Микроскопия интерференционного отражения

Интерференционно-отражательная микроскопия ( IRM ), также называемая отражательной интерференционно-контрастной микроскопией ( RICM ) или отражательно-контрастной микроскопией ( RCM ) в зависимости от конкретных используемых оптических элементов, представляет собой метод оптической микроскопии , который использует эффекты интерференции тонкой пленки для формирования изображения объекта. на стеклянной поверхности. Интенсивность . сигнала является мерой близости объекта к поверхности стекла Этот метод можно использовать для изучения событий на клеточной мембране без использования (флуоресцентной) метки, как в случае TIRF-микроскопии .

История и название

В 1964 году Адам С.Г. Кертис ввел термин «Интерференционно-отражательная микроскопия» ( IRM ), применив его в области клеточной биологии для изучения эмбриональных фибробластов сердца цыплят. ^[1]^[2] Он использовал IRM для изучения мест адгезии и расстояний между фибробластами, отметив, что контакт со стеклом в основном ограничивался периферией клеток и псевдоподиями . ^[1]

В 1975 году Йохан Себастьян Плоэм представил усовершенствование IRM (опубликованное в главе книги). ^[3]), которую он назвал отражательной контрастной микроскопией ( RCM ). ^[4] Улучшение заключается в использовании так называемого антигибкого объектива и скрещенных поляризаторов для дальнейшего уменьшения рассеянного света в оптической системе. Сегодня эта схема в основном называется отражательной интерференционно-контрастной микроскопией ( RICM ). ^[5]^[6] название которого было введено Барайтером-Ханом и Конрадом Беком в 1979 году. ^[7]

Однако термин IRM иногда используется для описания установки RICM. Множество названий, используемых для описания этой техники, вызвало некоторую путаницу и обсуждалось еще в 1985 году Вершуереном. ^[8]

Теория

Чтобы сформировать изображение прикрепленной клетки, свет определенной длины волны пропускают через поляризатор . Этот линейно поляризованный свет отражается светоделителем в сторону объектива , который фокусирует свет на образце. Поверхность стекла в определенной степени отражает и будет отражать поляризованный свет. Свет, не отраженный стеклом, проникнет в клетку и отразится клеточной мембраной. Могут возникнуть три ситуации. Во-первых, когда мембрана находится близко к стеклу, отраженный свет от стекла смещается на половину длины волны, так что свет, отраженный от мембраны, будет иметь фазовый сдвиг по сравнению с отраженным светом от стеклянных фаз и, следовательно, компенсировать друг друга. выход ( помехи ). Эта интерференция приводит к появлению темного пикселя на конечном изображении (левый случай на рисунке). Во-вторых, когда мембрана не прикреплена к стеклу, отражение от мембраны имеет меньший фазовый сдвиг по сравнению с отраженным светом от стекла, и поэтому они не будут компенсировать друг друга, в результате чего пиксель на изображении будет ярким ( правый случай на рисунке). В-третьих, когда образца нет, обнаруживается только отраженный от стекла свет, который на конечном изображении будет выглядеть как яркие пиксели.

Отраженный свет возвращается к светоделителю и проходит через второй поляризатор, который устраняет рассеянный свет, прежде чем достичь детектора (обычно ПЗС-камеры ), чтобы сформировать окончательное изображение. Поляризаторы могут повысить эффективность за счет уменьшения рассеянного света; однако в современной установке с чувствительной цифровой камерой они не требуются. ^[9]

Теория

Отражение вызвано изменением показателя преломления, поэтому на каждой границе будет отражаться часть света. Количество отражения определяется коэффициентом отражения $r_{12}\!$ , по следующему правилу: ^[8]

$r_{12}={\frac {n_{1}-n_{2}}{n_{1}+n_{2}}}$

Отражательная способность $R\!$ представляет собой отношение интенсивности отраженного света ( $I_{r}\!$ ) и интенсивность падающего света ( $I_{i}\!$ ): ^[8]

$R={\frac {I_{r}}{I_{i}}}=\left\lbrack {\frac {n_{1}-n_{2}}{n_{1}+n_{2}}}\right\rbrack ^{2}={r_{12}}^{2}$

Используя типичные показатели преломления для стекла (1,50–1,54, см. список ), воды (1,31, см. список ), клеточной мембраны (1,48) ^[10] и цитозоль (1,35), ^[10] можно рассчитать долю света, отражаемую каждым интерфейсом. Количество отражения увеличивается по мере увеличения разницы между показателями преломления, что приводит к большому отражению от границы раздела между поверхностью стекла и культуральной средой (примерно равному воде: 1,31–1,33). Это означает, что без кюветы изображение будет ярким, тогда как при прикрепленной кювете разница между средой и мембраной вызывает большое отражение, слегка сдвинутое по фазе, вызывающее интерференцию со светом, отраженным стеклом. Поскольку амплитуда света, отраженного от границы раздела среда-мембрана, уменьшается из-за рассеяния, прикрепленная область будет выглядеть темнее, но не полностью черной. Поскольку конус света, сфокусированный на образце, приводит к падению света под разными углами, существует широкий диапазон интерференционных картин. Когда узоры отличаются менее чем на 1 длину волны (полоса нулевого порядка), узоры сходятся, что приводит к увеличению интенсивности. Этого можно добиться, используя объектив с числовой апертурой больше 1. ^[8]

Требования

Чтобы получить изображение клеток с помощью IRM, микроскопу необходимы как минимум следующие элементы: 1) источник света, например галогенная лампа, 2) оптический фильтр (пропускающий небольшой диапазон длин волн) и 3) светоделитель. (который отражает 50% и пропускает 50% выбранной длины волны).

Источник света должен излучать свет высокой интенсивности, так как большая часть света будет потеряна светоделителем и самим образцом. Различные длины волн приводят к разным изображениям IRM; Берейтер-Хан и его коллеги показали, что для их клеток PtK 2 свет с длиной волны 546 нм обеспечивает лучший контраст, чем синий свет с длиной волны 436 нм. ^[7] В базовую теорию IRM было внесено множество усовершенствований, большинство из которых повышают эффективность и результативность формирования изображений. Поместив поляризаторы и четвертьволновую пластинку между светоделителем и образцом, линейно поляризованный свет можно преобразовать в свет с круговой поляризацией , а затем снова преобразовать в линейно поляризованный свет, что повышает эффективность системы. В статье о круговом поляризаторе этот процесс подробно обсуждается. Кроме того, включив второй поляризатор, который повернут на 90° по сравнению с первым поляризатором, можно предотвратить попадание рассеянного света в детектор, увеличивая соотношение сигнал/шум (см. рисунок 2 документа Verschueren). ^[8]).

Биологические применения

Существует несколько способов использования IRM для изучения биологических образцов. Ранние примеры использования метода, ориентированного на клеточную адгезию. ^[1] и миграция клеток . ^[11]

Слияние пузырьков

Слияние пузырьков визуализируется с помощью IRM. Масштабная линейка соответствует 2 мкм.

Совсем недавно этот метод был использован для изучения экзоцитоза в хромаффинных клетках . ^[9] При визуализации с помощью DIC хромаффинные клетки выглядят как круглые клетки с небольшими выступами. Когда ту же клетку визуализируют с помощью IRM, след клетки на стекле можно четко увидеть как темную область с небольшими выступами. Когда везикулы сливаются с мембраной, они выглядят как маленькие светлые кружочки на темном отпечатке (светлые пятна в верхней ячейке на правой панели).

Пример слияния везикул в хромаффинных клетках с использованием IRM показан в фильме 1. При стимуляции 60 мМ калия внутри темного следа хромаффинной клетки начинают появляться множественные яркие пятна в результате экзоцитоза гранул с плотным ядром . Поскольку IRM не требует флуоресцентной метки, его можно комбинировать с другими методами визуализации, такими как эпифлуоресценция и TIRF-микроскопия, для изучения динамики белков вместе с экзоцитозом и эндоцитозом везикул. Еще одним преимуществом отсутствия флуоресцентных меток является снижение фототоксичности .

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б ^с Кертис А.С. (февраль 1964 г.). «МЕХАНИЗМ АДГЕЗИИ КЛЕТОК К СТЕКЛУ: Исследование методом интерференционно-отражательной микроскопии» . Журнал клеточной биологии . 20 (2): 199–215. дои : 10.1083/jcb.20.2.199 . ПМК 2106393 . PMID 14126869 .
^ Филлер TJ, Peuker ET (апрель 2000 г.). «Отражательная контрастная микроскопия (ОКМ): забытый метод?». Журнал патологии . 190 (5): 635–8. doi : 10.1002/(SICI)1096-9896(200004)190:5<635::AID-PATH571>3.0.CO;2-E . ПМИД 10727991 . S2CID 43800311 .
^ Ферт, Ральф ван (1975). «Глава 27: Отражательно-контрастная микроскопия как инструмент исследования прикрепления живых клеток к поверхности стекла». Мононуклеарные фагоциты: в иммунитете, инфекции и патологии . Оксфорд: Блэквелл Сайентифик. стр. 405–421. ISBN 0-632-00471-1 . ОСЛК 2701405 .
^ Плоэм, Йохан Себастьян (21 февраля 2019 г.). «Применение отражательно-контрастной микроскопии, включая чувствительное обнаружение результатов гибридизации in situ, обзор». Журнал микроскопии . 274 (2). Уайли: 79–86. дои : 10.1111/jmi.12785 . ISSN 0022-2720 . ПМИД 30720204 . S2CID 73431526 .
^ Теодоли, О.; Хуанг, З.-Х.; Валинья, М.-П. (30 ноября 2009 г.). «Новое моделирование отражательной интерференционной контрастной микроскопии, включая эффекты поляризации и числовой апертуры: применение к нанометрическим измерениям расстояний и реконструкции профиля объекта» (PDF) . Ленгмюр . 26 (3). Американское химическое общество (ACS): 1940–1948. дои : 10.1021/la902504y . ISSN 0743-7463 . ПМИД 19947618 .
^ Лимозин, Лоран; Сенгупта, Хейя (3 ноября 2009 г.). «Количественная отражательная интерференционно-контрастная микроскопия (RICM) мягких веществ и клеточной адгезии». ХимияФизХим . 10 (16). Уайли: 2752–2768. дои : 10.1002/cphc.200900601 . ISSN 1439-4235 .
^ Jump up to: ^а ^б Берейтер-Хан Дж., Фокс CH, Торелл Б. (сентябрь 1979 г.). «Количественная отражательно-контрастная микроскопия живых клеток» . Журнал клеточной биологии . 82 (3): 767–79. дои : 10.1083/jcb.82.3.767 . ПМК 2110483 . ПМИД 389938 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Вершуерен Х (апрель 1985 г.). «Микроскопия интерференционного отражения в клеточной биологии: методология и приложения» . Журнал клеточной науки . 75 (1): 279–301. дои : 10.1242/jcs.75.1.279 . ПМИД 3900106 .
^ Jump up to: ^а ^б Ву ММ, Льобет А, Лагнадо Л (ноябрь 2009 г.). «Слабая связь между кальциевыми каналами и местами экзоцитоза в хромаффинных клетках» . Журнал физиологии . 587 (Часть 22): 5377–91. дои : 10.1113/jphysicalol.2009.176065 . ПМЦ 2793871 . ПМИД 19752110 .
^ Jump up to: ^а ^б Данн, Эндрю Кеннет (1997). «Клеточная структура» . Светорассеивающие свойства клеток (кандидатская диссертация). Техасский университет в Остине . OCLC 39949488 . Проверено 23 февраля 2010 г.
^ Годвин С.Л., Флетчер М., Берчард Р.П. (сентябрь 1989 г.). «Микроскопическое исследование интерференционного отражения мест ассоциации скользящих бактерий со стеклянными субстратами» . Журнал бактериологии . 171 (9): 4589–94. дои : 10.1128/jb.171.9.4589-4594.1989 . ПМК 210255 . ПМИД 2768185 .

Дальнейшее чтение

Лимозин, Лоран; Сенгупта, Хейя (9 ноября 2009 г.). «Количественная отражательная интерференционно-контрастная микроскопия (RICM) мягких веществ и клеточной адгезии». ХимияФизХим . 10 (16): 2752–2768. дои : 10.1002/cphc.200900601 . ISSN 1439-4235 .

Внешние ссылки

[Curtis1964-1] Jump up to: ^а ^б ^с Кертис А.С. (февраль 1964 г.). «МЕХАНИЗМ АДГЕЗИИ КЛЕТОК К СТЕКЛУ: Исследование методом интерференционно-отражательной микроскопии» . Журнал клеточной биологии . 20 (2): 199–215. дои : 10.1083/jcb.20.2.199 . ПМК 2106393 . PMID 14126869 .

[RCMforgotten-2] Филлер TJ, Peuker ET (апрель 2000 г.). «Отражательная контрастная микроскопия (ОКМ): забытый метод?». Журнал патологии . 190 (5): 635–8. doi : 10.1002/(SICI)1096-9896(200004)190:5<635::AID-PATH571>3.0.CO;2-E . ПМИД 10727991 . S2CID 43800311 .

[Ploem1975-3] Ферт, Ральф ван (1975). «Глава 27: Отражательно-контрастная микроскопия как инструмент исследования прикрепления живых клеток к поверхности стекла». Мононуклеарные фагоциты: в иммунитете, инфекции и патологии . Оксфорд: Блэквелл Сайентифик. стр. 405–421. ISBN 0-632-00471-1 . ОСЛК 2701405 .

[Ploem2019-4] Плоэм, Йохан Себастьян (21 февраля 2019 г.). «Применение отражательно-контрастной микроскопии, включая чувствительное обнаружение результатов гибридизации in situ, обзор». Журнал микроскопии . 274 (2). Уайли: 79–86. дои : 10.1111/jmi.12785 . ISSN 0022-2720 . ПМИД 30720204 . S2CID 73431526 .

[Langmuir2009-5] Теодоли, О.; Хуанг, З.-Х.; Валинья, М.-П. (30 ноября 2009 г.). «Новое моделирование отражательной интерференционной контрастной микроскопии, включая эффекты поляризации и числовой апертуры: применение к нанометрическим измерениям расстояний и реконструкции профиля объекта» (PDF) . Ленгмюр . 26 (3). Американское химическое общество (ACS): 1940–1948. дои : 10.1021/la902504y . ISSN 0743-7463 . ПМИД 19947618 .

[ChemPhysChem-6] Лимозин, Лоран; Сенгупта, Хейя (3 ноября 2009 г.). «Количественная отражательная интерференционно-контрастная микроскопия (RICM) мягких веществ и клеточной адгезии». ХимияФизХим . 10 (16). Уайли: 2752–2768. дои : 10.1002/cphc.200900601 . ISSN 1439-4235 .

[Bereiter-Hahn-7] Jump up to: ^а ^б Берейтер-Хан Дж., Фокс CH, Торелл Б. (сентябрь 1979 г.). «Количественная отражательно-контрастная микроскопия живых клеток» . Журнал клеточной биологии . 82 (3): 767–79. дои : 10.1083/jcb.82.3.767 . ПМК 2110483 . ПМИД 389938 .

[Verschueren1985-8] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Вершуерен Х (апрель 1985 г.). «Микроскопия интерференционного отражения в клеточной биологии: методология и приложения» . Журнал клеточной науки . 75 (1): 279–301. дои : 10.1242/jcs.75.1.279 . ПМИД 3900106 .

[Wu2009-9] Jump up to: ^а ^б Ву ММ, Льобет А, Лагнадо Л (ноябрь 2009 г.). «Слабая связь между кальциевыми каналами и местами экзоцитоза в хромаффинных клетках» . Журнал физиологии . 587 (Часть 22): 5377–91. дои : 10.1113/jphysicalol.2009.176065 . ПМЦ 2793871 . ПМИД 19752110 .

[refr_idx-10] Jump up to: ^а ^б Данн, Эндрю Кеннет (1997). «Клеточная структура» . Светорассеивающие свойства клеток (кандидатская диссертация). Техасский университет в Остине . OCLC 39949488 . Проверено 23 февраля 2010 г.

[11] Годвин С.Л., Флетчер М., Берчард Р.П. (сентябрь 1989 г.). «Микроскопическое исследование интерференционного отражения мест ассоциации скользящих бактерий со стеклянными субстратами» . Журнал бактериологии . 171 (9): 4589–94. дои : 10.1128/jb.171.9.4589-4594.1989 . ПМК 210255 . ПМИД 2768185 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]