Люцифераза
| Семейство бактериальных люцифераз-монооксигеназ | |||
|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||
| Символ | Бак_люцифераза | ||
| Пфам | PF00296 | ||
| ИнтерПро | ИПР016048 | ||
| PROSITE | PDOC00397 | ||
| СКОП2 | 1нфп / СКОПе / СУПФАМ | ||
| |||
| Каталитический домен динофлагеллат-люциферазы | |||
|---|---|---|---|
 кристаллическая структура люциферазного домена динофлагелляты Lingulodinium polyedrum | |||
| Идентификаторы | |||
| Символ | Люцифераза_cat | ||
| Пфам | ПФ10285 | ||
| ИнтерПро | ИПР018804 | ||
| |||
| N-концевой домен динофлагеллятлюциферазы/LBP | |||
|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||
| Символ | Люцифераза_N | ||
| Пфам | PF05295 | ||
| ИнтерПро | ИПР007959 | ||
| |||
| Домен спирального пучка динофлагеллат-люциферазы | |||
|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||
| Символ | Люцифераза_3H | ||
| Пфам | PF10284 | ||
| ИнтерПро | ИПР018475 | ||
| |||
Люцифераза – общий термин для класса окислительных ферментов , вызывающих биолюминесценцию , и обычно отличается от фотопротеина . Это название впервые использовал Рафаэль Дюбуа , который изобрел слова люциферин и люцифераза для обозначения субстрата и фермента соответственно. [1] Оба слова происходят от латинского слова lucifer , означающего «носитель света», которое, в свою очередь, происходит от латинских слов «свет» ( lux) и «приносить или нести» ( ferre) . [2]
| Люцифераза светлячка | |||
|---|---|---|---|
 Структура Photinuspyralis люциферазы светлячка . | |||
| Идентификаторы | |||
| Организм | |||
| Символ | Люцифераза светлячка | ||
| ПДБ | 1LCI Дополнительные структуры | ||
| ЮниПрот | P08659 | ||
| Другие данные | |||
| Номер ЕС | 1.13.12.7 | ||
| |||
Люциферазы широко используются в биотехнологии , для биолюминесцентной визуализации. [3] микроскопии и в качестве репортерных генов для многих тех же применений, что и флуоресцентные белки . Однако, в отличие от флуоресцентных белков, люциферазы не требуют внешнего источника света , но требуют добавления люциферина , потребляемого субстрата.
Примеры
[ редактировать ]Различные организмы регулируют производство света с помощью различных люцифераз в различных реакциях светоизлучения. Большинство изученных люцифераз обнаружено у животных, в том числе у светлячков , [4] и многие морские животные, такие как копеподы , медузы и морские анютины глазки . Тем не менее, люциферазы были изучены в светящихся грибах, таких как гриб Джек-О-Фонарь , а также в других царствах, включая биолюминесцентные бактерии и динофлагелляты .
Светлячок и жук-щелкун
[ редактировать ]Люциферазы светлячков , которых насчитывается более 2000 видов , и других Elateroidea (жуков-щелкунов и их родственников в целом) достаточно разнообразны, чтобы их можно было использовать в молекулярной филогении . [5] У светлячков необходимый кислород подается через трубку в брюшной полости, называемую брюшной трахеей . Одной из хорошо изученных люцифераз является люцифераза Photinini светлячка Photinuspyralis , оптимум pH которой составляет 7,8. [6]
Морские анютины глазки
[ редактировать ]Также хорошо изучена морская анютины глазки Renilla reniformis . В этом организме люцифераза ( ренилла-люциферин-2-монооксигеназа ) тесно связана с люциферин-связывающим белком, а также с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ). Кальций запускает высвобождение люциферина ( целентеразина ) из белка, связывающего люциферин. Затем субстрат становится доступным для окисления люциферазой, где он разлагается до целентерамида с последующим высвобождением энергии. В отсутствие GFP эта энергия выделялась бы в виде фотона синего света (пиковая длина волны излучения 482 нм). Однако из-за тесно связанного GFP энергия, выделяемая люциферазой, вместо этого передается посредством резонансной передачи энергии флуорофору GFP и впоследствии высвобождается в виде фотона зеленого света (пиковая длина волны излучения 510 нм). Катализируемая реакция: [7]
- целентеразин + O 2 → целентерамид + CO 2 + фотон света
Копепод
[ редактировать ]Недавно были идентифицированы новые люциферазы, которые, в отличие от других люцифераз, представляют собой молекулы, секретируемые естественным путем. Одним из таких примеров является -зависимая люцифераза Metridia целентеразин (MetLuc, A0A1L6CBM1 ), полученная из морского копепода Metridia longa . Ген люциферазы, секретируемой Metridia longa , кодирует белок массой 24 кДа, содержащий N-концевой секреторный сигнальный пептид из 17 аминокислотных остатков. Чувствительность и высокая интенсивность сигнала этой молекулы люциферазы оказываются полезными во многих репортерских исследованиях. Одним из преимуществ использования секретируемой репортерной молекулы, такой как MetLuc, является протокол отсутствия лизиса, который позволяет проводить анализы на живых клетках и несколько анализов на одной и той же клетке. [8]
Бактериальный
[ редактировать ]Бактериальная биолюминесценция наблюдается у видов Photobacterium, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi и Vibrio harveyi . Световое излучение у некоторых биолюминесцентных бактерий использует «антенну», такую как белок люмазин, для приема энергии из первичного возбужденного состояния люциферазы, в результате чего образуется возбужденный лулназина хромофор , который излучает свет с более короткой длиной волны (более синий), в то время как у других используют желтый флуоресцентный белок (YFP) с флавинмононуклеотидом (FMN) в качестве хромофора и излучают свет, смещенный в красную сторону по сравнению со светом люциферазы. [9]
Динофлагеллята
[ редактировать ]Люцифераза динофлагеллят многодоменный представляет собой белок эукариот , состоящий из N-концевого домена и трех каталитических доменов , каждому из которых предшествует домен спирального пучка. структура Решена динофлагеллатлюциферазы каталитического домена . [10] Основная часть домена представляет собой 10-нитевой бета-цилиндр , который структурно похож на липокалины и FABP . [10] N-концевой домен консервативен между динофлагеллятлюциферазой и люциферинсвязывающими белками (LBP). Было высказано предположение, что эта область может опосредовать взаимодействие между LBP и люциферазой или их ассоциацию с вакуолярной мембраной. [11] Домен спирального пучка имеет трехспиральную пучка структуру , которая содержит четыре важных гистидина, играют роль в регуляции pH фермента которые, как полагают , . [10] В β-цилиндре динофлагеллятлюциферазы при pH 8 имеется большой карман для размещения тетрапиррольного субстрата, но нет отверстия для проникновения субстрата. Следовательно, должно произойти значительное конформационное изменение, чтобы обеспечить доступ и пространство для лиганда в активном сайте, и источником этого изменения являются четыре N-концевых остатка гистидина. [10] Видно, что при pH 8 непротонированные остатки гистидина участвуют в сети водородных связей на границе раздела спиралей в пучке, блокирующих доступ субстрата к активному центру и нарушение этого взаимодействия за счет протонирования (при pH 6,3). или замена остатков гистидина аланином вызывает большое молекулярное движение пучка, разделяя спирали на 11 Å и открывая каталитический сайт. [10] Логично, что остатки гистидина не могут быть заменены аланином в природе, но эта экспериментальная замена дополнительно подтверждает, что более крупные остатки гистидина блокируют активный центр. Кроме того, три последовательности Gly-Gly, одна в N-концевой спирали и две в мотиве спираль-петля-спираль, могут служить шарнирами, вокруг которых вращаются цепи, чтобы еще больше открыть путь к каталитическому сайту и увеличить активную активность. сайт. [10]
Люцифераза динофлагеллят способна излучать свет благодаря взаимодействию со своим субстратом ( люциферином ) и люциферин-связывающим белком (LBP) в сцинтиллона органелле , обнаруженной у динофлагеллят. [10] Люцифераза действует аналогично люциферину и LBP, излучая свет, но каждый компонент функционирует при разном pH. Люцифераза и ее домены не активны при pH 8, но они чрезвычайно активны при оптимальном pH 6,3, тогда как LBP связывает люциферин при pH 8 и высвобождает его при pH 6,3. [10] Следовательно, люциферин высвобождается для реакции с активной люциферазой только тогда, когда сцинтиллон подкисляется до pH 6,3. Следовательно, чтобы снизить pH, потенциалзависимые в сцинтиллонной мембране открываются каналы, позволяющие проникнуть протонам из вакуоли , обладающей потенциалом действия, возникающим в результате механической стимуляции. [10] Следовательно, можно видеть, что потенциал действия в вакуолярной мембране приводит к закислению, а это, в свою очередь, позволяет высвободить люциферин для реакции с люциферазой в сцинтиллоне, вызывая вспышку синего света.
Механизм реакции
[ редактировать ]Все люциферазы классифицируются как оксидоредуктазы ( EC 1.13.12.- ), что означает, что они действуют на одиночных доноров с включением молекулярного кислорода. Поскольку люциферазы происходят из многих различных семейств белков , которые не связаны между собой, не существует объединяющего механизма, поскольку любой механизм зависит от комбинации люциферазы и люциферина. Однако было показано, что все охарактеризованные на сегодняшний день реакции люциферазы-люциферина требуют молекулярного кислорода на определенной стадии .
Бактериальная люцифераза
[ редактировать ]Реакция, катализируемая бактериальной люциферазой, также является окислительным процессом:
- FMNH 2 + O 2 + RCHO → FMN + RCOOH + H 2 O + свет
В ходе реакции молекулярный кислород окисляет флавинмононуклеотид и длинноцепочечный алифатический альдегид до алифатической карбоновой кислоты . В результате реакции образуется возбужденный промежуточный продукт гидроксифлавина, который дегидратируется до продукта FMN с испусканием сине-зеленого света. [12]
Почти вся энергия, вложенная в реакцию, преобразуется в свет. Реакция 80% [13] до 90% [14] эффективный. Для сравнения, лампа накаливания только около 10% своей энергии . преобразует в свет [15] а светодиод мощностью 150 люмен на ватт (лм/Вт) преобразует 20% входной энергии в видимый свет. [14]
Приложения
[ редактировать ]Люциферазы можно производить в лаборатории с помощью генной инженерии для ряда целей. люциферазы Гены можно синтезировать и вставлять в организмы или трансфицировать в клетки. По состоянию на 2002 год мыши , тутовые черви и картофель — это лишь некоторые из организмов, которые уже были созданы для производства этого белка. [16]
В люциферазной реакции свет излучается, когда люцифераза действует на соответствующий люциферина субстрат . Эмиссия фотонов может быть обнаружена с помощью светочувствительного прибора, такого как люминометр или оптический микроскоп с ПЗС-камерой . Это позволяет наблюдать биологические процессы. [17] минимальна Поскольку для биолюминесценции люциферазы не требуется световое возбуждение, автофлуоресценция и, следовательно, биолюминесцентный сигнал практически не имеет фона. [18] Таким образом, даже 0,02 пг можно точно измерить с помощью стандартного сцинтилляционного счетчика . [19]
В биологических исследованиях люцифераза обычно используется в качестве репортера для оценки транскрипционной активности в клетках, трансфицированных генетической конструкцией, содержащей ген люциферазы под контролем промотора . интересующего [20] Кроме того, пролюминесцентные молекулы, которые превращаются в люциферин при активности определенного фермента, можно использовать для обнаружения активности фермента в связанных или двухэтапных анализах люциферазы. использовались для обнаружения активности каспаз и активности цитохрома P450 . Такие субстраты , среди прочего, [17] [20]
Люциферазу также можно использовать для определения уровня клеточного АТФ в анализах жизнеспособности клеток или анализах киназной активности. [20] [21] Люцифераза может действовать как сенсорный белок АТФ посредством биотинилирования . Биотинилирование иммобилизует люциферазу на поверхности клетки путем связывания с комплексом стрептавидин - биотин . Это позволяет люциферазе обнаруживать отток АТФ из клетки и эффективно отображать высвобождение АТФ в реальном времени посредством биолюминесценции. [22] Люциферазу можно дополнительно сделать более чувствительной к обнаружению АТФ за счет увеличения интенсивности люминесценции за счет изменения определенных аминокислотных остатков в последовательности белка. [23]
Визуализация всего организма (называемая in vivo , если она неповреждена, или иначе называемая визуализацией ex vivo , например, живой, но эксплантированной ткани) является мощным методом изучения популяций клеток в живых растениях или животных, таких как мыши. [24] Различные типы клеток (например, стволовые клетки костного мозга, Т-клетки) могут быть сконструированы для экспрессии люциферазы, что позволяет их неинвазивную визуализацию внутри живого животного с использованием чувствительной камеры устройства с зарядовой парой ( CCD-камеры ). Этот метод был использован. следить за онкогенезом и реакцией опухолей на лечение на животных моделях. [25] [26] Однако факторы окружающей среды и терапевтические вмешательства могут вызывать некоторые несоответствия между опухолевой нагрузкой и интенсивностью биолюминесценции в отношении изменений пролиферативной активности. Интенсивность сигнала, измеренного с помощью визуализации in vivo, может зависеть от различных факторов, таких как абсорбция D -люциферина через брюшину, кровоток, проницаемость клеточных мембран, наличие кофакторов, внутриклеточный pH и прозрачность вышележащей ткани, а также от количество люциферазы. [27]
Люцифераза — термочувствительный белок, который используется в исследованиях по денатурации белков , проверке защитных способностей белков теплового шока . Возможности использования люциферазы продолжают расширяться. [28]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ли Джей (28 февраля 2014 г.). «История биолюминесценции» . photobiology.info . Архивировано из оригинала 29 марта 2015 года.
- ^ Ли Джей (сентябрь 2008 г.). «Биолюминесценция: первые 3000 лет (обзор)» . Журнал Сибирского федерального университета. Биология . 1 (3): 194–205. дои : 10.17516/1997-1389-0264 .
- ^ Бреннан К.К., Орнелас М.Ю., Яо З.В., Прешер Дж.А. (август 2021 г.). «Многокомпонентная биолюминесцентная визуализация с нафтиламинолюциферинами» . ХимБиоХим . 22 (16): 2650–2654. дои : 10.1002/cbic.202100202 . ПМЦ 8496354 . ПМИД 34139065 .
- ^ «X-Сияющая термостабильная люцифераза» .
- ^ Гулд С.Дж., Субрамани С. (ноябрь 1988 г.). «Люцифераза светлячка как инструмент молекулярной и клеточной биологии». Аналитическая биохимия . 175 (1): 5–13. дои : 10.1016/0003-2697(88)90353-3 . ПМИД 3072883 .
- ^ Стегенс Дж. П., Мин К. Л., Берненго Дж. К. (ноябрь 1998 г.). «Люцифераза светлячка имеет два сайта связывания нуклеотидов: влияние нуклеозидмонофосфата и КоА на спектры светоизлучения» . Биохимический журнал . 336 (Часть 1): 109–13. дои : 10.1042/bj3360109 . ПМК 1219848 . ПМИД 9806891 .
- ^ Шимомура О (1985). «Биолюминесценция в море: фотопротеиновые системы». Симпозиумы Общества экспериментальной биологии . 39 : 351–72. ПМИД 2871634 .
- ^ Ха С., Ли Дж., Юнг Э., Ким С.К., Кан Джи, Ли Дж., Ким Ю.В., Сун Ю.К., Кан Х.К., Пак Д. (июнь 2009 г.). «Клеточная система скрининга веществ, способствующих росту волос». Архив дерматологических исследований . 301 (5): 381–85. дои : 10.1007/s00403-009-0931-0 . ПМИД 19277688 . S2CID 23916875 .
- ^ Болдуин Т.О., Кристофер Дж.А., Раушел Ф.М., Синклер Дж.Ф., Зиглер М.М., Фишер А.Дж., Рэймент I (декабрь 1995 г.). «Структура бактериальной люциферазы». Современное мнение в области структурной биологии . 5 (6): 798–809. дои : 10.1016/0959-440x(95)80014-x . ПМИД 8749369 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я Шульц Л.В., Лю Л., Цегельски М., Гастингс Дж.В. (февраль 2005 г.). «Кристаллическая структура рН-регулируемой люциферазы, катализирующей биолюминесцентное окисление открытого тетрапиррола» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (5): 1378–83. Бибкод : 2005PNAS..102.1378S . дои : 10.1073/pnas.0409335102 . ПМК 547824 . ПМИД 15665092 .
- ^ Окамото ОК, Лю Л., Робертсон Д.Л., Гастингс Дж.В. (декабрь 2001 г.). «Члены семейства генов динофлагеллятлюциферазы различаются по синонимичным уровням замен». Биохимия . 40 (51): 15862–68. CiteSeerX 10.1.1.494.3563 . дои : 10.1021/bi011651q . ПМИД 11747464 .
- ^ Фишер А.Дж., Томпсон Т.Б., Тоден Дж.Б., Болдуин Т.О., Рэймент I (сентябрь 1996 г.). «Кристаллическая структура бактериальной люциферазы с разрешением 1,5 А в условиях низкого содержания соли» . Журнал биологической химии . 271 (36): 21956–68. дои : 10.1074/jbc.271.36.21956 . ПМИД 8703001 .
- ^ Уилсон Э. (18 января 1999 г.). "Что это за штука?" . Новости химии и техники . 77 (3): 65. doi : 10.1021/cen-v077n003.p065 .
- ^ Jump up to: а б Книветт В. (2009). «Освещая путь» . ЭЭ Таймс . Архивировано из оригинала 5 октября 2012 г. Проверено 18 сентября 2011 г.
- ^ General Electric TP-110, с. 23, табл.
- ^ Contag CH, Бахманн М.Х. (2002). «Достижения в области биолюминесцентной визуализации экспрессии генов in vivo». Ежегодный обзор биомедицинской инженерии . 4 : 235–60. doi : 10.1146/annurev.bioeng.4.111901.093336 . ПМИД 12117758 .
- ^ Jump up to: а б «Введение в биолюминесцентные анализы» . Корпорация Промега. Архивировано из оригинала 14 августа 2010 г. Проверено 7 марта 2009 г.
- ^ Уильямс Т.М., Берлейн Дж.Э., Огден С., Крика Л.Дж., Кант Дж.А. (январь 1989 г.). «Преимущества люциферазы светлячка как репортерного гена: применение к промотору гена интерлейкина-2». Аналитическая биохимия . 176 (1): 28–32. дои : 10.1016/0003-2697(89)90267-4 . ПМИД 2785354 .
- ^ Нгуен В.Т., Моранж М., Бенсауде О. (июнь 1988 г.). «Анализ люминесценции люциферазы светлячков с использованием сцинтилляционных счетчиков для количественного анализа в трансфицированных клетках млекопитающих». Аналитическая биохимия . 171 (2): 404–08. дои : 10.1016/0003-2697(88)90505-2 . ПМИД 3407940 .
- ^ Jump up to: а б с Фан Ф, Вуд КВ (февраль 2007 г.). «Биолюминесцентные анализы для высокопроизводительного скрининга». АНАЛИЗА и технологии разработки лекарств . 5 (1): 127–36. дои : 10.1089/adt.2006.053 . ПМИД 17355205 .
- ^ Мейзенхаймер П.Л., О'Брайен М.А., Кали Дж.Дж. (сентябрь 2008 г.). «Люминогенные ферментные субстраты: основа новой парадигмы в разработке анализов» (PDF) . Заметки Промеги . 100 : 22–26. Архивировано из оригинала (PDF) 6 марта 2009 г. Проверено 1 октября 2008 г.
- ^ Накамура М., Ми М., Фунабаши Х., Ямамото К., Андо Дж., Кобатаке Э. (май 2006 г.). «Обнаружение АТФ, локализованного на клеточной поверхности, с помощью иммобилизованной люциферазы светлячка». Аналитическая биохимия . 352 (1): 61–67. дои : 10.1016/j.ab.2006.02.019 . ПМИД 16564487 .
- ^ Фуджи Х., Нода К., Асами Ю., Курода А., Саката М., Токида А. (июль 2007 г.). «Увеличение интенсивности биолюминесценции люциферазы светлячков с помощью генетической модификации». Аналитическая биохимия . 366 (2): 131–36. дои : 10.1016/j.ab.2007.04.018 . ПМИД 17540326 .
- ^ Грир Л.Ф., Салай А.А. (2002). «Визуализация излучения света при экспрессии люцифераз в живых клетках и организмах: обзор» . Люминесценция . 17 (1): 43–74. дои : 10.1002/bio.676 . ПМИД 11816060 .
- ^ Лионс С.К., Мейвиссен Р., Кримпенфорт П., Бернс А. (ноябрь 2003 г.). «Создание условного репортера, который позволяет получать биолюминесцентную визуализацию Cre/loxP-зависимого онкогенеза у мышей» . Исследования рака . 63 (21): 7042–46. ПМИД 14612492 .
- ^ Бехер О.Дж., Голландский EC (апрель 2006 г.). «Генетически-инженерные модели имеют преимущества перед ксенотрансплантатами для доклинических исследований» . Исследования рака . 66 (7): 3355–58, обсуждение 3358–59. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-05-3827 . ПМИД 16585152 .
- ^ Иноуэ Ю, Тодзё А, Секине Р, Сода Ю, Кобаяши С, Номура А, Идзава К, Китамура Т, Окубо Т, Отомо К (май 2006 г.). «Валидация in vitro биолюминесцентного мониторинга прогрессирования заболевания и терапевтического ответа на моделях лейкемии». Европейский журнал ядерной медицины и молекулярной визуализации . 33 (5): 557–65. дои : 10.1007/s00259-005-0048-4 . ПМИД 16501974 . S2CID 40630078 .
- ^ Масуд Т.Ф., Полмуруган Р., Де А., Рэй П., Гамбхир С.С. (февраль 2007 г.). «Визуализация репортерных генов белок-белковых взаимодействий у живых субъектов» . Современное мнение в области биотехнологии . 18 (1): 31–37. doi : 10.1016/j.copbio.2007.01.007 . ПМЦ 4141564 . ПМИД 17254764 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]
СМИ, связанные с люциферазой, на Викискладе? - Обзор всей структурной информации, доступной в PDB для UniProt : P08659 (люциферин-4-монооксигеназа) в PDBe-KB .
- Триммер Б, Заяс Р, Кази С, Льюис С, Мишель Т, Дудзински Д, Април Дж, Лагас С (28 июня 2001 г.). «Светлячки и оксид азота» . Университет Тафтса . Проверено 2 октября 2008 г.
- «Тенденции развития репортерных генов» . reportergene.com . Проверено 7 марта 2009 г.
- «BL Web: типы люциферина» . Веб-страница биолюминесценции . Калифорнийский университет, Санта-Барбара . Проверено 7 марта 2009 г.
- «Руководство по протоколам и приложениям репортеров биолюминесценции» . Протоколы и приложения . Корпорация Промега. Архивировано из оригинала 8 августа 2010 г. Проверено 7 марта 2009 г.
- «BL Web: типы люциферина» . ISCID Энциклопедия науки и философии . ИСКИД. Архивировано из оригинала 21 сентября 2012 г. Проверено 20 апреля 2010 г.
- Гудселл Д. «Люцифераза» . Молекула месяца . Банк данных по белкам. Архивировано из оригинала 19 октября 2015 г. Проверено 15 января 2013 г.
