Трехфотонная микроскопия

Не путать с генерацией третьей гармоники .

Трехфотонная микроскопия ( 3PEF микроскопия высокого разрешения, ) — флуоресцентная основанная на эффекте нелинейного возбуждения. В отличие от микроскопии с двухфотонным возбуждением , здесь используются три возбуждающих фотона. Обычно он использует лазеры с длиной волны 1300 нм или более длинные для возбуждения флуоресцентных красителей тремя одновременно поглощаемыми фотонами. Затем флуоресцентные красители испускают один фотон, энергия которого (немного меньше) в три раза превышает энергию каждого падающего фотона. По сравнению с двухфотонной микроскопией трехфотонная микроскопия уменьшает флуоресценцию вдали от фокальной плоскости на $1/z^{4}$, что намного быстрее, чем в двухфотонной микроскопии $1/z^{2}$. Кроме того, в трехфотонной микроскопии используется ближний инфракрасный свет с меньшим эффектом рассеяния тканей . Это приводит к тому, что трехфотонная микроскопия имеет более высокое разрешение , чем традиционная микроскопия .

Концепция

Трехфотонная возбужденная флуоресценция была впервые обнаружена Сингхом и Брэдли в 1964 году, когда они оценили сечение трехфотонного поглощения кристаллов нафталина. В 1996 году Стефан В. Хелл разработал эксперименты для проверки возможности применения трехфотонного возбуждения в сканирующей флуоресцентной микроскопии, что еще раз доказало концепцию трехфотонно возбужденной флуоресценции.

Трехфотонная микроскопия имеет некоторые общие черты с микроскопией двухфотонного возбуждения . Оба они используют метод точечного сканирования. Оба способны отображать 3D-образцы, регулируя положение фокусирующей линзы в осевом и поперечном направлениях. Структуры обеих систем не требуют точечного отверстия для блокировки расфокусированного света. Однако трехфотонная микроскопия отличается от микроскопии с двухфотонным возбуждением функцией рассеяния точки , разрешением , глубиной проникновения, устойчивостью к расфокусированному свету и силой фотообесцвечивания .

При трехфотонном возбуждении флуорофор практически одновременно поглощает три фотона. Длина волны возбуждающего лазера составляет около 1200 нм или более в трехфотонной микроскопии, при этом длина волны излучения немного превышает одну треть длины волны возбуждения. Трехфотонная микроскопия обеспечивает более глубокое проникновение в ткани из-за более длинных волн возбуждения и нелинейного возбуждения более высокого порядка. Однако для трехфотонного микроскопа необходим лазер большей мощности из-за относительно меньшего сечения красителей для трехфотонного возбуждения, что порядка $10^{-82}{\text{cm}}^{6}(s/{\text{photon}})^{2}$. Это намного меньше типичных сечений двухфотонного возбуждения $10^{-49}{\text{cm}}^{4}s/{\text{photon}}$. Ультракороткие импульсы обычно составляют около 100 фс.

Разрешение

Для трехфотонной флуоресцентной сканирующей микроскопии трехмерную функцию рассеяния точки интенсивности (IPSF) можно обозначить как:

$h_{i}(\nu ,u)=\left|I_{1}(\nu /3,u/3)\right|^{3}I_{2}(\nu ,u)\otimes _{3}D$,

где $\otimes _{3}$обозначает операцию трехмерной свертки, $D$ обозначает чувствительность некогерентного детектора по интенсивности, а $I_{1}(\nu ,u)$, $I_{2}(\nu ,u)$ обозначает 3-D IPSF для объектива и коллекторной линзы в однофотонной флуоресценции соответственно. 3-D IPSF $I_{1}(\nu ,u)$ может быть выражено в

$I_{1}(\nu ,u)=\left|\int _{0}^{1}2J_{0}(\nu \rho )\exp(iu/2)\rho d\rho \right|^{2}$,

где $J_{0}$ является функцией Бесселя первого рода нулевого порядка. Осевые и радиальные координаты $u$ и $\nu$ определяются

$u=(8\pi /\lambda _{f})z\sin ^{2}(\alpha _{0}/2)$и

$\nu =(2\pi /\lambda _{f})r\ \sin \ \alpha _{0}$,

где $\alpha _{0}$– числовая апертура объектива, $z$ это настоящая расфокусировка, и $r$ – радиальные координаты.

Сочетание с другими многофотонными методами

Корреляционные изображения могут быть получены с использованием различных многофотонных схем, таких как 2PEF , 3PEF и генерация третьей гармоники (THG), параллельно (поскольку соответствующие длины волн различны, их можно легко разделить на разные детекторы). Затем строится многоканальное изображение.

3PEF также сравнивают с 2PEF : он обычно дает меньшее ухудшение отношения сигнал/фон (SBR) с глубиной, даже если излучаемый сигнал меньше, чем при 2PEF.

Разработка

После того, как Сингх и Брэдли наблюдали флуоресценцию с трехфотонным возбуждением и в дальнейшем подтвердили Хеллом, Крис Сюй и Уотт У. Уэбб сообщили об измерении сечений возбуждения нескольких нативных хромофоров и биологических индикаторов, а также реализовали флуоресценцию с трехфотонным возбуждением в лазерной сканирующей микроскопии. живых клеток. В ноябре 1996 года Дэвид Вокосин применил флуоресценцию с трехфотонным возбуждением для фиксированной визуализации биологических образцов in vivo.

В 2010-х годах трехфотонная микроскопия была применена для визуализации глубоких тканей с использованием длин волн возбуждения более 1060 нм. В январе 2013 года Хортон, Ван, Кобат и Сюй изобрели глубокую визуализацию in vivo интактного мозга мыши , применив метод точечного сканирования на трехфотонном микроскопе в длинноволновом окне 1700 нм. В феврале 2017 года Димитр Узунов, Тайню Ван и Крис Сюй продемонстрировали визуализацию глубокой активности меченных GCaMP6 нейронов в гиппокампе интактного мозга взрослой мыши с помощью трехфотонной микроскопии в окне длины волны 1300 нм. В мае 2017 года Роулендс применил широкопольное трехфотонное возбуждение к трехфотонному микроскопу для большей глубины проникновения. В октябре 2018 года Т. Ван, Д. Узунов и С. Сюй смогли визуализировать сосудистую сеть и активность кальция GCaMP6 с помощью трехфотонного микроскопа через интактный череп мыши.

Приложения

Трехфотонная микроскопия имеет схожие области применения с микроскопией двухфотонного возбуждения, включая нейробиологию, и онкология. Однако по сравнению со стандартным однофотонным или двухфотонным возбуждением трехфотонное возбуждение имеет ряд преимуществ, таких как использование более длинных волн, уменьшающее эффекты рассеяния света и увеличивающее глубину проникновения луча освещения в образец. Нелинейный характер трехфотонной микроскопии ограничивает мишень возбуждения меньшим объемом, уменьшая расфокусированный свет, а также минимизируя фотообесцвечивание биологического образца. Эти преимущества трехфотонной микроскопии дают ей преимущество в визуализации морфологии и физиологии тканей in vivo и ex vivo на клеточном уровне глубоко внутри рассеивающей ткани. и быстрая объемная визуализация. В недавнем исследовании Сюй продемонстрировал потенциал трехфотонной визуализации для неинвазивных исследований живых биологических систем. В статье использовалась трехфотонная флуоресцентная микроскопия при спектральном окне возбуждения 1320 нм для визуализации структуры и функций мозга мыши через неповрежденный череп с высоким пространственным и временным разрешением (латеральная и осевая ширина на полувысоте составляла 0,96 мкм и 4,6 мкм) и большим полем зрения. (сотни микрометров) и на значительной глубине (>500 мкм). Эта работа демонстрирует преимущество нелинейного возбуждения более высокого порядка для визуализации через слой с высокой степенью рассеивания в дополнение к ранее сообщенному преимуществу 3PM для глубокой визуализации плотно меченных образцов. Также сообщалось о локализованной изомеризации фотопереключаемых лекарств in vivo с использованием трехфотонного возбуждения при длине волны 1560 нм, которая использовалась для контроля активности нейронов фармакологически специфичным способом.

См. также

• Лазерное сканирование
• Нелинейная оптика
• Микроскопия двухфотонного возбуждения