Внутриклеточный pH

Внутриклеточный pH ( pH _i ) является мерой кислотности или основности ( т. е. pH ) внутриклеточной жидкости . pH _i играет решающую роль в мембранном транспорте и других внутриклеточных процессах. В среде с неправильным pH _i функции биологических клеток могут быть нарушены. ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} Таким образом, pH _i тщательно регулируется, чтобы обеспечить правильное функционирование клеток, контролируемый рост клеток и нормальные клеточные процессы. ^{[ 3 ]} Механизмами, регулирующими pH _i, обычно считают переносчики плазматической мембраны , из которых существуют два основных типа — зависимые и независимые от концентрации бикарбоната ( HCO ⁻
₃ ). Физиологически нормальный внутриклеточный pH чаще всего составляет от 7,0 до 7,4, хотя между тканями существуют различия (например, скелетные мышцы млекопитающих обычно имеют pH _i 6,8–7,1). ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]} Существует также вариация pH в разных органеллах , которая может варьироваться от 4,5 до 8,0. ^{[ 6 ]}^{[ 7 ]} pH _i можно измерить разными способами. ^{[ 3 ]}^{[ 8 ]}

Гомеостаз

Внутриклеточный pH обычно ниже внеклеточного pH из-за более низких концентраций HCO _{3 .}⁻. ^{[ 9 ]} Повышение внеклеточного (например, сывороточного ) парциального давления углекислого газа ( pCO ₂ ) выше 45 мм рт. ст. приводит к образованию угольной кислоты , которая вызывает снижение pH _i по мере ее диссоциации : ^{[ 10 ]}

Н ₂ О + СО ₂ ⇌ Н ₂ СО ₃ ⇌ Н ⁺ + _HCO3^–

Поскольку биологические клетки содержат жидкость, которая может действовать как буфер, pH _i можно достаточно хорошо поддерживать в определенном диапазоне. ^{[ 11 ]} Клетки соответствующим образом корректируют свой pH _i при повышении кислотности или основности, обычно с помощью CO ₂ или HCO _3.^– сенсоры, присутствующие в мембране клетки. ^{[ 3 ]} Эти сенсоры могут соответственно позволять H+ проходить через клеточную мембрану, позволяя в этом отношении pH _i быть взаимосвязанным с внеклеточным pH. ^{[ 12 ]}

Основные внутриклеточные буферные системы включают белки или фосфаты. Поскольку белки имеют кислые и основные области, они могут служить как донорами, так и акцепторами протонов для поддержания относительно стабильного внутриклеточного pH. В случае фосфатного буфера значительные количества слабой кислоты и сопряженного слабого основания (H ₂ PO ₄^– и ГПО ₄^2–) может соответственно принимать или отдавать протоны, чтобы сохранить внутриклеточный pH: ^{[ 13 ]}^{[ 14 ]}

ОЙ ^– + Н ₂ ПО ₄^– ⇌ Н ₂ О + HPO ₄^2–

ЧАС ⁺ + ГПО ₄^2– ⇌ Н ₂ ПО ₄^–

В органеллах

Уровень pH внутри конкретной органеллы зависит от ее конкретной функции.

Например, лизосомы имеют относительно низкий pH — 4,5. ^{[ 6 ]} Кроме того, методы флуоресцентной микроскопии показали, что фагосомы также имеют относительно низкий внутренний pH. ^{[ 15 ]} Поскольку обе эти органеллы представляют собой деградирующие органеллы, которые поглощают и расщепляют другие вещества, им требуется высокая внутренняя кислотность, чтобы успешно выполнять свою функцию. ^{[ 15 ]}

В отличие от относительно низкого pH внутри лизосом и фагосом, митохондриальный матрикс имеет внутренний pH около 8,0, что примерно на 0,9 единицы pH выше, чем внутри межмембранного пространства. ^{[ 6 ]}^{[ 16 ]} Поскольку окислительное фосфорилирование должно происходить внутри митохондрий, это несоответствие pH необходимо для создания градиента на мембране. Этот мембранный потенциал в конечном итоге позволяет митохондриям генерировать большие количества АТФ. ^{[ 17 ]}

Измерение

Существует несколько распространенных способов измерения внутриклеточного pH (pH _i ), в том числе с помощью микроэлектрода, красителя, чувствительного к pH, или методов ядерного магнитного резонанса. ^{[ 18 ]}^{[ 19 ]} Для измерения pH внутри органелл можно использовать метод с использованием pH-чувствительных зеленых флуоресцентных белков (GFP). ^{[ 20 ]}

В целом все три метода имеют свои преимущества и недостатки. Использование красителей, пожалуй, является самым простым и достаточно точным методом, тогда как ЯМР представляет собой проблему, связанную с относительно меньшей точностью. ^{[ 18 ]} Кроме того, использование микроэлектрода может быть затруднительно в ситуациях, когда клетки слишком малы или целостность клеточной мембраны должна оставаться нетронутой. ^{[ 19 ]} GFP уникальны тем, что обеспечивают неинвазивный способ определения pH внутри различных органелл, однако этот метод не является наиболее точным в количественном отношении способом определения pH. ^{[ 21 ]}

Микроэлектрод

Микроэлектродный метод измерения pH _i заключается в помещении очень маленького электрода в цитозоль клетки путем проделывания очень маленького отверстия в плазматической мембране клетки. ^{[ 19 ]} Поскольку внутри микроэлектрода имеется жидкость с высокой концентрацией H+ по сравнению с внешней стороной электрода, существует потенциал, создаваемый из-за несоответствия pH внутри и снаружи электрода. ^{[ 18 ]}^{[ 19 ]} По этой разности напряжений и заданному pH жидкости внутри электрода можно определить внутриклеточный pH (pH _i ) интересующей клетки. ^{[ 19 ]}

Флуоресцентная спектроскопия

Другой способ измерения внутриклеточного pH (pH _i ) — использование красителей, чувствительных к pH и по-разному флуоресцирующих при различных значениях pH. ^{[ 15 ]}^{[ 22 ]} Этот метод, в котором используется флуоресцентная спектроскопия, заключается в добавлении специального красителя в цитозоль клетки. ^{[ 18 ]}^{[ 19 ]} Возбуждая краситель в клетке энергией света и измеряя длину волны света, испускаемого фотоном, когда он возвращается в исходное энергетическое состояние, можно определить тип присутствующего красителя и связать его с внутриклеточным pH данного вещества. клетка. ^{[ 18 ]}^{[ 19 ]}

Ядерный магнитный резонанс

Помимо использования pH-чувствительных электродов и красителей для измерения pH _i можно также использовать спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР) _{, для количественного определения pH i} . ^{[ 19 ]} ЯМР, как правило, раскрывает информацию о внутренней части клетки, помещая клетку в среду с мощным магнитным полем. ^{[ 18 ]}^{[ 19 ]} По соотношению концентраций протонированных и депротонированных форм фосфатных соединений в данной клетке можно определить внутренний pH клетки. ^{[ 18 ]} Кроме того, ЯМР также может быть использован для выявления присутствия внутриклеточного натрия, что также может предоставить информацию о pH _i . ^{[ 23 ]}

С помощью ЯМР-спектроскопии установлено, что лимфоциты поддерживают постоянный внутренний pH 7,17±0,06, хотя, как и во всех клетках, внутриклеточный pH изменяется в том же направлении, что и внеклеточный pH. ^{[ 24 ]}

pH-чувствительные GFP

Для определения pH внутри органелл часто используются pH-чувствительные GFP как часть неинвазивного и эффективного метода. ^{[ 20 ]} Используя кДНК в качестве матрицы вместе с соответствующими праймерами, ген GFP можно экспрессировать в цитозоле, а полученные белки могут воздействовать на определенные области внутри клетки, такие как митохондрии, аппарат Гольджи, цитоплазма и эндоплазматический ретикулум. ^{[ 21 ]} Если в этих экспериментах используются определенные мутанты GFP, которые очень чувствительны к pH во внутриклеточной среде, относительное количество образующейся флуоресценции может выявить приблизительный уровень pH окружающей среды. ^{[ 21 ]}^{[ 25 ]}

Ссылки

^ Харгинди, С; Станчу, Д; Девеса, Дж; Альфарук, К; Кардоне, РА; Поло Ороско, доктор юридических наук; Девеса, П; Раух, К; Орив, Г; Анитуа, Э; Роджер, С; Решкин С.Ю. (апрель 2017 г.). «Клеточное закисление как новый подход к лечению рака, а также к пониманию и терапии нейродегенеративных заболеваний» . Семинары по биологии рака . 43 : 157–179. doi : 10.1016/j.semcancer.2017.02.003 . ПМИД 28193528 .
^ Флинк М., Крамер С.Х., Педерсен С.Ф. (июль 2018 г.). «Роль pH в контроле пролиферации клеток». Акта Физиологика . 223 (3): e13068. дои : 10.1111/apha.13068 . ПМИД 29575508 . S2CID 4874638 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Бор В.Ф. (декабрь 2004 г.). «Регуляция внутриклеточного pH». Достижения в области физиологического образования . 28 (1–4): 160–79. дои : 10.1152/advan.00045.2004 . ПМИД 15545345 . S2CID 13242391 .
^ Брэндис К. «2.6 Регуляция внутриклеточной концентрации ионов водорода» . Кислотно-щелочная физиология . Образовательный сайт по анестезиологии.
^ Мадшус И.Х. (февраль 1988 г.). «Регуляция внутриклеточного pH в эукариотических клетках» . Биохимический журнал . 250 (1): 1–8. дои : 10.1042/bj2500001 . ПМЦ 1148806 . ПМИД 2965576 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Асокан А., Чо MJ (апрель 2002 г.). «Использование внутриклеточных градиентов pH при клеточной доставке макромолекул». Журнал фармацевтических наук . 91 (4): 903–13. дои : 10.1002/jps.10095 . ПМИД 11948528 .
^ Прокш Э (сентябрь 2018 г.). «РН в природе, человеке и коже» . Журнал дерматологии . 45 (9): 1044–1052. дои : 10.1111/1346-8138.14489 . ПМИД 29863755 .
^ Демут С., Варонье Дж., Жоссен В., Эйбл Р., Эйбл Д. (май 2016 г.). «Новые зонды для измерения pH и растворенного кислорода в культурах от миллилитров до настольных масштабов». Прикладная микробиология и биотехнология . 100 (9): 3853–63. дои : 10.1007/s00253-016-7412-0 . hdl : 11475/2259 . ПМИД 26995606 . S2CID 8434413 .
^ Флинк М., Крамер С.Х., Педерсен С.Ф. (июль 2018 г.). «Роль pH в контроле пролиферации клеток». Акта Физиол (Oxf) . 223 (3): e13068. дои : 10.1111/apha.13068 . ПМИД 29575508 . S2CID 4874638 . ^{[ нужна проверка ]}
^ Флинк М., Крамер С.Х., Педерсен С.Ф. (июль 2018 г.). «Роль pH в контроле пролиферации клеток». Акта Физиол (Oxf) . 223 (3): e13068. дои : 10.1111/apha.13068. ПМИД 29575508.
^ Слончевски Дж.Л., Фудзисава М., Допсон М., Крулвич Т.А. (2009). «Измерение цитоплазматического pH и гомеостаз у бактерий и архей». Достижения микробной физиологии . 55 : 1–79, 317. doi : 10.1016/S0065-2911(09)05501-5 . ISBN 9780123747907 . ПМИД 19573695 .
^ Дженсен ФБ (ноябрь 2004 г.). «РН эритроцитов, эффект Бора и другие явления, связанные с оксигенацией, в транспорте O2 и CO2 в крови». Acta Physiologica Scandinavica . 182 (3): 215–27. дои : 10.1111/j.1365-201X.2004.01361.x . ПМИД 15491402 .
^ Букаллил М.Дж. «Кислотно-щелочное состояние: pH крови – 3 – Механизмы регулирования» . Список лекций и учебных заметок . Кафедра анестезии Сиднейского университета в Наффилде . Проверено 28 мая 2019 г.
^ Бертон РФ (апрель 1978 г.). «Внутриклеточная буферизация». Физиология дыхания . 33 (1): 51–8. дои : 10.1016/0034-5687(78)90083-X . ПМИД 27854 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Нуньес П., Гвидо Д., Деморекс Н. (декабрь 2015 г.). «Измерение pH фагосом с помощью ратиометрической флуоресцентной микроскопии» . Журнал визуализированных экспериментов (106): e53402. дои : 10.3791/53402 . ПМЦ 4692782 . ПМИД 26710109 .
^ Порчелли А.М., Гелли А., Занна С., Пинтон П., Риццуто Р., Руголо М. (январь 2005 г.). «Разница pH на внешней митохондриальной мембране, измеренная с помощью мутанта зеленого флуоресцентного белка». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 326 (4): 799–804. дои : 10.1016/j.bbrc.2004.11.105 . ПМИД 15607740 .
^ Альбертс Б., Джонсон А., Льюис Дж. и др. (2002). «Митохондрия» . Молекулярная биология клетки (4-е изд.). Нью-Йорк: Garland Science.
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г Роос А., Бор В.Ф. (апрель 1981 г.). «Внутриклеточный pH». Физиологические обзоры . 61 (2): 296–434. дои : 10.1152/physrev.1981.61.2.296 . ПМИД 7012859 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я Луазель Ф.Б., Кейси-младший (2010). «Измерение внутриклеточного pH». Мембранные транспортеры в открытии и разработке лекарств . Методы молекулярной биологии. Том. 637. стр. 311–31. дои : 10.1007/978-1-60761-700-6_17 . ISBN 978-1-60761-699-3 . ПМИД 20419443 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Робертс Т.М., Рудольф Ф., Мейер А., Пелло Р., Уайтхед Э., Панке С., Хелд М. (май 2018 г.). «Исправление: идентификация и характеристика pH-стабильного GFP» . Научные отчеты . 8 : 46976. Бибкод : 2018NatSR...846976R . дои : 10.1038/srep46976 . ПМЦ 5956236 . ПМИД 29769631 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Книн М., Фаринас Дж., Ли Ю., Веркман А.С. (март 1998 г.). «Зеленый флуоресцентный белок как неинвазивный внутриклеточный индикатор pH» . Биофизический журнал . 74 (3): 1591–9. Бибкод : 1998BpJ....74.1591K . дои : 10.1016/S0006-3495(98)77870-1 . ПМК 1299504 . ПМИД 9512054 .
^ Шпехт Э.А., Бразельманн Э., Палмер А.Е. (февраль 2017 г.). «Критический и сравнительный обзор флуоресцентных инструментов для визуализации живых клеток». Ежегодный обзор физиологии . 79 : 93–117. doi : 10.1146/annurev-psyol-022516-034055 . ПМИД 27860833 .
^ Элиав У, Навон Дж (февраль 2016 г.). «ЯМР/МРТ натрия для анизотропных систем». ЯМР в биомедицине . 29 (2): 144–52. дои : 10.1002/nbm.3331 . ПМИД 26105084 . S2CID 29964258 .
^ Дойч С., Тейлор Дж.С., Уилсон Д.Ф. (декабрь 1982 г.). «Регуляция внутриклеточного pH лимфоцитами периферической крови человека, измеренная с помощью ЯМР 19F» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 79 (24): 7944–8. Бибкод : 1982PNAS...79.7944D . дои : 10.1073/pnas.79.24.7944 . ПМЦ 347466 . ПМИД 6961462 .
^ Риццуто Р., Брини М., Пиццо П., Мурджа М., Поццан Т. (июнь 1995 г.). «Химерный зеленый флуоресцентный белок как инструмент визуализации субклеточных органелл в живых клетках» . Современная биология . 5 (6): 635–42. дои : 10.1016/s0960-9822(95)00128-x . ПМИД 7552174 . S2CID 13970185 .

[1] Харгинди, С; Станчу, Д; Девеса, Дж; Альфарук, К; Кардоне, РА; Поло Ороско, доктор юридических наук; Девеса, П; Раух, К; Орив, Г; Анитуа, Э; Роджер, С; Решкин С.Ю. (апрель 2017 г.). «Клеточное закисление как новый подход к лечению рака, а также к пониманию и терапии нейродегенеративных заболеваний» . Семинары по биологии рака . 43 : 157–179. doi : 10.1016/j.semcancer.2017.02.003 . ПМИД 28193528 .

[2] Флинк М., Крамер С.Х., Педерсен С.Ф. (июль 2018 г.). «Роль pH в контроле пролиферации клеток». Акта Физиологика . 223 (3): e13068. дои : 10.1111/apha.13068 . ПМИД 29575508 . S2CID 4874638 .

[:0-3] Перейти обратно: ^а ^б ^с Бор В.Ф. (декабрь 2004 г.). «Регуляция внутриклеточного pH». Достижения в области физиологического образования . 28 (1–4): 160–79. дои : 10.1152/advan.00045.2004 . ПМИД 15545345 . S2CID 13242391 .

[4] Брэндис К. «2.6 Регуляция внутриклеточной концентрации ионов водорода» . Кислотно-щелочная физиология . Образовательный сайт по анестезиологии.

[5] Мадшус И.Х. (февраль 1988 г.). «Регуляция внутриклеточного pH в эукариотических клетках» . Биохимический журнал . 250 (1): 1–8. дои : 10.1042/bj2500001 . ПМЦ 1148806 . ПМИД 2965576 .

[:2-6] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Асокан А., Чо MJ (апрель 2002 г.). «Использование внутриклеточных градиентов pH при клеточной доставке макромолекул». Журнал фармацевтических наук . 91 (4): 903–13. дои : 10.1002/jps.10095 . ПМИД 11948528 .

[7] Прокш Э (сентябрь 2018 г.). «РН в природе, человеке и коже» . Журнал дерматологии . 45 (9): 1044–1052. дои : 10.1111/1346-8138.14489 . ПМИД 29863755 .

[8] Демут С., Варонье Дж., Жоссен В., Эйбл Р., Эйбл Д. (май 2016 г.). «Новые зонды для измерения pH и растворенного кислорода в культурах от миллилитров до настольных масштабов». Прикладная микробиология и биотехнология . 100 (9): 3853–63. дои : 10.1007/s00253-016-7412-0 . hdl : 11475/2259 . ПМИД 26995606 . S2CID 8434413 .

[9] Флинк М., Крамер С.Х., Педерсен С.Ф. (июль 2018 г.). «Роль pH в контроле пролиферации клеток». Акта Физиол (Oxf) . 223 (3): e13068. дои : 10.1111/apha.13068 . ПМИД 29575508 . S2CID 4874638 . ^{[ нужна проверка ]}

[10] Флинк М., Крамер С.Х., Педерсен С.Ф. (июль 2018 г.). «Роль pH в контроле пролиферации клеток». Акта Физиол (Oxf) . 223 (3): e13068. дои : 10.1111/apha.13068. ПМИД 29575508.

[11] Слончевски Дж.Л., Фудзисава М., Допсон М., Крулвич Т.А. (2009). «Измерение цитоплазматического pH и гомеостаз у бактерий и архей». Достижения микробной физиологии . 55 : 1–79, 317. doi : 10.1016/S0065-2911(09)05501-5 . ISBN 9780123747907 . ПМИД 19573695 .

[12] Дженсен ФБ (ноябрь 2004 г.). «РН эритроцитов, эффект Бора и другие явления, связанные с оксигенацией, в транспорте O2 и CO2 в крови». Acta Physiologica Scandinavica . 182 (3): 215–27. дои : 10.1111/j.1365-201X.2004.01361.x . ПМИД 15491402 .

[13] Букаллил М.Дж. «Кислотно-щелочное состояние: pH крови – 3 – Механизмы регулирования» . Список лекций и учебных заметок . Кафедра анестезии Сиднейского университета в Наффилде . Проверено 28 мая 2019 г.

[14] Бертон РФ (апрель 1978 г.). «Внутриклеточная буферизация». Физиология дыхания . 33 (1): 51–8. дои : 10.1016/0034-5687(78)90083-X . ПМИД 27854 .

[:4-15] Перейти обратно: ^а ^б ^с Нуньес П., Гвидо Д., Деморекс Н. (декабрь 2015 г.). «Измерение pH фагосом с помощью ратиометрической флуоресцентной микроскопии» . Журнал визуализированных экспериментов (106): e53402. дои : 10.3791/53402 . ПМЦ 4692782 . ПМИД 26710109 .

[16] Порчелли А.М., Гелли А., Занна С., Пинтон П., Риццуто Р., Руголо М. (январь 2005 г.). «Разница pH на внешней митохондриальной мембране, измеренная с помощью мутанта зеленого флуоресцентного белка». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 326 (4): 799–804. дои : 10.1016/j.bbrc.2004.11.105 . ПМИД 15607740 .

[17] Альбертс Б., Джонсон А., Льюис Дж. и др. (2002). «Митохондрия» . Молекулярная биология клетки (4-е изд.). Нью-Йорк: Garland Science.

[:3-18] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г Роос А., Бор В.Ф. (апрель 1981 г.). «Внутриклеточный pH». Физиологические обзоры . 61 (2): 296–434. дои : 10.1152/physrev.1981.61.2.296 . ПМИД 7012859 .

[:1-19] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я Луазель Ф.Б., Кейси-младший (2010). «Измерение внутриклеточного pH». Мембранные транспортеры в открытии и разработке лекарств . Методы молекулярной биологии. Том. 637. стр. 311–31. дои : 10.1007/978-1-60761-700-6_17 . ISBN 978-1-60761-699-3 . ПМИД 20419443 .

[:5-20] Перейти обратно: ^а ^б Робертс Т.М., Рудольф Ф., Мейер А., Пелло Р., Уайтхед Э., Панке С., Хелд М. (май 2018 г.). «Исправление: идентификация и характеристика pH-стабильного GFP» . Научные отчеты . 8 : 46976. Бибкод : 2018NatSR...846976R . дои : 10.1038/srep46976 . ПМЦ 5956236 . ПМИД 29769631 .

[:6-21] Перейти обратно: ^а ^б ^с Книн М., Фаринас Дж., Ли Ю., Веркман А.С. (март 1998 г.). «Зеленый флуоресцентный белок как неинвазивный внутриклеточный индикатор pH» . Биофизический журнал . 74 (3): 1591–9. Бибкод : 1998BpJ....74.1591K . дои : 10.1016/S0006-3495(98)77870-1 . ПМК 1299504 . ПМИД 9512054 .

[22] Шпехт Э.А., Бразельманн Э., Палмер А.Е. (февраль 2017 г.). «Критический и сравнительный обзор флуоресцентных инструментов для визуализации живых клеток». Ежегодный обзор физиологии . 79 : 93–117. doi : 10.1146/annurev-psyol-022516-034055 . ПМИД 27860833 .

[23] Элиав У, Навон Дж (февраль 2016 г.). «ЯМР/МРТ натрия для анизотропных систем». ЯМР в биомедицине . 29 (2): 144–52. дои : 10.1002/nbm.3331 . ПМИД 26105084 . S2CID 29964258 .

[24] Дойч С., Тейлор Дж.С., Уилсон Д.Ф. (декабрь 1982 г.). «Регуляция внутриклеточного pH лимфоцитами периферической крови человека, измеренная с помощью ЯМР 19F» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 79 (24): 7944–8. Бибкод : 1982PNAS...79.7944D . дои : 10.1073/pnas.79.24.7944 . ПМЦ 347466 . ПМИД 6961462 .

[25] Риццуто Р., Брини М., Пиццо П., Мурджа М., Поццан Т. (июнь 1995 г.). «Химерный зеленый флуоресцентный белок как инструмент визуализации субклеточных органелл в живых клетках» . Современная биология . 5 (6): 635–42. дои : 10.1016/s0960-9822(95)00128-x . ПМИД 7552174 . S2CID 13970185 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

[ 18 ]

[ 19 ]

[ 20 ]

[ 21 ]

[ 22 ]

[ 23 ]

[ 24 ]

[ 25 ]