Флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения

Флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения ( TIRFM ) — это тип микроскопа, с помощью которого можно наблюдать тонкую область образца, обычно менее 200 нанометров.

TIRFM — это метод визуализации, который использует возбуждение флуоресцентных клеток в тонком оптическом срезе образца, поддерживаемом на предметном стекле. Этот метод основан на том принципе, что, когда возбуждающий свет полностью отражается внутрь от прозрачного твердого покровного стекла на его границе с жидкой средой, на границе твердого тела и жидкости генерируется электромагнитное поле, также известное как затухающая волна. частота как свет возбуждения. Интенсивность затухающей волны экспоненциально затухает по мере удаления от поверхности твердого тела, так что эффективно возбуждаются только флуоресцентные молекулы в пределах нескольких сотен нанометров от твердого тела. Затем можно получить двумерные изображения флуоресценции, хотя существуют также механизмы, с помощью которых можно получить трехмерную информацию о расположении везикул или структур в клетках.

История

Широкопольная флуоресценция была представлена ​​в 1910 году и представляла собой оптический метод, освещающий весь образец. Затем в 1960 году была внедрена конфокальная микроскопия, которая уменьшила фон и время экспозиции образца, направляя свет на точку и освещая образец световыми конусами. В 1980-х годах внедрение TIRFM еще больше уменьшило фон и время экспозиции за счет освещения только тонкого среза исследуемого образца.

Фон

Существует два распространенных метода создания затухающей волны для TIRFM. Первый — это призменный метод, при котором призма направляет лазер на границу между покровным стеклом и средой/клетками под углом падения, достаточным для того, чтобы вызвать полное внутреннее отражение. Эта конфигурация применялась в клеточной микроскопии более 30 лет, но так и не стала основным инструментом из-за ряда ограничений. Хотя существует множество вариантов конфигурации призм, большинство из них ограничивают доступ к образцу, что затрудняет выполнение манипуляций, введение среды в пространство образца или проведение физиологических измерений. Еще одним недостатком является то, что в большинстве конфигураций, основанных на конструкциях инвертированных микроскопов, освещение вводится на стороне образца, противоположной оптике объектива, что требует визуализации области затухающего поля через объем образца. Для визуализации этой системы требуется большая сложность и точность, а это означало, что метод призм не использовался многими биологами, а был ограничен физиками.

Другой метод известен как метод объектива, который расширил использование TIRFM в клеточной микроскопии и еще больше увеличился с тех пор, как стало доступно коммерческое решение. В этом механизме можно легко переключаться между стандартной широкопольной флуоресценцией и TIRF, изменяя внеосевое положение фокуса луча в задней фокальной плоскости объектива. Существует несколько разработанных способов изменения положения луча, например, с использованием привода, который может изменять положение относительно флуоресцентного осветителя, прикрепленного к микроскопу.

Приложение

В клеточной и молекулярной биологии большое количество молекулярных таких как клеточная адгезия , связывание клеток гормонами , секреция нейротрансмиттеров событий на клеточных поверхностях , и динамика мембран, изучалось с помощью обычных флуоресцентных микроскопов . Однако флуорофоры , связанные с поверхностью образца и в окружающей среде, существуют в равновесном состоянии. Когда эти молекулы возбуждаются и обнаруживаются с помощью обычного флуоресцентного микроскопа, результирующая флуоресценция флуорофоров, связанных с поверхностью, часто подавляется фоновой флуоресценцией из-за гораздо большей популяции несвязанных молекул. TIRFM позволяет избирательно возбуждать связанные с поверхностью флуорофоры, в то время как несвязанные молекулы не возбуждаются и не флуоресцируют. Благодаря субмикронной поверхностной селективности TIRFM стал методом выбора для обнаружения одиночных молекул.

Существует множество применений TIRFM в клеточной микроскопии. Некоторые из этих приложений включают в себя:

• Измерение кинетики эндоцитоза рецепторов в ответ на связывание лиганда и движение рецептора
• Наблюдение за экзоцитическими событиями посредством загрузки везикул, подвергающихся экзоцитозу, флуоресцентными красителями.
• Качественное и количественное описание роли различных белков в эндоцитозе/экзоцитозе.
• Наблюдение за размером, движением и расстоянием между областями контакта между клеткой и твердой подложкой.

Благодаря способности оптически различать отдельные везикулы и напрямую следить за динамикой их взаимодействий, TIRFM дает возможность изучать огромное количество белков, участвующих в нейробиологических процессах, способом, который раньше был невозможен.

Преимущества

TIRFM обеспечивает несколько преимуществ по сравнению со стандартной широкопольной и конфокальной флуоресцентной микроскопией, такие как:

• Фон существенно уменьшен, поэтому структуры можно четко рассмотреть.
• Практически не наблюдается флуоресценции вне фокуса, что уменьшает эффект размытия.
• Клетки подвергаются значительно меньшему количеству света, что ограничивает фототоксичность для клеток.

Обзор

Идея использования полного внутреннего отражения для освещения клеток, контактирующих с поверхностью стекла, была впервые описана Э. Дж. Амброузом в 1956 году. Эту идею затем расширил Даниэль Аксельрод. в Мичиганском университете в Анн-Арборе в начале 1980-х годов как TIRFM. TIRFM использует затухающую волну для избирательного освещения и возбуждения флуорофоров в ограниченной области образца, непосредственно прилегающей к границе раздела стекло-вода. Затухающее электромагнитное поле экспоненциально затухает от границы раздела и, таким образом, проникает в среду образца на глубину всего лишь примерно 100 нм. Таким образом, TIRFM позволяет избирательно визуализировать поверхностные области такие как базальная плазматическая мембрана клеток, (толщина которой составляет около 7,5 нм). Однако обратите внимание, что ширина визуализируемой области составляет не менее нескольких сотен нанометров, поэтому во время микроскопии TIRF обязательно визуализируется цитоплазматическая зона непосредственно под плазматической мембраной в дополнение к плазматической мембране. Выборочная визуализация плазматической мембраны позволяет визуализировать особенности и события на плазматической мембране живых клеток с высоким осевым разрешением .

TIRF также можно использовать для наблюдения флуоресценции отдельной молекулы . что делает его важным инструментом биофизики и количественной биологии. Микроскопия TIRF также применялась для обнаружения отдельных молекул биомаркеров ДНК и распознавания SNP.

Было показано, что цис-геометрия (сквозная TIRFM) и трансгеометрия (TIRFM на основе призм и световодов) обеспечивают различное качество эффекта полного внутреннего отражения. В случае трансгеометрии путь возбуждения и канал излучения разделены, а в случае TIRFM объективного типа они используют объектив и другие оптические элементы микроскопа. Было показано, что геометрия на основе призмы генерирует чистую затухающую волну, экспоненциальное затухание которой близко к теоретически предсказанной функции. Однако в случае объективного TIRFM затухающая волна загрязняется интенсивным рассеянным светом . Показано, что интенсивность рассеянного света составляет 10–15% от затухающей волны, что затрудняет интерпретацию данных, полученных с помощью TIRFM объективного типа.

Механизм

Схема флуоресцентного микроскопа (Транс-) полного внутреннего отражения (TIRFM)

1. Цель
2. Эмиссионный луч (сигнал)
3. Иммерсионное масло
4. Покровное стекло
5. Образец
6. Диапазон затухающих волн
7. Возбуждающий луч
8. Кварцевая призма

К основным компонентам устройства TIRFM относятся:

1. Источник света возбуждающего луча
2. Покровное стекло и иммерсионное масло
3. Объектив
4. Образец образца
5. Детектор

На основе цели или на основе призмы

Ключевые различия между TIRFM на основе объектива (цис) и TIRFM на основе призмы (транс) заключаются в том, что TIRFM на основе призмы требует использования интерфейса призма/решение для создания исчезающего поля, в то время как TIRFM на основе объектива не требует призмы и использует покрытие. интерфейс скольжения/решения для генерации исчезающего поля. Обычно более широко используются объективные TIRFM, однако качество изображения у них снижается из-за шума рассеянного света внутри затухающей волны.

На основе призмы

• Меньше постороннего рассеяния
• Гораздо дешевле (сотни вместо тысяч долларов)
• Лучше всего подходит для целей с низким и средним увеличением и целей с водной иммерсией.
• Проще всего со свободными коллимированными лазерными источниками
• Больший диапазон углов падения
  • Желательно добиться наименьшей глубины исчезающего поля.

Схема (Цис-) флуоресцентного микроскопа полного внутреннего отражения (TIRFM)

1. Образец
2. Диапазон затухающих волн
3. Покровное стекло
4. Иммерсионное масло
5. Цель
6. Эмиссионный луч (сигнал)
7. Возбуждающий луч

Целенаправленный

• Высокое увеличение и диафрагма
• Стабильный, простой в настройке и выравнивании
• Работает со свободным коллимированным лазером, оптическим волокном или обычными дуговыми источниками.

Методология

Фундаментальная физика

TIRFM основан на оптическом явлении полного внутреннего отражения , при котором волны, достигающие границы раздела сред, не передаются в среду 2, а полностью отражаются обратно в среду 1. Полное внутреннее отражение требует, чтобы среда 2 имела более низкий показатель преломления, чем среда 1. , причем волны должны падать на границу раздела под достаточно наклонными углами. Наблюдаемым явлением, сопровождающим полное внутреннее отражение, является затухающая волна , которая пространственно распространяется перпендикулярно от границы раздела в среду 2 и затухает экспоненциально в зависимости от длины волны, показателя преломления и угла падения. Именно затухающая волна используется для достижения повышенного возбуждения флуорофоров вблизи поверхности образца и уменьшения возбуждения лишних флуорофоров внутри раствора.

Для практических целей в объективном TIRF среда 1 обычно представляет собой покровное стекло с высоким показателем преломления, а среда 2 представляет собой образец в растворе с более низким показателем преломления. Между линзой и покровным стеклом может находиться иммерсионное масло, чтобы предотвратить значительную рефракцию в воздухе.

Исчезающая волна

Критический угол падения возбуждающего света можно получить из закона Снеллиуса :

$\theta _{c}=\sin ^{-1}\left({\frac {n_{1}}{n_{2}}}\right)$

Для $n_{1}$ показатель преломления образца, $n_{2}$ показатель преломления покровного стекла.

Таким образом, когда угол падения достигает $\theta _{c}$, мы начинаем наблюдать эффекты полного внутреннего отражения и затухающей волны, и по мере того, как они превосходят $\theta _{c}$ эти эффекты более распространены.

Интенсивность затухающей волны определяется выражением:

$I(Z)=I_{0}e^{-z/d}$

С глубиной проникновения $d$ предоставлено:

$d={\frac {\lambda _{0}}{4\pi }}\left(n_{2}^{2}\sin ^{2}\theta -n_{1}^{2}\right)^{-1/2}$

Обычно $d$ ≤~100 нанометров, что обычно намного меньше длины волны света и намного тоньше, чем срез конфокального микроскопа .

Для визуализации TIRFM длина волны возбуждающего луча $\lambda _{0}$ в пределах выборки могут быть выбраны путем фильтрации. Кроме того, диапазон углов падения $\theta$ определяется числовой апертурой (NA) объектива и требует, чтобы NA > $n$. Этот параметр можно регулировать, изменяя угол входа луча возбуждения в объектив. Наконец, отражающие индексы ( $n$) раствора и покровного стекла можно найти экспериментально или сообщить производителям.

Возбуждающий луч

Для сложных методов флюороскопической микроскопии лазеры являются предпочтительным источником света, поскольку они очень однородны, интенсивны и почти монохроматичны. Однако следует отметить, что источники света ARC LAMP и другие типы источников также могут работать. Обычно длина волны возбуждающего луча определяется требованиями флуорофоров в образце, при этом наиболее распространенные длины волн возбуждения находятся в диапазоне 400–700 нм для биологических образцов .

На практике лайтбокс будет генерировать мультихроматический лазер высокой интенсивности, который затем будет фильтроваться, чтобы пропустить желаемые длины волн для возбуждения образца. Для объективного TIRFM луч возбуждения и луч флуоресцентного излучения будут захватываться через одну и ту же линзу объектива. Таким образом, для разделения лучей используется дихроматическое зеркало, которое отражает входящий луч возбуждения в сторону объектива и позволяет лучу излучения проходить в детектор. Для дальнейшего разделения длин волн излучения и возбуждения может потребоваться дополнительная фильтрация.

Эмиссионный луч

При возбуждении светом определенной длины волны флуорофорные красители будут переизлучать свет с более длинными волнами (которые содержат меньше энергии). В контексте TIRFM только флуорофоры, расположенные вблизи границы раздела, будут легко возбуждаться исчезающим полем, тогда как флуорофоры, находящиеся за ~100 нм, будут сильно ослаблены. Свет, излучаемый флуорофорами, будет ненаправленным и, следовательно, будет проходить через линзу объектива в разных местах с различной интенсивностью. Затем этот сигнал пройдет через дихроматическое зеркало и попадет в детектор.

Покровное стекло и иммерсионное масло

Стеклянные покровные стекла обычно имеют коэффициент отражения вокруг $n=1.52$, а показатель преломления иммерсионного масла сравним $n=1.51$. Среда воздух, имеющий показатель преломления $n=1.00$, может вызвать преломление возбуждающего луча между объективом и покровным стеклом, поэтому масло используется для буферизации области и предотвращения ненужных межфазных взаимодействий до того, как луч достигнет границы между покровным стеклом и образцом.

Объектив

Числовая апертура объектива (NA) определяет диапазон углов, под которыми система может принимать или излучать свет.

Для достижения наибольших углов падения желательно пропускать свет под внеосевым углом через периферию линзы.

Задняя фокальная плоскость (BPF)

Задняя фокальная плоскость (также называемая «плоскостью апертуры») — это плоскость, через которую фокусируется возбуждающий луч перед прохождением через объектив. Регулировка расстояния между объективом и BPF может привести к разному увеличению изображения, поскольку угол падения будет становиться меньше или больше крутым. Луч должен пройти через BPF вне оси, чтобы пройти через объектив на его концах, чтобы угол был значительно больше критического угла. Луч также должен быть сфокусирован на BPF, поскольку это гарантирует, что свет, проходящий через объектив, будет коллимирован, взаимодействуя с покровным стеклом под одним и тем же углом и, таким образом, полностью отражаясь внутри.

Образец

Образец следует адсорбировать на поверхности предметного стекла и окрасить соответствующими флуорофорами для выявления желаемых свойств образца. Это соответствует протоколу любого другого метода флуоресцентной микроскопии .

Дихроичный (дихроматический) фильтр

Дихроичный фильтр представляет собой краевой фильтр, используемый под наклонным углом падения (обычно 45°) для эффективного отражения света в полосе возбуждения и передачи света в полосе излучения. Угол фильтра 45° разделяет пути луча возбуждения и излучения. Фильтр состоит из сложной системы нескольких слоев металлов, солей металлов и диэлектриков, нанесенных на тонкое стекло в вакууме. Это покрытие имеет высокую отражательную способность для более коротких волн и высокую пропускную способность для более длинных волн. В то время как фильтр пропускает выбранный возбуждающий свет (более короткую длину волны) через объектив и на плоскость образца, он также пропускает излучаемый флуоресцентный свет (более длинная длина волны) на барьерный фильтр и отражает любой рассеянный возбуждающий свет обратно в направлении лазера. источник. Это максимизирует количество возбуждающего излучения, проходящего через фильтр, и испускаемого луча флуоресценции, который обнаруживается детектором.

Барьерный фильтр

Барьерный фильтр в основном блокирует нежелательные длины волн, особенно более короткие волны возбуждающего света. Обычно это полосовой фильтр, который пропускает только волны, излучаемые флуорофором, и блокирует весь нежелательный свет за пределами этой полосы. Более современные микроскопы позволяют менять барьерный фильтр в зависимости от длины волны удельного излучения флуорофора.

Обнаружение и разрешение изображения

Изображение детектируется цифровой камерой с устройством с зарядовой связью (CCD). ПЗС-камеры оснащены детекторами фотонов, которые представляют собой тонкие кремниевые пластины, собранные в двумерные массивы светочувствительных областей. Массивы детекторов захватывают и сохраняют информацию об изображении в виде локализованного электрического заряда, который меняется в зависимости от интенсивности падающего света. Как показано на схеме, фотоны преобразуются детекторами в электроны, а электроны преобразуются в читаемый электрический сигнал на печатной плате. Затем электрический сигнал свертывается с помощью функции рассеяния точки (PSF) для выборки исходного сигнала. Таким образом, разрешение изображения сильно зависит от количества детекторов, и функция рассеяния точки будет определять разрешение изображения.

Артефакты изображения и шум

Большинство методов флуоресцентной визуализации демонстрируют фоновый шум из-за освещения и реконструкции больших срезов (в направлении z) образцов. Поскольку TIRFM использует затухающую волну для флуоресценции тонкого среза образца, фоновый шум и артефакты по своей сути меньше. Однако существуют и другие шумы и артефакты, такие как пуассоновский шум, оптические аберрации, фотообесцвечивание и другие флуоресцентные молекулы.

Пуассоновский шум является фундаментальной неопределенностью при измерении света. Это вызовет неопределенность при обнаружении фотонов флуоресценции. Если в конкретном измерении измеряется N фотонов, существует вероятность 63%, что истинное среднее значение находится в диапазоне от N +√N до N −√N. Этот шум может привести к искажению изображения объекта в неправильных местоположениях пикселей.

Оптические аберрации могут возникнуть из-за дифракции флуоресцентного света или микроскопа, а также из-за смещения объектива. Дифракция света на предметном стекле может распространить сигнал флуоресценции и привести к размытию извилистых изображений. Аналогичным образом, если существует несовпадение между объективом, фильтром и детектором, луч возбуждения или излучения может оказаться не в фокусе и может вызвать размытие изображений.

Фотообесцвечивание может произойти, когда ковалентные или нековалентные связи во флуорофорах разрушаются под действием возбуждающего света и больше не могут флуоресцировать. Флуоресцентные вещества всегда в некоторой степени разлагаются под действием энергии возбуждающего излучения, что приводит к исчезновению флуоресценции и образованию темного размытого изображения. Фотоотбеливание неизбежно, но его можно свести к минимуму, избегая нежелательного воздействия света и используя иммерсионные масла для минимизации рассеяния света.

Автофлуоресценция может возникать в определенных клеточных структурах, где естественное соединение в структуре будет флуоресцировать после возбуждения на относительно более коротких длинах волн (аналогично длине волны возбуждения). Индуцированная флуоресценция также может возникать, когда некоторые неавтофлуоресцентные соединения становятся флуоресцентными после связывания с определенными химическими веществами (например, с формальдегидом). Эта флуоресценция может привести к появлению артефактов или фонового шума на изображении. Шум от других флуоресцентных соединений можно эффективно устранить, используя фильтры для улавливания желаемой длины волны флуоресценции или проверив отсутствие автофлуоресцентных соединений в образце.

Текущая и будущая работа

Современные методы флуоресценции пытаются объединить методы устранения некоторого размытия и шумов. Оптические аберрации, как правило, детерминированы (они постоянны на протяжении всего процесса изображения и для разных образцов). Детерминированное размытие можно устранить путем деконволюции сигнала и вычитания известного артефакта. Метод деконволюции просто использует обратное преобразование Фурье для получения исходного сигнала флуоресценции и удаления артефакта.

Тем не менее было показано, что деконволюция работает только в том случае, если имеется сильный сигнал флуоресценции или когда шум четко определен. Кроме того, деконволюция работает плохо, поскольку она не включает статистическую информацию и не может уменьшить недетерминированный шум, такой как пуассоновский шум. Чтобы получить лучшее разрешение и качество изображения, исследователи использовали статистические методы для моделирования вероятности того, что фотоны могут быть распределены по детектору. Этот метод, называемый методом максимального правдоподобия , совершенствуется с помощью алгоритмов для повышения скорости его работы.

Ссылки

• Аксельрод, Дэниел (1 ноября 2001 г.). «Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения в клеточной биологии» (PDF) . Трафик . 2 (11): 764–774. дои : 10.1034/j.1600-0854.2001.21104.x . hdl : 2027.42/72779 . ПМИД   11733042 . S2CID   15202097 .

Внешние ссылки

• Интерактивная база данных флуоресцентных красителей и фильтров Carl Zeiss Интерактивная база данных флуоресцентных красителей и фильтров.
• TIRF-микроскопия: введение и применение Учебное пособие TIRF от микроскопии U
• Микроскопия TIRF: обзор Учебное пособие TIRF от Ресурсного центра по микроскопии Olympus
• Olympus TIRFM Microscopes Коммерческие микроскопические системы
• Carl Zeiss Laser TIRF 3 Коммерческие микроскопические системы
• Микроскопия TIRF на основе световодов и призм TIRF-Labs.com: Коммерческая микроскопия и спектроскопия TIRF. Выбор геометрии TIRFM для вашего применения
• TIRF FLIM микроскопия Lambert Instruments TIRF - FLIM микроскопия
• Исследовательская группа Шварца, Исследовательская группа по визуализации одиночных молекул CU-Boulder