X-гал
 | |
| Имена | |
|---|---|
| Название ИЮПАК 5-Бром-4-хлор-1H - индол-3-ил β- D -галактопиранозид | |
| Систематическое название ИЮПАК ( 2S , 3R , 4S , 5R , 6R )-2-[(5-бром-4-хлор-1Н - индол-3-ил)окси]-6-(гидроксиметил)оксан-3, 4,5-триол | |
| Идентификаторы | |
3D model ( JSmol ) | |
| ЧЭБИ | |
| ХимическийПаук | |
| Информационная карта ECHA | 100.027.855 |
| МеШ | X-гал |
ПабХим CID | |
| НЕКОТОРЫЙ | |
Панель управления CompTox ( EPA ) | |
| Характеристики | |
| С 14 Н 15 BrClNO 6 | |
| Молярная масса | 408.629 |
Если не указано иное, данные приведены для материалов в стандартном состоянии (при 25 °C [77 °F], 100 кПа). | |
X-гал (также сокращенно BCIG от 5-бром-4-хлор-3-индолил-β- D -галактопиранозид) представляет собой органическое соединение , состоящее из галактозы , связанной с замещенным индолом . Соединение было синтезировано Джеромом Хорвицем и его сотрудниками в 1964 году. [1] Формальное химическое название часто сокращается до менее точных, но и менее громоздких фраз, таких как бромхлориндоксилгалактозид. X из индоксила может быть источником X в сокращении X-гал. X-gal часто используется в молекулярной биологии для проверки наличия фермента β-галактозидазы вместо его обычной мишени β-галактозида. Он также используется для обнаружения активности этого фермента в гистохимии и бактериологии . X-gal является одним из многих индоксилгликозидов и сложных эфиров, которые образуют нерастворимые соединения синего цвета, подобные красителю индиго . в результате ферментативно-катализируемого гидролиза [2]
Менее часто используемое, но очень похожее ( хиральное ) соединение — X-. -гал (Xαгал, X-альфа-гал), или 5-бром-4-хлор-3-индолил-α-D-галактопиранозид, который гидролизуется α-галактозидазой ( КФ 3.2.1.22) вместо β-галактозидазы ( ЕС 3.2.1.23). [3] [4]
Использование
[ редактировать ]X-гал является аналогом лактозы , и поэтому может гидролизоваться ферментом β-галактозидазой который расщепляет β- гликозидную связь в D -лактозе. X-gal при расщеплении β-галактозидазой дает галактозу и 5-бром-4-хлор-3-гидроксииндол- 1 . Последний затем самопроизвольно димеризуется и окисляется до 5,5'-дибром-4,4'-дихлориндиго - 2 , интенсивно-синего нерастворимого продукта. X-gal сам по себе бесцветен, поэтому наличие продукта синего цвета можно использовать в качестве теста на наличие активной β-галактозидазы. Это также позволяет бактериальную β-галактозидазу (так называемую lacZ использовать ) в качестве репортера в различных приложениях. [5]
Аналогичным образом, Xαgal используется в качестве репортерного соединения для α-галактозидазы (например, Mel1 в дрожжах). [6]
Реакция
[ редактировать ]
Клонирование
[ редактировать ]При клонировании генов X-gal используется в качестве визуального индикатора того, экспрессирует ли клетка функциональный фермент β-галактозидазу, в методе, называемом сине-белым скринингом . Этот метод проверки — удобный способ отличить успешный продукт клонирования от других неудачных.
Метод сине-белого скрининга основан на принципе α-комплементации гена β-галактозидазы, при котором фрагмент гена lacZ (lacZα) в плазмиде может дополнять другой мутантный ген lacZ (lacZΔM15) в клетке. Оба гена сами по себе продуцируют нефункциональные пептиды, однако при совместной экспрессии, например, когда плазмида, содержащая lacZα, трансформируется в клетки lacZΔM15 , они образуют функциональную β-галактозидазу. Присутствие активной β-галактозидазы можно обнаружить, когда клетки выращивают на чашках, содержащих X-гал; продукт синего цвета, осаждаемый внутри клеток, приводит к образованию характерных синих колоний. Однако сайт множественного клонирования, где интересующий ген может быть связан с плазмидным вектором, расположен внутри гена lacZα . Таким образом, успешное лигирование разрушает ген lacZα , поэтому также нарушается α-комплементация, и функциональная β-галактозидаза не может образовываться, что приводит к образованию белых колоний. Клетки, содержащие успешно лигированную вставку, можно легко отличить по белому цвету от неудачно лигированных синих клеток. Пример векторов клонирования, используемых для этого теста: pUC19 , pBluescript , pGem-T Vectors, а также требует использования специфических штаммов-хозяев E. coli , таких как DH5α, которые несут мутантный ген lacZΔM15 . Часто пластинка, содержащая X-Gal, также содержит IPTG (изопропил β- D -1-тиогалактопиранозид). ИПТГ – это аналог лактозы по химической структуре. [7] Однако ИПТГ не гидролизуется β-галактозидазой. IPTG используется в качестве индуктора, который связывается с lac-репрессором, высвобождая ДНК и обеспечивая транскрипцию. Таким образом, присутствие IPTG в чашке с агаром увеличивает синтез β-галактозидазы. [8]
Варианты
[ редактировать ]X-gal имеет ряд вариантов, которые представляют собой похожие молекулы с небольшими различиями, служащие в основном для создания сигналов, отличных от синего.
| Короткое имя | Длинное имя | Цвет |
|---|---|---|
| Блю-Гал, Блуо-Гал | 5-Бром-3-индолил β- D -галактопиранозид | Темно-синий [9] |
| Роуз-Гал, Лосось-Гал, Ю-Гал, Ред-Гал | 6-Хлор-3-индолил-β- D -галактопиранозид | Розовый [10] |
| Фиолетовый-β- D -Гал | 5-Йод-3-индолил-β- D -галактопиранозид | Фиолетовый [11] |
| Пурпурный глюкозид, пурпурный-GLC, пурпурный гал | 5-Бром-6-хлор-3-индолил-β- D -глюкопиранозид | Пурпурный [12] |
| Зеленый-β- D -Гал | N-Метилиндолил-β- D -галактопиранозид | Зеленый [13] |
| ПРЕДЕЛ, ПРЕДЕЛ | 4-Метилумбеллиферил β- D -галактопиранозид | флуоресцентный [14] (λ ex = 365, λ em = 455) |
Белково-белковые взаимодействия
[ редактировать ]В двухгибридном анализе β-галактозидаза может использоваться в качестве репортера для идентификации белков, которые взаимодействуют друг с другом. В этом методе библиотеки генома можно проверять на взаимодействие белков с использованием дрожжевой или бактериальной системы. Если происходит успешное взаимодействие между проверяемыми белками, это приводит к связыванию домена активации с промотором. Если промотор связан с геном lacZ , то продукция β-галактозидазы, приводящая к образованию синепигментированных колоний в присутствии X-gal, будет указывать на успешное взаимодействие между белками. [15] Этот метод может быть ограничен проверкой библиотек размером менее 10 6 . [15] Успешное расщепление X-гал также создает заметно неприятный запах из-за улетучивания индола .
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Horwitz JP et al., 1964. Субстраты для цитохимической демонстрации активности ферментов. I. Некоторые замещенные 3-индолил-β- D -гликопиранозиды. Журнал медицинской химии 7: 574-575.
- ^ Кирнан Дж. А. 2007. Индигогенные субстраты для обнаружения и локализации ферментов. Биотехника и гистохимия 82 (2): 73-103.
- ^ «Информация о EC 3.2.1.22 - альфа-галактозидаза - База данных ферментов BRENDA» . www.brenda-enzymes.org . Проверено 31 июля 2023 г.
- ^ «Информация о EC 3.2.1.23 - бета-галактозидаза - База данных ферментов BRENDA» . www.brenda-enzymes.org . Проверено 31 июля 2023 г.
- ^ Сандху, Сардул Сингх (2010). Технология рекомбинантной ДНК . ИК Международный издательский дом. п. 116. ИСБН 978-9380578446 .
- ^ Годдард, Алан; Лэддс, Грэм; Дэйви, Джон (15 января 2005 г.). «Разработка полуколичественного репортера гена альфа-галактозидазы на пластинке для Schizosaccharomyces pombe и его использование для выделения конститутивно активного Mam2» . Дрожжи (Ччестер, Англия) . 22 (1): 31–41. дои : 10.1002/да.1190 . ISSN 0749-503X . ПМИД 15580593 . S2CID 33926866 .
- ^ «ИПТГ-Биолайн» . www.bioline.com . Проверено 15 мая 2018 г.
- ^ «Синее/белое клонирование фрагмента ДНК и анализ β-галактозидазы» (PDF) . Проверено 10 сентября 2023 г.
- ^ «5-Бром-3-индолил-β-D-галактопиранозид» . Проверено 4 февраля 2014 г.
- ^ «Сальмон-Гал – ПабХим» . Проверено 4 февраля 2014 г.
- ^ «Пурпл-бета-Д-Гал — ПабХим» . Проверено 4 февраля 2014 г.
- ^ «5-Бром-6-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозид» . Проверено 4 февраля 2014 г.
- ^ «Зеленая-β-D-Гал – Biotium, Inc» . Проверено 4 февраля 2014 г.
- ^ «4-Метилумбеллиферил β-D-галактопиранозид» . Проверено 4 февраля 2014 г.
- ^ Jump up to: а б Йонг Дж., Рамм Э., Пабо С. (2000). «Бактериальная двухгибридная система селекции для изучения белок-ДНК и белок-белковых взаимодействий» . Proc Natl Acad Sci США . 97 (13): 7382–7. Бибкод : 2000PNAS...97.7382J . дои : 10.1073/pnas.110149297 . ПМК 16554 . ПМИД 10852947 .