Решетчатая светолистовая микроскопия
Решетчатая светолистовая микроскопия представляет собой модифицированную версию светолистовой флуоресцентной микроскопии , которая увеличивает скорость получения изображений и одновременно уменьшает повреждение клеток, вызванное фототоксичностью . Это достигается за счет использования структурированного светового листа для возбуждения флуоресценции в последовательных плоскостях образца, создавая временные серии трехмерных изображений, которые могут предоставить информацию о динамических биологических процессах. [1] [2]
Он был разработан в начале 2010-х годов командой под руководством Эрика Бетцига . [1] Согласно интервью, проведенному The Washington Post , Бетциг считает, что эта разработка будет иметь большее влияние, чем работа, которая принесла ему Нобелевскую премию по химии 2014 года за «разработку флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения ». [3]
Установка решетчатой светолистовой флуоресцентной микроскопии
[ редактировать ]
Решетчатая световая листовая микроскопия представляет собой новую комбинацию методов световой листовой флуоресцентной микроскопии , лучевой микроскопии Бесселя и микроскопии сверхвысокого разрешения (микроскопия со специально структурированным освещением, SIM). [4] ).
В решетчатой световой листовой микроскопии, очень похожей на световую листовую микроскопию, освещение образца происходит перпендикулярно детектированию изображения. Первоначально световой лист формируется путем растяжения линейно поляризованного кругового входного луча парой цилиндрических линз вдоль оси x и последующего сжатия его дополнительной парой линз вдоль оси z. [5] Эта модификация создает тонкий слой света, который затем проецируется на бинарный сегнетоэлектрический пространственный модулятор света (SLM). SLM — это устройство, которое пространственно изменяет форму волны светового луча. Свет, отраженный от SLM, используется для устранения нежелательной дифракции . Дифракция устраняется трансформирующей линзой, которая создает дифракционную картину Фраунгофера из отраженного света на непрозрачной маске, содержащей прозрачное кольцевое пространство . [5] Оптические решетки представляют собой двух- или трехмерные интерференционные картины, которые здесь создаются прозрачным кольцевым кольцом. Маска сопряжена x и z с гальванометрами . Это качество микроскопа важно для режима работы с дизерингом, когда световой лист должен колебаться в пределах оси x.
Решетчатый световой микроскоп имеет два режима работы: в режиме дизеринга световой лист быстро сканируется вдоль оси x, и на каждую плоскость Z записывается только одно изображение при нормальном разрешении, ограниченном дифракцией. [1] Второй режим работы — это режим микроскопии со структурированным освещением (SIM). SIM — это метод, при котором сетка возбуждающего света накладывается на образец и поэтапно поворачивается между захватом каждого изображения. [6] [7] [8] Эти изображения затем обрабатываются с помощью алгоритма для создания реконструированного изображения, превосходящего предел дифракции, встроенный в наши оптические инструменты.
Теория
[ редактировать ]
Решетчатую световую микроскопию можно рассматривать как усовершенствование лучевых световых микроскопов Бесселя. [9] с точки зрения осевого разрешения (также называемого разрешением по z). В световых листовых микроскопах с лучом Бесселя сначала создается недифрагирующий луч Бесселя , а затем размывается в направлении x, чтобы получить лист. Однако лепестки функции Бесселя несут столько же энергии, сколько и центральное пятно, что приводит к освещению за пределами глубины резкости объектива наблюдения.
Решетчатая световая листовая микроскопия направлена на уменьшение интенсивности внешних лепестков функции Бесселя за счет деструктивной интерференции . двумерная решетка Для этого создается из регулярно расположенных лучей Бесселя. Тогда деструктивную интерференцию можно вызвать путем тщательной настройки расстояния между лучами (то есть периода решетки).
На практике решетка интерферирующих лучей Бесселя создается с помощью пространственного модулятора света (ПМС), жидкокристаллического устройства, отдельные пиксели которого можно включать и выключать для отображения бинарного рисунка. Из-за матричной природы SLM сгенерированный шаблон содержит много нежелательных частот. Таким образом, они отфильтровываются с помощью кольца, расположенного в плоскости, сопряженной с задней фокальной плоскостью объектива (область Фурье).
Наконец, чтобы получить равномерную интенсивность на образце, а не на решетке, лист размывается с помощью гальванометра, колеблющегося в направлении x.
Улучшения в других методах
[ редактировать ]Решетчатая светолистовая микроскопия сочетает в себе высокое разрешение и четкость при высокой скорости получения изображений, не повреждая образцы в результате фотообесцвечивания . [1] Фотообесцвечивание является основной и весьма распространенной проблемой во флуоресцентной микроскопии, когда флуоресцентные метки теряют способность излучать фотоны при повторном возбуждении. В отличие от обычных флуоресцентных микроскопов, образцы в решетчатом световом микроскопе подвергаются фотообесцвечиванию со скоростью, значительно меньшей по сравнению с обычными методами (в традиционных методах это приводит к тому, что сигнал изображения становится слабее в ходе множественных возбуждений). Это позволяет делать более длинные выдержки без потери сигнала, что, в свою очередь, позволяет снимать видео в течение более длительных периодов времени. Метод решетки также позволяет разрешать от 200 до 1000 плоскостей в секунду, что является чрезвычайно высокой скоростью обработки изображений, позволяющей осуществлять непрерывный захват видео. Эта скорость захвата на один порядок выше, чем при возбуждении пучком Бесселя, и на два порядка выше, чем при конфокальной микроскопии с вращающимся диском. [1] Эти два преимущества в совокупности позволяют исследователям снимать очень подробные видеоролики в течение длительных периодов времени.
Ограничения
[ редактировать ]Решетчатая световая микроскопия ограничена прозрачными и тонкими образцами для достижения хорошего качества изображения. Качество полученного изображения ухудшается с увеличением глубины изображения. Это явление возникает из-за аберраций , вызванных образцом , и было высказано предположение, что для изображения образцов размером более 20–100 мкм потребуется адаптивная оптика . [1]
Разрешение
[ редактировать ]- SIM: разрешение xy 150 нм на 230 нм, разрешение z 280 нм
- Сглаживание: разрешение xy 230 нм на 230 нм, разрешение z ~370 нм.
Контраст
[ редактировать ]- Поскольку ширина полосы возбуждения составляет ~ 1,0 микрона, а глубина фокуса объектива обнаружения составляет ~ 1,1 микрона, большинство освещенных молекул находятся в фокальной плоскости.
Глубина образца
[ редактировать ]- Предполагается, что получение изображений глубиной более 20–100 микрон возможно за счет сочетания технологии решетчатых световых листов с адаптивной оптикой.
Приложения
[ редактировать ]Решётчатая световая микроскопия полезна для локализации клеток in vivo и получения сверхразрешения. Ограниченная полоса возбуждения решетчатых световых листов удерживает почти все освещенные клетки в фокусе. Уменьшение больших расфокусированных пятен позволяет точно отслеживать отдельные клетки с высокой молекулярной плотностью, что было недостижимо с помощью предыдущих методов микроскопии. [1] Следовательно, решетчатый световой лист используется для ряда динамических клеточных взаимодействий. Снижение фототоксичности создало возможности для изучения субклеточных процессов эмбрионов, не повреждая их живые ткани. Исследования изучили и количественно оценили степень весьма изменчивых моделей роста микротрубочек на протяжении митоза . Клетки Dictyostelium discoideum (слизевика) были визуализированы во время их быстрого хемотаксического движения навстречу друг другу и первоначального контакта.
агрегация Т-клеток Наблюдалась и клеток-мишеней, а также последующее образование иммунологического синапса . Достижения метода решетчатого листа выявили трехмерные модели движения актина , а также пластинчатое выпячивание в этих взаимодействиях. Увеличение скорости визуализации также позволило наблюдать быстро движущиеся нейтрофилы через внеклеточный матрикс в другом исследовании. [ нужна ссылка ] .
Этот метод, наряду с методами химических и генетических манипуляций, использовался для получения живого изображения вируса ( вируса, который был создан для добавления белков COVID-19 ), инфицирующего клетку, путем инъекции его генетического материала в эндосому первой клетки. время в Гарвардской медицинской школе в сотрудничестве с другими учреждениями. [10] [11]
Будущая работа
[ редактировать ]Методика активно разрабатывается в исследовательском кампусе Джанелия Медицинского института Говарда Хьюза . [12] Эрик Бетциг заявил, что его цель — объединить свою работу в области микроскопии для разработки «высокоскоростного инструмента с высоким разрешением и низким уровнем воздействия, который сможет заглянуть глубоко внутрь биологических систем». [3] Проникновение на глубину более 20–100 мкм может быть достигнуто путем сочетания решетчатой светолистовой микроскопии с адаптивной оптикой . [1]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г час Чен, Британская Колумбия; Легант, WR; Ван, К.; Шао, Л.; Милки, Делавэр; Дэвидсон, Миссури; Джанетопулос, К.; Ву, XS; Хаммер, Дж. А.; Лю, З.; английский, БП; Мимори-Киёсуэ, Ю.; Ромеро, ДП; Риттер, АТ; Липпинкотт-Шварц, Дж.; Фриц-Лэйлин, Л.; Маллинз, Р.Д.; Митчелл, DM; Бембенек, Ю.Н.; Рейманн, А.-К.; Бёме, Р.; Гриль, ЮЗ; Ван, Джей Ти; Сейду, Г.; Тулу, США; Кихарт, ДП; Бетциг, Э. (23 октября 2014 г.). «Решетчатая световая микроскопия: визуализация молекул эмбрионов с высоким пространственно-временным разрешением» . Наука . 346 (6208): 1257998. doi : 10.1126/science.1257998 . ПМЦ 4336192 . ПМИД 25342811 .
- ^ Кили, Джим; Гутников, Роберт (23 октября 2014 г.). «Новый микроскоп собирает динамические изображения молекул, оживляющих жизнь» . Новости ХХМИ . Чеви Чейз, доктор медицинских наук: Медицинский институт Говарда Хьюза . Проверено 28 октября 2014 г.
- ^ Jump up to: а б Фельтман, Рэйчел (23 октября 2014 г.). «Через несколько недель после получения Нобелевской премии за свой микроскоп Эрик Бетциг снова произвел революцию в микроскопии» . Блог Washington Post «Говоря о науке» . Проверено 4 сентября 2015 г.
- ^ Герра, Джон М. (26 июня 1995 г.). «Сверхразрешение благодаря освещению затухающими волнами, рожденными дифракцией» . Письма по прикладной физике . 66 (26): 3555–3557. дои : 10.1063/1.113814 . ISSN 0003-6951 .
- ^ Jump up to: а б Чен, Британская Колумбия; Легант, WR; Ван, К.; Шао, Л.; Милки, Делавэр; Дэвидсон, Миссури; Джанетопулос, К.; Ву, XS; Хаммер, Дж. А.; Лю, З.; английский, БП; Мимори-Киёсуэ, Ю.; Ромеро, ДП; Риттер, АТ; Липпинкотт-Шварц, Дж.; Фриц-Лэйлин, Л.; Маллинз, Р.Д.; Митчелл, DM; Бембенек, Ю.Н.; Рейманн, А.-К.; Бёме, Р.; Гриль, ЮЗ; Ван, Джей Ти; Сейду, Г.; Тулу, США; Кихарт, ДП; Бетциг, Э. (23 октября 2014 г.). «Решетчатая световая микроскопия: визуализация молекул эмбрионов с высоким пространственно-временным разрешением», Дополнительные материалы. Science 346 (6208): 1257998–1257998.
- ^ Герра, Джон М. (26 июня 1995 г.). «Сверхразрешение благодаря освещению затухающими волнами, рожденными дифракцией» . Письма по прикладной физике . 66 (26): 3555–3557. дои : 10.1063/1.113814 . ISSN 0003-6951 .
- ^ Патент США. № 5666197: Устройство и способы, использующие фазовый контроль и анализ затухающего освещения для визуализации и метрологии субволновой топографии боковой поверхности; сентябрь 1997 г.; Джон М. Герра. Назначен в корпорацию Polaroid.
- ^ Густафссон, МГ; Шао, Л; Карлтон, премьер-министр; Ван, CJ; Голубовская И.Н.; Канде, WZ; Агард, Д.А.; Седат, JW (июнь 2008 г.). «Удвоение трехмерного разрешения в широкопольной флуоресцентной микроскопии за счет структурированного освещения» . Биофизический журнал . 94 (12): 4957–70. Бибкод : 2008BpJ....94.4957G . дои : 10.1529/biophysj.107.120345 . ПМК 2397368 . ПМИД 18326650 .
- ^ Планшон, Томас А; Гао, Лян; Милки, Дэниел Э; Дэвидсон, Майкл В.; Гэлбрейт, Джеймс А.; Гэлбрейт, Кэтрин Дж; Бетциг, Эрик (2011). «Быстрая трехмерная изотропная визуализация живых клеток с использованием плоскостного освещения лучами Бесселя» . Природные методы . 8 (5): 417–423. дои : 10.1038/nmeth.1586 . ПМЦ 3626440 . ПМИД 21378978 .
- ^ «Взлом и проникновение» .
- ^ Крейцбергер, Алекс Дж.Б.; Саньял, Анвеша; Саминатан, Ананд; Блуайе, Луи-Мари; Штумпф, Спенсер; Лю, Чжомин; Оджа, Рави; Патьяс, Маркку Т.; Генейд, Ахмед; Сканавачи, Густаво; Дойл, Кэтрин А.; Сомервилл, Эллиотт; Да Кунья Коррейя, Рикардо Банго; Ди Каприо, Джузеппе; Топпила-Салми, Санна; Мякитие, Антти; Кисслинг, Волкер; Вапалахти, Олли; Уилан, Шон ПиДжей; Балистрери, Джузеппе; Кирххаузен, Том (20 сентября 2022 г.). «SARS-CoV-2 требует кислого pH для заражения клеток» . Труды Национальной академии наук . 119 (38): e2209514119. дои : 10.1073/pnas.2209514119 . ПМК 9196115 . ПМИД 36048924 .
- ^ Кресдж, Николь. «Микроскопы для масс» . Бюллетень HHMI . Медицинский институт Говарда Хьюза . Проверено 4 сентября 2015 г.
| Освещение и контрастные методы |
|  |
|---|---|---|
| Флуоресцентные методы | ||
| субдифракция предельные методы | ||
