Микроскопия изображений второй гармоники

Не путать с микроскопией двухфотонного возбуждения .

Микроскопия изображений второй гармоники ( SHIM ) основана на нелинейном оптическом эффекте, известном как генерация второй гармоники (ГВГ). SHIM был признан жизнеспособным механизмом контрастирования микроскопических изображений для визуализации структуры и функций клеток и тканей . Микроскоп второй гармоники получает контрасты за счет изменений способности образца генерировать свет второй гармоники из падающего света, в то время как обычный оптический микроскоп получает контраст путем обнаружения изменений оптической плотности , длины пути или показателя преломления образца. ГВГ требует прохождения интенсивного лазерного света через материал с нецентросимметричной молекулярной структурой, либо собственной, либо индуцированной извне, например, электрическим полем.

Свет второй гармоники, исходящий из материала ГВГ, имеет ровно половину длины волны (удвоенная частота) света, попадающего в материал. Хотя двухфотонно-возбужденная флуоресценция (TPEF) также является двухфотонным процессом, TPEF теряет некоторую энергию во время релаксации возбужденного состояния, в то время как SHG является энергосберегающим. Обычно для получения света ГВГ используется неорганический кристалл, такой как ниобат лития (LiNbO ₃ ), титанилфосфат калия (KTP = KTiOPO ₄ ) и триборат лития (LBO = LiB ₃ O ₅ ). Хотя ГВГ требует, чтобы материал имел определенную молекулярную ориентацию, чтобы частота падающего света была удвоена, некоторые биологические материалы могут быть сильно поляризуемыми и собираться в довольно упорядоченные, большие нецентросимметричные структуры. Хотя некоторые биологические материалы, такие как коллаген, микротрубочки и мышечный миозин, могут генерировать сигналы ГВГ, даже вода может стать упорядоченной и производить сигнал второй гармоники при определенных условиях, что позволяет SH-микроскопии отображать поверхностные потенциалы без каких-либо меченых молекул. Характер ГВГ в основном определяется условием фазового синхронизма. Обычная установка для системы визуализации ГВГ будет включать лазерный сканирующий микроскоп с титан - сапфировым лазером с синхронизацией мод в качестве источника возбуждения. Сигнал ГВГ распространяется в прямом направлении. Однако некоторые эксперименты показали, что объекты порядка одной десятой длины волны сигнала, создаваемого ГВГ, будут производить почти равные прямые и обратные сигналы.

Изображение коллагена во второй гармонике (показано белым) в печени

Преимущества

SHIM предлагает несколько преимуществ для визуализации живых клеток и тканей. ГВГ не предполагает возбуждения молекул, как другие методы, такие как флуоресцентная микроскопия , поэтому молекулы не должны подвергаться воздействию фототоксичности или фотообесцвечивания . Кроме того, поскольку многие биологические структуры производят сильные сигналы ГВГ, маркировка молекул экзогенными зондами не требуется, что также может изменить способ функционирования биологической системы. Используя длины волн ближнего инфракрасного диапазона для падающего света, SHIM имеет возможность создавать трехмерные изображения образцов путем визуализации более глубоких слоев толстых тканей.

Различие и взаимодополняемость с помощью двухфотонной флуоресценции (2PEF)

Двухфотонная флуоресценция ( 2PEF ) сильно отличается от ГВГ : она включает возбуждение электронов на более высокие энергетические уровни и последующее девозбуждение путем испускания фотонов (в отличие от ГВГ, хотя это также двухфотонный процесс). Таким образом, 2PEF представляет собой некогерентный процесс пространственно (изотропно излучаемый) и во времени (широкий спектр, зависящий от образца). Он также не специфичен для определенной структуры, в отличие от ГВГ.

Поэтому его можно объединить с ГВГ при многофотонной визуализации, чтобы выявить некоторые молекулы, которые действительно производят автофлуоресценцию , такие как эластин в тканях (в то время как ГВГ выявляет коллаген или миозин ). , например,

История

До того, как ГВГ был использован для визуализации, первая демонстрация ГВГ была проведена в 1961 году П.А. Франкеном, Г. Вайнрайхом , К.В. Питерсом и А.Э. Хиллом в Мичиганском университете, Анн-Арбор, с использованием образца кварца. В 1968 году Блумберген обнаружил ГВГ из интерфейсов. и с тех пор используется в качестве инструмента для определения характеристик поверхностей и исследования динамики интерфейса. В 1971 году Файн и Хансен сообщили о первом наблюдении ГВГ в образцах биологических тканей. В 1974 году Хеллварт и Кристенсен впервые сообщили об интеграции ГВГ и микроскопии, визуализируя сигналы ГВГ от поликристаллического ZnSe . В 1977 году Колин Шеппард получил изображения различных кристаллов ГВГ с помощью сканирующего оптического микроскопа. Первые эксперименты по биологической визуализации были проведены Фрейндом и Дойчем в 1986 году для изучения ориентации коллагеновых волокон в крысы хвоста сухожилиях . В 1993 году Льюис исследовал реакцию второй гармоники стириловых красителей на электрические поля . Он также продемонстрировал работу по визуализации живых клеток. В 2006 году группа Горо Мизутани разработала несканирующий ГВГ-микроскоп, который значительно сокращает время, необходимое для наблюдения за большими образцами, даже несмотря на то, что двухфотонный широкопольный микроскоп был опубликован в 1996 году. и мог быть использован для обнаружения ГВГ. Несканирующий микроскоп ГВГ использовался для наблюдения за растительным крахмалом . мегамолекула, паучий шелк и так далее. целых животных in vivo . В 2010 году ГСП была распространена на визуализацию В 2019 году область применения ГСП расширилась, когда она была применена к использованию агрохимикатов для выборочной визуализации непосредственно на поверхности листьев, чтобы дать возможность оценить эффективность пестицидов.

Количественные измерения

Ориентационная анизотропия

ГВГ поляризации Анизотропия может быть использована для определения ориентации и степени организации белков в тканях, поскольку сигналы ГВГ имеют четко выраженную поляризацию. Используя уравнение анизотропии:

${\frac {I_{par}-I_{perp}}{I_{par}+2I_{perp}}}=r$

и получение интенсивностей поляризаций в параллельном и перпендикулярном направлениях. Высокий $r$ значение указывает на анизотропную ориентацию, тогда как низкое $r$ значение указывает на изотропную структуру. В работе Кампаньолы и Лоу Было обнаружено, что коллагеновые волокна образуют хорошо выровненные структуры с $r=0.7$ ценить.

ГВГ вперед и назад

См. Также: Генерация второй гармоники § Диаграмма направленности

ГВГ, являясь когерентным процессом ( пространственно и временно ), сохраняет информацию о направлении возбуждения и не излучается изотропно. В основном он излучается в прямом направлении (так же, как возбуждение), но может излучаться и в обратном направлении в зависимости от условия фазового синхронизма . Действительно, длина когерентности, за пределами которой уменьшается преобразование сигнала, равна:

$l_{c}=2/\Delta k$

с $\Delta k\propto 1/(n_{2\omega }-n_{\omega })$ вперед, но $\Delta k_{bwd}\propto 1/(n_{2\omega }+n_{\omega })$ для обратного такого, что $l_{c}$ >> $l_{c,bwd}$. Поэтому более толстые структуры будут появляться преимущественно в прямом направлении, а более тонкие - в обратном: поскольку преобразование ГВГ зависит в первом приближении от квадрата количества нелинейных преобразователей, сигнал будет выше, если излучается толстыми структурами, поэтому сигнал в прямом направлении направлении будет выше, чем в обратном. Однако ткань может рассеивать генерируемый свет, и часть ГВГ, направленная вперед, может отражаться назад. Затем можно вычислить соотношение прямого и обратного F/B: и является показателем общего размера и расположения преобразователей ГВГ (обычно коллагеновых фибрилл). Можно также показать, что чем больше угол отклонения от плоскости рассеивателя, тем выше его отношение F/B (см. рис. 2.14). ).

ГВГ с поляризационным разрешением

Преимущества поляриметрии были объединены с ГВГ в 2002 году Столлером и др. Поляриметрия может измерять ориентацию и порядок на молекулярном уровне, а в сочетании с ГВГ она может делать это со специфичностью к определенным структурам, таким как коллаген: микроскопия ГВГ с поляризационным разрешением (p-ГВГ), таким образом, является расширением микроскопии ГВГ. p-SHG определяет еще один параметр анизотропии:

$\rho ={\sqrt {\frac {I_{par}}{I_{perp}}}}$

что, как и r , является мерой основной ориентации и беспорядка отображаемой структуры. Поскольку его часто осуществляют в виде длинных цилиндрических нитей (например, коллагена), эта анизотропия часто равна $\rho ={\frac {\chi _{XXX}^{(2)}}{\chi _{XYY}^{(2)}}}$ , где $\chi ^{(2)}$ — тензор нелинейной восприимчивости , X — направление нити (или основное направление структуры), Y ортогонально X, а Z — распространение возбуждающего света. Ориентацию φ нитей в плоскости XY изображения также можно извлечь из p-SHG с помощью анализа БПФ и нанести на карту.

Квантование фиброза

Коллаген (частный случай, но широко изученный в микроскопии ГВГ) может существовать в различных формах: 28 различных типов, из которых 5 фибриллярных. Одна из задач — определить и количественно оценить количество фибриллярного коллагена в ткани, чтобы увидеть его эволюцию и взаимосвязь с другими неколлагеновыми материалами.

С этой целью изображение, полученное при микроскопии ГВГ, необходимо скорректировать, чтобы удалить небольшое количество остаточной флуоресценции или шума, которые существуют на длине волны ГВГ. После этого можно применить маску для количественного определения количества коллагена внутри изображения. Среди других методов квантования он, вероятно, обладает самой высокой специфичностью, воспроизводимостью и применимостью, несмотря на то, что он довольно сложен.

Другие

Он также использовался для доказательства того, что потенциалы обратного распространения действия проникают в дендритные шипы без затухания напряжения, создавая прочную основу для будущих работ по долговременному потенцированию . Его использование здесь заключалось в том, что он дал возможность точно измерить напряжение в крошечных дендритных шипах с точностью, недостижимой с помощью стандартной двухфотонной микроскопии. Между тем, SHG может эффективно преобразовывать ближний инфракрасный свет в видимый свет, чтобы обеспечить фотодинамическую терапию под визуальным контролем, преодолевая ограничения по глубине проникновения.

Материалы, которые можно изобразить

Биологические ткани, полученные с помощью микроскопии генерации второй гармоники (ГВГ). (а) Поперечный срез роговицы человека. (б) Скелетные мышцы рыбки данио (миозин). (в) Хвостовое сухожилие взрослой мыши. (г) Поверхностный хрящ колена взрослой лошади.

ГВГ-микроскопия и ее расширения могут использоваться для изучения различных тканей: некоторые примеры изображений представлены на рисунке ниже: основным применением остается коллаген внутри внеклеточного матрикса. Его можно обнаружить в сухожилиях, коже, костях, роговице, аорте, фасциях, хрящах, менисках, межпозвоночных дисках...

Миозин также можно визуализировать в скелетных мышцах или сердечной мышце.

Таблица 1: Материалы, видимые или эффективно генерирующие ГВГ.

Тип	Материал	Найдено в	сигнал ГВГ	Специфика
Углеводы	Целлюлоза	Дерево , зеленые растения , водоросли .	Довольно слаб в обычной целлюлозе, но существенно в кристаллической или нанокристаллической целлюлозе.	-
	Крахмал	Основные продукты питания , зеленые растения	Довольно интенсивный сигнал	хиральность находится на микро- и макроуровне, а ГВГ различна при правой или левой круговой поляризации.
	Мегамолекулярный полисахарид сакрановый	Цианобактерии	Из сакрального ватноподобного комка, волокон и литой пленки.	сигнал от фильмов слабее
Белок	Фиброин и серицин	Паучий шелк	Довольно слабый
	Коллаген	сухожилия , кожа , кости , роговица , аорта , фасции , хрящи , мениски , межпозвоночные диски ; соединительные ткани	Достаточно сильный, зависит от типа коллагена (образует ли он фибриллы, волокна?)	нелинейной восприимчивости компоненты тензора $d_{33}$, $d_{31}$, $d_{15}$, с $d_{31}$ ~ $d_{15}$ и $d_{33}$/ $d_{15}$ ~ 1,4 в большинстве случаев
	Миозин	Скелетная или сердечная мышца	Довольно сильный	нелинейной восприимчивости компоненты тензора $d_{33}$, $d_{31}$, $d_{15}$ с $d_{31}$ ~ $d_{15}$ но $d_{33}$/ $d_{15}$ ~ 0,6 < 1 в отличие от коллагена
	Тубулин	Микротрубочки в митозе или мейозе . или в нейритах (в основном аксонах)	Довольно слабый	Микротрубочки должны быть выровнены, чтобы эффективно генерировать
Минералы	Пьезоэлектрические кристаллы	Также называемые нелинейными кристаллами	Сильный, если синхронизирован по фазе	Различные типы фазового синхронизма, критические и некритические
Полярные жидкости	Вода	Большинство живых организмов	Едва обнаруживаемый (требуется широкоугольная геометрия и сверхкороткие лазерные импульсы) )	Непосредственное исследование электростатических полей, поскольку ориентированные молекулы воды удовлетворяют синхронизма. условию

Связь с THG-микроскопией

Микроскопия генерации третьей гармоники (ГГГ) может дополнять микроскопию ГВГ, поскольку она чувствительна к поперечным границам раздела и к нелинейной восприимчивости 3-го порядка. $\chi ^{(3)}$

Приложения

Прогрессирование рака, характеристика опухоли

Маммографическая рака плотность коррелирует с плотностью коллагена , поэтому ГВГ можно использовать для выявления молочной железы . ГВГ обычно сочетается с другими нелинейными методами, такими как когерентное антистоксово комбинационное рассеяние или микроскопия с двухфотонным возбуждением называемой многофотонной микроскопией (или томографией), которая обеспечивает неинвазивное и быстрое гистологическое исследование биопсий , как часть процедуры , in vivo , которое может быть раковым.

Рак молочной железы

Сравнение прямых и обратных изображений ГВГ дает представление о микроструктуре коллагена, которая сама по себе связана со степенью и стадией опухоли , а также ее прогрессированием в молочной железе . Сравнение SHG и 2PEF также может показать изменение ориентации коллагена в опухолях . Даже если микроскопия ГВГ внесла большой вклад в исследование рака молочной железы, она еще не признана надежным методом в больницах или для диагностики этой патологии в целом.

Рак яичников

Здоровые яичники при ГСП имеют однородный эпителиальный слой и хорошо организованный коллаген в строме , тогда как аномальные имеют эпителий с крупными клетками и измененной структурой коллагена. Коэффициент r (см. #Ориентационная анизотропия ) также используется чтобы показать, что выравнивание фибрилл в раковых тканях несколько выше, чем в нормальных.

Рак кожи

SHG снова объединяется с 2PEF , используемым для расчета соотношения:

$MFSI=({\text{shg}}-{\text{tpef}})/({\text{shg}}+{\text{tpef}})$

где shg (соответственно tpef) — количество пороговых пикселей в изображении SHG (соответственно 2PEF), высокий MFSI означает чистое изображение ГВГ (без флуоресценции). Самый высокий MFSI обнаружен в раковых тканях. который обеспечивает контрастный режим для дифференциации от нормальных тканей.

ГСП также была объединена с генерацией третьей гармоники (ГТГ), чтобы показать, что это наоборот. (см. #ГВГ вперед и назад ). Уровень ТГГ выше в опухолях.

Рак поджелудочной железы

Изменения ультраструктуры коллагена при раке поджелудочной железы можно исследовать с помощью многофотонной флуоресценции и SHIM с поляризационным разрешением.

Другие виды рака

Сообщалось о применении ГВГ-микроскопии для изучения рака легких , толстой кишки пищевода , стромы и рака шейки матки .

Выявление патологий

Изменения в организации или полярности коллагеновых фибрилл могут быть признаками патологии.

В частности, анизотропное расположение коллагеновых волокон позволило отличить здоровую дерму от патологических рубцов на коже . Кроме того, такие патологии хряща , как остеоартрит . с помощью ГВГ-микроскопии с поляризационным разрешением можно выявить Позднее SHIM был распространен на волокнистый хрящ ( мениск ).

Тканевая инженерия

Способность ГВГ отображать конкретные молекулы может выявить структуру определенной ткани по одному материалу за раз и в различных масштабах (от макро до микро) с помощью микроскопии. Например, коллаген (тип I) специально визуализируется из внеклеточного матрикса (ECM) клеток или когда он служит каркасом или соединительным материалом в тканях. ГВГ также обнаруживает фиброин в шелке , миозин в мышцах и биосинтезированную целлюлозу . Все эти возможности визуализации могут быть использованы для создания искусственных тканей путем нацеливания на определенные точки ткани: ГВГ действительно может количественно измерить некоторые ориентации, количество и расположение материала. Кроме того, ГВГ в сочетании с другими многофотонными методами может служить для мониторинга развития инженерных тканей, однако, когда образец относительно тонкий. Конечно, их наконец можно использовать для контроля качества изготовленных тканей.

Строение глаза

Считается, что роговица на поверхности глаза состоит из коллагена , напоминающего фанеру , из-за свойств самоорганизации достаточно плотного коллагена . Тем не менее, ориентация коллагена в пластинках этой ткани все еще остается предметом дискуссий . Кератоконус роговицы также можно визуализировать с помощью ГВГ, чтобы выявить морфологические изменения коллагена . Кроме того, микроскопия генерации третьей гармоники (ГТГ) используется для изображения роговицы , которая дополняет сигнал ГВГ, поскольку максимумы ГТГ и ГПГ в этой ткани часто находятся в разных местах.

См. также

• Нелинейная оптика
• Генерация второй гармоники
• Микроскопия двухфотонного возбуждения

Источники

• Шмитт, Майкл; Майерхёфер, Томас; Попп, Юрген; Клеппе, Инго; Вайсшартанне, Клаус (2013). Справочник по биофотонике, глава 3. Взаимодействие света и вещества . Уайли. дои : 10.1002/9783527643981.bphoto003 . ISBN  9783527643981 . S2CID   93908151 .
• Павоне, Франческо С.; Кампаньола, Пол Дж. (2016). Визуализация поколения второй гармоники, 2-е издание . CRC Тейлор и Фрэнсис. ISBN  978-1-4398-4914-9 .
• Кампаньола, Пол Дж.; Кларк, Хизер А.; Молер, Уильям А.; Льюис, Аарон; Лоу, Лесли М. (2001). «Визуализирующая микроскопия живых клеток во второй гармонике» (PDF) . Журнал биомедицинской оптики . 6 (3): 277–286. Бибкод : 2001JBO.....6..277C . дои : 10.1117/1.1383294 . hdl : 2047/d20000323 . ПМИД   11516317 . S2CID   2376695 .
• Кампаньола, Пол Дж.; Лоу, Лесли М (2003). «Изображающая микроскопия второй гармоники для визуализации биомолекулярных массивов в клетках, тканях и организмах» (PDF) . Природная биотехнология . 21 (11): 1356–1360. дои : 10.1038/nbt894 . ПМИД   14595363 . S2CID   18701570 . Архивировано из оригинала (PDF) 4 марта 2016 г.
• Столлер, П.; Райзер, К.М.; Сельерс, премьер-министр; Рубенчик, А.М. (2002). «Поляризационно-модулированная генерация второй гармоники в коллагене» . Биофиз. Дж . 82 (6): 3330–3342. Бибкод : 2002BpJ....82.3330S . дои : 10.1016/s0006-3495(02)75673-7 . ПМК   1302120 . ПМИД   12023255 .
• Хан, М.; Гизе, Г.; Билле, Дж. Ф. (2005). «Визуализация коллагеновых фибрилл роговицы и склеры во второй гармонике» . Опция Выражать . 13 (15): 5791–5797. Бибкод : 2005OExpr..13.5791H . дои : 10.1364/opex.13.005791 . ПМИД   19498583 .
• Кениг, Карстен (2018). Многофотонная микроскопия и флуоресцентная прижизненная визуализация – приложения в биологии и медицине . Де Грютер. ISBN  978-3-11-042998-5 .
• Кейхосрави, Адиб; Бредфельдт, Джереми С.; Сагар, Абдул Кадер; Элисейри, Кевин В. (2014). «Визуализация рака во второй гармонике» . Количественная визуализация в клеточной биологии . Методы клеточной биологии. Том. 123. стр. 531–546. дои : 10.1016/B978-0-12-420138-5.00028-8 . ISBN  978-0-12-420138-5 . ISSN   0091-679X . ПМИД   24974046 .
• Ханри Ю; Нур Аида Абдул Рахим (2013). Визуализация в клеточной и тканевой инженерии, 1-е издание . CRC Тейлор и Фрэнсис. ISBN  9780367445867 .
• Чикки, Риккардо; Фоглер, Надин; Капсокаливас, Димитриос; Дитцек, Бенджамин; Попп, Юрген; Павоне, Франческо Саверио (2013). «От молекулярной структуры к архитектуре ткани: организация коллагена, исследованная с помощью ГВГ-микроскопии» . Журнал биофотоники . 6 (2): 129–142. дои : 10.1002/jbio.201200092 . ПМИД   22791562 .
• Розель, Д.; Еремчев М.; Шенфельдова, Т.; Ли, С.; Рок, С. (18 апреля 2022 г.). «Вода как контрастный агент для количественной оценки химии и физики поверхности с использованием рассеяния второй гармоники и визуализации: перспектива» . Письма по прикладной физике . 120 (16). Издательство AIP: 160501. Бибкод : 2022ApPhL.120p0501R . дои : 10.1063/5.0085807 . ISSN   0003-6951 . S2CID   248252664 .