Трехфотонная микроскопия
Трехфотонная микроскопия ( 3PEF микроскопия высокого разрешения, ) — флуоресцентная основанная на эффекте нелинейного возбуждения. [1] [2] [3] В отличие от микроскопии с двухфотонным возбуждением , здесь используются три возбуждающих фотона. Обычно он использует лазеры с длиной волны 1300 нм или более длинные для возбуждения флуоресцентных красителей тремя одновременно поглощаемыми фотонами. Затем флуоресцентные красители испускают один фотон, энергия которого (немного меньше) в три раза превышает энергию каждого падающего фотона. По сравнению с двухфотонной микроскопией трехфотонная микроскопия уменьшает флуоресценцию вдали от фокальной плоскости на , что намного быстрее, чем в двухфотонной микроскопии . [4] Кроме того, в трехфотонной микроскопии используется ближний инфракрасный свет с меньшим эффектом рассеяния тканей . Это приводит к тому, что трехфотонная микроскопия имеет более высокое разрешение , чем традиционная микроскопия .
Концепция
[ редактировать ]Трехфотонная возбужденная флуоресценция была впервые обнаружена Сингхом и Брэдли в 1964 году, когда они оценили сечение трехфотонного поглощения кристаллов нафталина. [5] В 1996 году Стефан В. Хелл разработал эксперименты для проверки возможности применения трехфотонного возбуждения в сканирующей флуоресцентной микроскопии, что еще раз доказало концепцию трехфотонно возбужденной флуоресценции. [6]
Трехфотонная микроскопия имеет некоторые общие черты с микроскопией двухфотонного возбуждения . Оба они используют метод точечного сканирования. Оба способны отображать 3D-образцы, регулируя положение фокусирующей линзы в осевом и поперечном направлениях. Структуры обеих систем не требуют точечного отверстия для блокировки расфокусированного света. Однако трехфотонная микроскопия отличается от микроскопии с двухфотонным возбуждением функцией рассеяния точки , разрешением , глубиной проникновения, устойчивостью к расфокусированному свету и силой фотообесцвечивания .
При трехфотонном возбуждении флуорофор практически одновременно поглощает три фотона. Длина волны возбуждающего лазера составляет около 1200 нм или более в трехфотонной микроскопии, при этом длина волны излучения немного превышает одну треть длины волны возбуждения. Трехфотонная микроскопия обеспечивает более глубокое проникновение в ткани из-за более длинных волн возбуждения и нелинейного возбуждения более высокого порядка. Однако для трехфотонного микроскопа необходим лазер большей мощности из-за относительно меньшего сечения красителей для трехфотонного возбуждения, что порядка . Это намного меньше типичных сечений двухфотонного возбуждения . [7] Ультракороткие импульсы обычно составляют около 100 фс.
Разрешение
[ редактировать ]Для трехфотонной флуоресцентной сканирующей микроскопии трехмерную функцию рассеяния точки интенсивности (IPSF) можно обозначить как:
- , [8]
где обозначает операцию трехмерной свертки, обозначает чувствительность некогерентного детектора по интенсивности, а , обозначает 3-D IPSF для объектива и коллекторной линзы в однофотонной флуоресценции соответственно. 3-D IPSF может быть выражено в
- , [8]
где является функцией Бесселя первого рода нулевого порядка. Осевые и радиальные координаты и определяются
- и
- , [8]
где – числовая апертура объектива, это настоящая расфокусировка, и – радиальные координаты.
Сочетание с другими многофотонными методами
[ редактировать ]Корреляционные изображения могут быть получены с использованием различных многофотонных схем, таких как 2PEF , 3PEF и генерация третьей гармоники (THG), параллельно (поскольку соответствующие длины волн различны, их можно легко разделить на разные детекторы). Затем строится многоканальное изображение. [9]
3PEF также сравнивают с 2PEF : он обычно дает меньшее ухудшение отношения сигнал/фон (SBR) с глубиной, даже если излучаемый сигнал меньше, чем при 2PEF. [9]
Разработка
[ редактировать ]После того, как Сингх и Брэдли наблюдали флуоресценцию с трехфотонным возбуждением и в дальнейшем подтвердили Хеллом, Крис Сюй и Уотт У. Уэбб сообщили об измерении сечений возбуждения нескольких нативных хромофоров и биологических индикаторов, а также реализовали флуоресценцию с трехфотонным возбуждением в лазерной сканирующей микроскопии. живых клеток. [10] В ноябре 1996 года Дэвид Вокосин применил флуоресценцию с трехфотонным возбуждением для фиксированной визуализации биологических образцов in vivo.
В 2010-х годах трехфотонная микроскопия была применена для визуализации глубоких тканей с использованием длин волн возбуждения более 1060 нм. В январе 2013 года Хортон, Ван, Кобат и Сюй изобрели глубокую визуализацию in vivo интактного мозга мыши , применив метод точечного сканирования на трехфотонном микроскопе в длинноволновом окне 1700 нм. [4] В феврале 2017 года Димитр Узунов, Тайню Ван и Крис Сюй продемонстрировали визуализацию глубокой активности меченных GCaMP6 нейронов в гиппокампе интактного мозга взрослой мыши с помощью трехфотонной микроскопии в окне длины волны 1300 нм. [11] В мае 2017 года Роулендс применил широкопольное трехфотонное возбуждение к трехфотонному микроскопу для большей глубины проникновения. [12] В октябре 2018 года Т. Ван, Д. Узунов и С. Сюй смогли визуализировать сосудистую сеть и активность кальция GCaMP6 с помощью трехфотонного микроскопа через интактный череп мыши. [13]
Приложения
[ редактировать ]Трехфотонная микроскопия имеет схожие области применения с микроскопией двухфотонного возбуждения, включая нейробиологию, [14] и онкология. [15] Однако по сравнению со стандартным однофотонным или двухфотонным возбуждением трехфотонное возбуждение имеет ряд преимуществ, таких как использование более длинных волн, уменьшающее эффекты рассеяния света и увеличивающее глубину проникновения луча освещения в образец. [16] Нелинейный характер трехфотонной микроскопии ограничивает мишень возбуждения меньшим объемом, уменьшая расфокусированный свет, а также минимизируя фотообесцвечивание биологического образца. [16] Эти преимущества трехфотонной микроскопии дают ей преимущество в визуализации морфологии и физиологии тканей in vivo и ex vivo на клеточном уровне глубоко внутри рассеивающей ткани. [4] и быстрая объемная визуализация. [17] В недавнем исследовании Сюй продемонстрировал потенциал трехфотонной визуализации для неинвазивных исследований живых биологических систем. [13] В статье использовалась трехфотонная флуоресцентная микроскопия при спектральном окне возбуждения 1320 нм для визуализации структуры и функций мозга мыши через неповрежденный череп с высоким пространственным и временным разрешением (латеральная и осевая ширина на полувысоте составляла 0,96 мкм и 4,6 мкм) и большим полем зрения. (сотни микрометров) и на значительной глубине (>500 мкм). Эта работа демонстрирует преимущество нелинейного возбуждения более высокого порядка для визуализации через слой с высокой степенью рассеивания в дополнение к ранее сообщенному преимуществу 3PM для глубокой визуализации плотно меченных образцов. Также сообщалось о локализованной изомеризации фотопереключаемых лекарств in vivo с использованием трехфотонного возбуждения при длине волны 1560 нм, которая использовалась для контроля активности нейронов фармакологически специфичным способом. [18]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Хортон, Николас Г.; Ван, Кэ; Кобат, Демирхан; Кларк, Кэтрин Г.; Уайз, Фрэнк В.; Шаффер, Крис Б.; Сюй, Крис (01 марта 2013 г.). «Трехфотонная микроскопия подкорковых структур интактного мозга мыши in vivo» . Природная фотоника . 7 (3): 205–209. Бибкод : 2013NaPho...7..205H . дои : 10.1038/nphoton.2012.336 . ПМЦ 3864872 . ПМИД 24353743 .
- ^ Чэнь, Бинъин; Хуан, Сяошуай; Цзэн, Цзяньчжи; Чэнь, Пан, Мэйцзюнь; Чжао, Чжэ, Юньфэн (29 марта 2018 г.) . «Лучная трехфотонная микроскопия» . Биомедицинская оптика Экспресс . 9 (4): 1992–2000. : 10.1364 /BOE.9.001992 . PMC 5905939. . PMID 29675334 doi
- ^ Уильямс, Ребекка М.; Шир, Джейсон Б.; Зипфель, Уоррен Р.; Маити, Судипта; Уэбб, Уотт В. (1 апреля 1999 г.). «Процессы секреции тучных клеток слизистой оболочки, визуализированные с помощью трехфотонной микроскопии автофлуоресценции 5-гидрокситриптамина» . Биофизический журнал . 76 (4): 1835–1846. Бибкод : 1999BpJ....76.1835W . дои : 10.1016/S0006-3495(99)77343-1 . ПМК 1300160 . ПМИД 10096882 .
- ^ Jump up to: а б с Хортон, Николас; Ван, Кэ; Кобат, Демирхан; Кларк, Кэтрин; Мудро, Фрэнк; Шаффер, Крис; Сюй, Крис (20 января 2013 г.). «Трехфотонная микроскопия подкорковых структур интактного мозга мыши in vivo» . Природная фотоника . 7 (3): 205–209. Бибкод : 2013NaPho...7..205H . дои : 10.1038/nphoton.2012.336 . ПМЦ 3864872 . ПМИД 24353743 .
- ^ Сингх, С.; Брэдли, LT (1 июня 1964 г.). «Трехфотонное поглощение в кристаллах нафталина при лазерном возбуждении». Письма о физических отзывах . 12 (22): 612–614. Бибкод : 1964PhRvL..12..612S . дои : 10.1103/PhysRevLett.12.612 .
- ^ Черт, ЮВ; Бальманн, К; Шредер, М; Сойни, А; Малак, HM; Грычинский, И; Лакович-младший (1 января 1996 г.). «Трехфотонное возбуждение во флуоресцентной микроскопии» . Журнал биомедицинской оптики . 1 (1): 71–74. Бибкод : 1996JBO.....1...71H . дои : 10.1117/12.229062 . ПМИД 23014645 .
- ^ Тода, Кейсуке; Исобе, Кейсуке; Намики, Ханаан; Кавано, Хироюки; Мияваки, Ацуши; Мидорикава, Кацуми (июнь 2017 г.). «Микроскопия с временной фокусировкой с использованием флуоресценции трехфотонного возбуждения с усилителем чирпированных импульсов Yb-волокна длительностью 92 фс» . Биомедицинская оптика Экспресс . 8 (6): 2796–2806. дои : 10.1364/BOE.8.002796 . ПМК 5480430 . ПМИД 28663907 .
- ^ Jump up to: а б с Гу, Мин (1 июля 1996 г.). «Разрешение в трехфотонной флуоресцентной сканирующей микроскопии». Оптические письма . 21 (13): 988–990. Бибкод : 1996OptL...21..988G . дои : 10.1364/OL.21.000988 . ПМИД 19876227 .
- ^ Jump up to: а б Гуесми, Хмаиес; Абделадим, Ламия; Тозер, Самуэль; Мау, Пьер; Кумамото, Такума; Юркус, Каролис; Риго, Филипп; Лулье, Карин; Дрей, Николас; Жорж, Патрик; Ханна, Марк; Ливе, Жан; Супатто, Вилли; Борепер, Эммануэль; Дрюон, Фредерик (2018). «Двухцветная трехфотонная микроскопия глубоких тканей с многодиапазонным инфракрасным лазером» . Свет: наука и приложения . 7 (1): 12. Бибкод : 2018LSA.....7...12G . дои : 10.1038/s41377-018-0012-2 . ISSN 2047-7538 . ПМК 6107000 . ПМИД 30839589 .
- ^ Сюй, С; Зипфель, В; Шир, Дж. Б.; Уильямс, РМ; Уэбб, WW (1 октября 1996 г.). «Многофотонное возбуждение флуоресценции: новые спектральные окна для биологической нелинейной микроскопии» . Proc Natl Acad Sci США . 93 (20): 10763–10768. Бибкод : 1996PNAS...9310763X . дои : 10.1073/pnas.93.20.10763 . ПМК 38229 . ПМИД 8855254 .
- ^ Уззунов, Дмитрий; Ван, Тяньюй; Ван, Менгран; Фэн, Даниэль; Хортон, Николас; Крус-Эрнандес, Жан; Ченг, Ютин; Реймер, Джейкоб; Толиас, Андреас; Нисимура, Нозоми; Сюй, Крис (20 февраля 2017 г.). «Трехфотонная визуализация in vivo активности нейронов, меченных GCaMP6, глубоко в интактном мозге мыши» . Природные методы . 14 (4): 388–390. дои : 10.1038/nmeth.4183 . ПМК 6441362 . ПМИД 28218900 .
- ^ Роулендс, Кристофер; Парк, Демиан; Брунс, Оливер; Пяткевич Кирилл; Фукумура, Дай; Джайн, Ракеш; Бавенди, Мунги; Бойден, Эдвард; Итак, Питер (5 мая 2017). «Широкопольное трехфотонное возбуждение в биологических образцах» . Свет: наука и приложения . 6 (5): e16255. Бибкод : 2017LSA.....6E6255R . дои : 10.1038/lsa.2016.255 . ПМЦ 5687557 . ПМИД 29152380 . ПроКвест 1917694404 .
- ^ Jump up to: а б Ван, Тяньюй; Уззунов, Дмитрий; У, Чуньянь; Хортон, Николас; Чжан, Бинь; У, Чэн-Сюнь; Чжан, Яньпин; Шнитцер, Марк; Сюй, Крис (10 сентября 2018 г.). «Трехфотонная визуализация структуры и функций мозга мыши через неповрежденный череп» . Природные методы . 15 (10): 789–792. дои : 10.1038/s41592-018-0115-y . ПМК 6188644 . ПМИД 30202059 .
- ^ Керр, Джейсон; Денк, Винфрид (март 2008 г.). «Визуализация in vivo: наблюдение за мозгом в действии». Обзоры природы Неврология . 9 (3): 195–205. дои : 10.1038/nrn2338 . ПМИД 18270513 . S2CID 6301173 .
- ^ Уильямс, Ребекка М.; Флескен-Никитин, Андреа; Элленсон, Лора Хедрик; Коннолли, Дениз С.; Гамильтон, Томас К.; Никитин, Александр Ю.; Зипфель, Уоррен Р. (июнь 2010 г.). «Стратегии визуализации эпителиального рака яичников с высоким разрешением с помощью лапароскопической нелинейной микроскопии» . Трансляционная онкология . 3 (3): 181–194. дои : 10.1593/tlo.09310 . ПМЦ 2887648 . ПМИД 20563260 .
- ^ Jump up to: а б Эскобет-Монтальбан, Адриа; Гаспароли, Федерико М.; Нилк, Джонатан; Лю, Пэнфэй; Ян, Чжэнъи; Дхолакия, Кишан (октябрь 2018 г.). «Трехфотонная светолистовая флуоресцентная микроскопия». Оптические письма . 43 (21): 5484–5487. Бибкод : 2018OptL...43.5484E . дои : 10.1364/ол.43.005484 . hdl : 10023/18816 . ПМИД 30383037 .
- ^ Чэнь, Сяошуай; Цзэн, Цзяньчжи; Ху, Яньхуэй; Чжоу, Чжуань; Чжиган, Крис; Ли, Юлун; Ван, Айминь (апрель 2018 г.). «Быстрая объемная визуализация с помощью трехфотонной микроскопии» . Biomedical Optics Express . 9 (4): 1992–2000 . : 10.1364 . PMC 5905939 . бнэ.9.001992 /
- ^ Сортино, Розальба; Конкеро, Марина; Кастро-Ольвера, Густаво; Гелаберт, Рикар; Морено, Майкл; Риефоло, Фабио; Матера, Карло; Фернандес-Кастильо, Ноэлия; Агнетта, Люк; Декер, Майкл; Ллуч, Хосе Мария; Эрнандо, Хорди; Лоза-Альварес, Пабло; Горостиза, Пау (12 октября 2023 г.). «Трехфотонная инфракрасная стимуляция эндогенных нейрорецепторов in vivo» . Angewandte Chemie, международное издание . дои : 10.1002/anie.202311181 . hdl : 2445/203764 . ISSN 1433-7851 .