильерм, Джессика; Фрер, Жан-Мари; Меерсман, Филип; Матань, Андре (2021). «Топология правосторонней параллельной β-спирали пектинметилэстеразы Erwinia chrysanthemi тесно связана как с последовательным сворачиванием, так и с устойчивостью к высокому давлению» . Биомолекулы . 11 (8): 1083. doi : 10.3390/biom11081083 . ПМЦ 8392785 . ПМИД 34439750 .
^ Хартридж, Х.; Ротон, FJW (1923). «Метод измерения скорости очень быстрых химических реакций» . Труды Королевского общества А. 104 (726): 376–394. Бибкод : 1923RSPSA.104..376H . дои : 10.1098/rspa.1923.0116 .
^ Пинсент, BRW (1954). «Метод закалки для изучения быстрых реакций». Дискуссии Фарадеевского общества . 17 : 140–141. дои : 10.1039/df9541700140 .
^ Фершт, Арканзас; Джейкс, Р. (1975). «Демонстрация двух путей реакции аминоацилирования транспортной РНК: применение метода импульсного гашения потока». Биохимия . 14 (15): 3350–3356. дои : 10.1021/bi00686a010 .
^ Торнели, РНФ; Корниш-Боуден, А. (1977). «Кинетика нитрогеназы Klebsiella-pneumoniae : гетеротропные взаимодействия между магний-аденозин-5'-дифосфатом и магний-аденозин-5'-трифосфатом» . Биохим. Дж . 165 (2): 255–262. дои : 10.1042/bj1650255 . ПМК 1164896 . ПМИД 336036 .

Дальнейшее чтение

Алан Фершт (1998). Структура и механизм в науке о белках: Руководство по ферментативному катализу и сворачиванию белков . Нью-Йорк: WH Freeman. стр. 132–168. ISBN 9780716732686 .
Атель Корниш-Боуден (2012). Основы кинетики ферментов (4-е изд.). Вайнхайм: Уайли-Блэквелл. стр. 391–396. ISBN 978-3527330744 .

[1] Шанс, Бриттон (1951). «Быстрая и чувствительная спектрофотометрия. I. Ускоренные и остановленные методы измерения кинетики реакций и спектров нестабильных соединений в видимой области спектра». Обзор научных инструментов . 22 (8): 619–627. дои : 10.1063/1.1746019 .

[2] Шанс, Бриттон; Легале, Виктор (1951). «Быстрая и чувствительная спектрофотометрия. II. Приставка с остановленным потоком для стабилизированного кварцевого спектрофотометра». Обзор научных инструментов . 22 (8): 627–634. дои : 10.1063/1.1746020 .

[3] Гибсон, QH (1954). «Аппарат с остановленным потоком для изучения быстрых реакций». Дискуссии Фарадеевского общества . 17 : 137. дои : 10.1039/df9541700137 .

[4] Эйген, М. (1954). «Методы исследования ионных реакций в водных растворах с периодами полураспада до 10–9 сек. Применение к реакциям нейтрализации и гидролиза». Обсуждать. Фарадей Соц . 17 : 194–205. дои : 10.1039/df9541700194 .

[5] Кларк, Чарльз Р. (1997). «Кинетический эксперимент с остановленным потоком для передовых студенческих лабораторий: образование тиоцианата железа (III)». Журнал химического образования . 74 (10): 1214. Бибкод : 1997JChEd..74.1214C . дои : 10.1021/ed074p1214 .

[6] Гильерм, Джессика; Фрер, Жан-Мари; Меерсман, Филип; Матань, Андре (2021). «Топология правосторонней параллельной β-спирали пектинметилэстеразы Erwinia chrysanthemi тесно связана как с последовательным сворачиванием, так и с устойчивостью к высокому давлению» . Биомолекулы . 11 (8): 1083. doi : 10.3390/biom11081083 . ПМЦ 8392785 . ПМИД 34439750 .

[7] Хартридж, Х.; Ротон, FJW (1923). «Метод измерения скорости очень быстрых химических реакций» . Труды Королевского общества А. 104 (726): 376–394. Бибкод : 1923RSPSA.104..376H . дои : 10.1098/rspa.1923.0116 .

[8] Пинсент, BRW (1954). «Метод закалки для изучения быстрых реакций». Дискуссии Фарадеевского общества . 17 : 140–141. дои : 10.1039/df9541700140 .

[9] Фершт, Арканзас; Джейкс, Р. (1975). «Демонстрация двух путей реакции аминоацилирования транспортной РНК: применение метода импульсного гашения потока». Биохимия . 14 (15): 3350–3356. дои : 10.1021/bi00686a010 .

[10] Торнели, РНФ; Корниш-Боуден, А. (1977). «Кинетика нитрогеназы Klebsiella-pneumoniae : гетеротропные взаимодействия между магний-аденозин-5'-дифосфатом и магний-аденозин-5'-трифосфатом» . Биохим. Дж . 165 (2): 255–262. дои : 10.1042/bj1650255 . ПМК 1164896 . ПМИД 336036 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]